使用遗传编码的Ca2 + 指示剂（GECI）对星形胶质细胞和神经元中的线粒体Ca2 + 摄取进行成像

Summary

该proctocol旨在为星形胶质细胞和神经元 中的体外 和 体内 线粒体Ca^{2 +} 成像提供一种方法。

Abstract

线粒体Ca²⁺在控制细胞质Ca²⁺缓冲、能量代谢和细胞信号转导中起着关键作用。线粒体Ca^{2 +}超载导致各种病理状况，包括神经变性和神经系统疾病中的凋亡细胞死亡。在这里，我们提出了一种细胞类型特异性和线粒体靶向分子方法，用于体外和体内星形胶质细胞和神经元中的线粒体Ca^{2 +}成像。我们构建了编码线粒体靶向的Ca^{2 +}指示素（GECIs）GCaMP5G或GCaMP6s（GCaMP5G / 6s）的DNA质粒，具有星形胶质细胞和神经元特异性启动子gfaABC1D和CaMKII以及线粒体靶向序列（mito-）。对于体外线粒体Ca^{2 +}成像，质粒在培养的星形胶质细胞和神经元中转染以表达GCaMP5G / 6s。对于体内线粒体Ca^{2 +}成像，制备腺相关病毒载体（AAV）并将其注射到小鼠大脑中，以在星形胶质细胞和神经元的线粒体中表达GCaMP5G / 6s。我们的方法提供了一种有用的方法来成像星形胶质细胞和神经元中的线粒体Ca^{2 +}动力学，以研究细胞质和线粒体Ca^{2 +}信号传导之间的关系，以及星形胶质细胞 – 神经元相互作用。

Introduction

线粒体是动态的亚细胞器，被认为是能量产生的细胞动力源。另一方面，线粒体可以响应局部或胞质Ca^{2 +}上升而吸收基质中的Ca^{2 +。}线粒体Ca²⁺摄取影响线粒体功能，包括代谢过程，如三羧酸（TCA）循环的反应和氧化磷酸化，并在生理条件下调节Ca^{2 +}敏感蛋白^{1，2，3，4。}线粒体Ca^{2 +}超载也是细胞死亡的决定因素，包括各种脑部疾病^5，6，7中的坏死和凋亡。它导致线粒体通透性过渡孔（mPTPs）的打开和半胱天冬酶辅因子的释放，从而引发凋亡细胞死亡。因此，研究活细胞中的线粒体Ca^{2 +}动力学和处理非常重要，以更好地了解细胞生理学和病理学。

线粒体通过Ca²⁺摄取和流出之间的平衡来维持基质Ca^{2 +}稳态。线粒体Ca^{2 +}摄取主要由线粒体Ca^{2 +}单转运体（MCU）介导，而线粒体Ca^{2 +}外排由Na⁺-Ca^{2 +}-Li⁺交换子（NCLXs）和H⁺/ Ca^{2 +}交换子（mHCXs）8介导。平衡可以通过刺激G蛋白偶联受体（GPCRs）^{来干扰9。}线粒体Ca^{2 +}稳态也受线粒体缓冲的影响，形成不溶性xCa^{2 +}-xPO₄x-xOH复合物⁸。

细胞内和线粒体中Ca²⁺浓度（[Ca^2+]）的变化可以通过荧光或发光Ca²⁺指示剂进行评估。Ca²⁺与指示剂的结合导致光谱修饰，允许在活细胞中实时记录游离细胞[Ca^2+]。目前有两种类型的探针可用于监测细胞中的Ca^{2 +}变化：有机化学指示剂和遗传编码的Ca^{2 +}指示剂（GECI）。通常，对于所研究的生物学问题，可以使用具有不同Ca^{2 +}亲和力（基于K_d），光谱特性（激发和发射波长），动态范围和灵敏度的不同变体。虽然许多合成的有机Ca²⁺指示剂已被用于胞质Ca²⁺成像，但只有少数可以选择性地加载到线粒体基质中用于线粒体Ca²⁺成像，其中Rhod-2是使用最广泛的（评论见10，11）。然而，Rhod-2在长时间的实验中存在泄漏的主要缺点;此外，它在线粒体，其他细胞器和细胞质基质之间分配，使得不同亚部门的绝对测量变得困难。相反，通过使用细胞型特异性启动子和亚细胞区室靶向序列，GECI可以在不同的细胞类型和亚细胞区室中表达，以便在体外或体内进行细胞和区室特异性Ca^{2 +}成像。基于单波长荧光强度的GCaMP Ca²⁺指标最近成为GECIs^{的主要指标12、13、14、15、16。}在本文中，我们提供了星形胶质细胞和神经元中GCaMP5G和GCaMP6s（GCaMP5G / 6s）的线粒体靶向和细胞类型特异性表达的方案，以及成像这些细胞类型中的线粒体Ca^{2 +}摄取。使用该协议，可以揭示单个线粒体中GCaMP6G / 6s的表达，并且可以在体外和体内的星形胶质细胞和神经元中实现单个线粒体分辨率中的Ca^{2 +}摄取 。

Protocol

涉及动物的程序已获得密苏里大学哥伦比亚分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。 1. DNA质粒的构建 注意：对于 体外 和 体内 成像，构建编码GCaMP5G / 6s的DNA质粒与星形胶质细胞和神经元特异性启动子以及线粒体靶向序列。 将线粒体基质（MM）靶向序列（mito-）插入ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCC…

Representative Results

本研究的目的是提供一种方法，在体外和体内使用星形胶质细胞和神经元中的GECI对线粒体Ca2 +信号进行成像。本文给出了体外和体内线粒体Ca2 +成像的结果。 培养的星形胶质细胞和神经元中的体外线粒体Ca2 +信号传导星形胶质细胞中的线粒体Ca2 +摄取可以通…

Discussion

在本文中，我们提供了一种用于成像星形胶质细胞和神经元中线粒体Ca^{2 +}信号的方法和方案。我们实施了线粒体靶向和细胞类型特异性策略来表达GECI GCaMP5G / 6s。为了靶向线粒体中的GCaMP5G / 6s，我们在质粒中加入了线粒体靶向序列。为了在体内星形胶质细胞和神经元中表达GCaMP5G/6s，我们将星形胶质细胞特异性启动子gfaABC1D和神经元特异性启动子CaMKII插入质粒中。星形胶质细胞和神经?…

Materials

Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight