Imaging mitokondriell Ca2+ upptag i astrocyter och nervceller med genetiskt kodade Ca2+ indikatorer (GECIs)

Summary

Denna proctocol syftar till att tillhandahålla en metod för in vitro och in vivo mitokondriell Ca^{2 +} imaging i astrocyter och nervceller.

Abstract

Mitokondriell Ca²⁺ spelar en avgörande roll för att kontrollera cytosolisk Ca^{2 +} buffring, energimetabolism och cellulär signaltransduktion. Överbelastning av mitokondriell Ca²⁺ bidrar till olika patologiska tillstånd, inklusive neurodegeneration och apoptotisk celldöd vid neurologiska sjukdomar. Här presenterar vi en celltypspecifik och mitokondrier inriktad på molekylär metod för mitokondriell Ca^{2 +} avbildning i astrocyter och nervceller in vitro och in vivo. Vi konstruerade DNA-plasmider som kodar mitokondrier-inriktning genetiskt kodade Ca^{2 +} indikatorer (GECIs) GCaMP5G eller GCaMP6s (GCaMP5G/6s) med astrocyt- och neuronspecifika promotorer gfaABC1D och CaMKII och mitokondrier-målsekvens (mito-). För in vitro mitokondriell Ca^{2 +} imaging, var plasmiderna transfected i odlade astrocyter och nervceller att uttrycka GCaMP5G/6s. För in vivo mitokondriell Ca^{2 +} imaging, adeno-associerade viral vektorer (AAV) förbereddes och injiceras i mushjärnorna att uttrycka GCaMP5G/6s i mitokondrier i astrocyter och nervceller. Vårt tillvägagångssätt ger ett användbart sätt att avbilda mitokondriell Ca^{2 +} dynamik i astrocyter och nervceller för att studera förhållandet mellan cytosolic och mitokondriell Ca^{2 +} signalering, liksom astrocyt-neuron interaktioner.

Introduction

Mitokondrier är dynamiska subcellulära organeller och anses vara cellkraftverk för energiproduktion. Å andra sidan kan mitokondrier ta upp Ca²⁺ till matrisen som svar på lokala eller cytosoliska Ca^{2 +} ökningar. Mitokondriell Ca²⁺ upptag påverkar mitokondriell funktion, inklusive metaboliska processer såsom reaktioner i trikarboxylsyra (TCA) cykeln och oxidativ fosforylering, och reglerar Ca²⁺känsliga proteiner under fysiologiska förhållanden^1,2,3,4. Mitokondriell Ca^{2 +} överbelastning är också en avgörande faktor för celldöd, inklusive nekros och apoptos i olika hjärnsjukdomar^5,6,7. Det orsakar öppnandet av mitokondriell permeabilitet övergång pores (mPTPs) och frisättningen av caspase cofactor, som initierar apoptotic cell död. Därför är det viktigt att studera mitokondriell Ca^{2 +} dynamik och hantering i levande celler för att bättre förstå cellulär fysiologi och patologi.

Mitokondrier upprätthåller matris ca²⁺ homeostas genom en balans mellan Ca²⁺ upptag och efflux. Mitokondriell Ca²⁺ upptaget förmedlas huvudsakligen av mitokondriella Ca²⁺ uniporters (MCUs), medan mitokondriell Ca^{2 +} efflux förmedlas av Na⁺-Ca^{2 +}-Li⁺ växlare (NCLXs) och H⁺/ Ca^{2 +} växlare (mHCXs)⁸. Balansen kan störas genom stimulering av G-proteinkopplade receptorer (GPCRs)⁹. Mitokondriell Ca^{2 +} homeostas påverkas också av mitokondriell buffring genom bildandet av olösliga xCa²⁺-xPO₄x-xOH-komplex⁸.

Intracellulära och mitokondriella förändringar i Ca²⁺ koncentration ([Ca²⁺]) kan utvärderas med fluorescerande eller självlysande Ca²⁺ indikatorer. Ca²⁺ bindning till indikatorer orsakar spektraländringar, vilket gör det möjligt att registrera gratis cellulära [Ca^{2 +}] i realtid i levande celler. Två typer av sonder finns för närvarande tillgängliga för att övervaka Ca²⁺ förändringar i celler: organiska kemiska indikatorer och genetiskt kodade Ca^{2 +} indikatorer (GECIs). I allmänhet finns olika varianter med olika Ca^{2 +} affiniteter (baserat på K_d), spektralegenskaper (excitation och emissionsvåglängder), dynamiska intervall och känsligheter tillgängliga för de biologiska frågor som undersöks. Även om många syntetiska organiska Ca^{2 +} indikatorer har använts för cytosolisk Ca^{2 +} imaging, kan endast ett fåtal selektivt laddas i mitokondriell matris för mitokondriell Ca^{2 +} imaging, med Rhod-2 är den mest använda (för recensioner se^10,11). Rhod-2 har dock en stor nackdel med läckage under långa tidsvägsexperiment; Dessutom är det delat mellan mitokondrier, andra organeller och cytosol, vilket gör absoluta mätningar i olika underparter svåra. Genom att använda celltypsspecifika promotorer och subcellulära fackinriktningssekvenser kan GECIs uttryckas i olika celltyper och subcellulära fack för cell- och fackspecifika Ca²⁺ imaging in vitro eller in vivo. Envågiga fluorescensintensitetsbaserade GCaMP Ca^{2+-indikatorer} har nyligen dykt upp som stora GECIs^{12,13,14,15,16}. I den här artikeln tillhandahåller vi ett protokoll för mitokondrier-inriktning och celltyp specifika uttryck för GCaMP5G och GCaMP6s (GCaMP5G/6s) i astrocyter och nervceller, och imaging mitokondriell Ca^{2 +} upptag i dessa celltyper. Med hjälp av detta protokoll kan uttrycket av GCaMP6G/6s i enskilda mitokondrier avslöjas, och Ca^{2 + upptag} i en enda mitokondriell upplösning kan uppnås i astrocyter och nervceller in vitro och in vivo.

Protocol

Djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Missouri-Columbia. 1. Konstruktion av DNA-plasmider OBS: För in vitro- och in vivo-avbildning konstrueras DNA-plasmider som kodar GCaMP5G/6s med astrocyt- och neuronspecifika promotorer och mitokondriella målsekvenser. Sätt in mitokondriell matris (MM)-målsekvens (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC …

Representative Results

Syftet med denna studie var att tillhandahålla en metodik för att avbilda mitokondriella Ca2 + signaler med GECIs i astrocyter och nervceller in vitro och in vivo. Resultaten av både in vitro och in vivo mitokondriell Ca2 + imaging presenteras här. In vitro mitokondriell Ca2+ signalering i odlade astrocyter och nervcellerMitokondriell Ca<su…

Discussion

I den här artikeln tillhandahåller vi en metod och protokoll för avbildning mitokondriell Ca^{2 +} signaler i astrocyter och nervceller. Vi implementerade mitokondrier-inriktning och celltypspecifika strategier för att uttrycka GECI GCaMP5G/6s. För att rikta in sig på GCaMP5G/6s i mitokondrier inkluderade vi en mitokondrier-målsekvens i plasmiderna. För att uttrycka GCaMP5G/6s i astrocyter och nervceller in vivo, satte vi in en astrocytspecifik promotor gfaABC1D och neuron-specifika promotorn CaM…

Materials

Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight