유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca2 + 섭취
Summary
이 프락토콜은 성상세포와 뉴런에서 생체 외 및 생체 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징을 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.
Abstract
미토콘드리아 Ca2+는 세포경색 Ca2+ 버퍼링, 에너지 대사 및 세포 신호 변환을 제어하는 데 중요한 역할을 합니다. 미토콘드리아 Ca2+의 과부하는 신경 질환의 신경 변성 및 세포 사멸을 포함한 다양한 병리학 적 조건에 기여합니다. 여기서 우리는 시험관 내 및 생체 내 성상세포 및 뉴런에서 미토콘드리아 Ca2+ 이미징을 위한 분자 접근법을 표적으로 하는 세포 형 특이성 및 미토콘드리아를 제시한다. 미토콘드리아 표적을 유전적으로 인코딩한 DNA 플라스미드(GECIs) GCaMP5G 또는 GCaMP6s(GCaMP5G/6s)와 성상세포 및 뉴런 특이적 프로모터 gfaABC1D 및 CaMKII 및 미토콘드리아 표적 시퀀스(미토콘드리아 표적 시퀀스)를 생성했습니다. 시험관 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징의 경우, 플라스미드는 GCaMP5G/6s를 발현하기 위해 배양된 성상세포 및 뉴런에서 전형되었다. 생체 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징의 경우, 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)를 마우스 뇌에 주입하여 성상세포및 뉴런의 미토콘드리아에서 GCaMP5G/6s를 발현하였다. 우리의 접근 은 성상 세포와 뉴런의 미토콘드리아 Ca2+ 역학을 이미지화하여 세포와 미토콘드리아 Ca2 + 신호 사이의 관계뿐만 아니라 성상 세포 뉴런 상호 작용 사이의 관계를 연구하는 유용한 방법을 제공합니다.
Introduction
미토콘드리아는 동적 세포 세포 세포 기관이며 에너지 생산을위한 세포 강국으로 간주됩니다. 한편, 미토콘드리아는 국소 또는 세포색 Ca2+ 상승에 대응하여 매트릭스에 Ca2+를 차지할 수 있다. 미토콘드리아 Ca2+ 섭취량은 삼환산(TCA) 주기 및 산화 인산화의 반응과 같은 대사 과정을 포함한 미토콘드리아 기능에 영향을 미치며, 생리조건 하에서 Ca2+민감한 단백질을 조절한다1,2,3,4. 미토콘드리아 Ca2+ 과부하는 또한 다양한 뇌질환5,6,7에서괴사 및 세포멸을 포함하는 세포 사멸을 위한 결정요인이다. 그것은 미토콘드리아 투과성 전이 모공 (mPTPs)의 개방과 세포 사멸 세포 죽음을 시작하는 caspase 공동 인자의 방출을 일으킵니다. 따라서, 세포 생리학 및 병리학을 더 잘 이해하기 위하여 살아있는 세포에 있는 미토콘드리아 Ca2+ 역학 및 취급을 공부하는 것이 중요합니다.
미토콘드리아는 Ca2+ 섭취량과 효능 사이의 균형을 통해 매트릭스 Ca2+ 항상성을 유지합니다. 미토콘드리아 Ca2+ 섭취량은 주로 미토콘드리아 Ca2+ 유니포터(MCUs)에 의해 매개되며, 미토콘드리아 Ca2+ efflux는 Na+-Ca2+-Li+ 교환기(NCLXs) 및 H+/Ca2+ 교환기(mHCX)8에의해 중재된다. 균형은 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)9의자극을 통해 교란 될 수있다. 미토콘드리아 Ca2+ 항상성 또한 용해성 xCa2+-xPO4x-xOH 복합체8의형성에 의해 미토콘드리아 버퍼링에 의해 영향을 받습니다.
Ca2+ 농도([Ca2+])의세포내 및 미토콘드리아 변화는 형광 또는 발광 Ca2+ 지표에 의해 평가될 수 있다. 지표에 결합Ca2+ 라이브 셀에서 실시간으로 무료 셀룰러 [Ca2+]를기록 할 수 있도록 스펙트럼 수정을 야기한다. 두 가지 유형의 프로브는 현재 세포의 Ca2+ 변화를 모니터링할 수 있습니다: 유기 화학 지표 및 유전자 인코딩된 Ca2+ 지표(GECIs). 일반적으로, 다른 Ca2+ 친화성(Kd 기준), 스펙트럼 특성(흥분 및 방출 파장), 동적 범위 및 민감성을 가진 다른 변이체는 조사 중인 생물학적 질문에 사용할 수 있습니다. 많은 합성 유기 Ca2+ 지표는 세포성 Ca2+ 이미징에 사용되었지만, 미토콘드리아 Ca2+ 이미징을 위한 미토콘드리아 매트릭스에 선택적으로 적재될 수 있으며, 로드-2가 가장 널리 사용되고 있습니다(리뷰는10,11참조). 그러나, Rhod-2는 긴 시간 과정 실험 도중 누설의 중요한 단점이 있습니다; 또한 미토콘드리아, 다른 소기관 및 사이토솔 사이에 분할되어 다른 서브컴터에서 절대 측정이 어려워집니다. 대조적으로, 세포형 특이적 프로모터 및 세포전 구획 표적화 서열을 이용하여, GECI는 체외 또는 생체 내에서 세포 및 구획 별 Ca2+ 이미징을 위한 상이한 세포 유형 및 세포전 구획으로 발현될 수 있다. 단일 파장 형광 강도 계 GCaMP Ca2+ 지표는 최근 주요 GECIs12,13,14,15,16으로부상했다. 이 문서에서는, 우리는 성상세포 및 뉴런에서 GCaMP5G 및 GCaMP6s (GCaMP5G/6s)의 미토콘드리아 표적화 및 세포 형 특이적 발현을 위한 프로토콜을 제공하고, 이러한 세포 모형에 있는 미토콘드리아 Ca2+ 섭취를 화상 진찰합니다. 이 프로토콜을 이용하여, 개별 미토콘드리아에서 GCaMP6G/6s의 발현이 드러나고, 단일 미토콘드리아 분해능에서 Ca2+ 섭취는 시험관내 및 생체내성상세포에서 달성될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는 성상 세포와 뉴런에서 미토콘드리아 Ca2+ 신호를 이미징하는 방법과 프로토콜을 제공합니다. 우리는 GECI GCaMP5G/6s를 표현하기 위하여 미토콘드리아 표적화 및 세포 모형 특정 전략을 구현했습니다. 미토콘드리아에서 GCaMP5G/6s를 대상으로 하기 위해 플라스미드에 미토콘드리아 표적 시퀀스를 포함시켰습니다. 생체 내 성상 세포및 뉴런에서GCaMP5G/6s를 표현하기 위해, 우?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NINDS)가 R01NS069726 및 R01NS094539를 SD에 보조금으로 지원했습니다. 우리는 오디오 녹음에 대한 에리카 DeMers 감사합니다.
Materials
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
Referências
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