Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Обнаружение Indel после мутагенеза CRISPR/Cas9 с использованием анализа расплава высокого разрешения у комаров Aedes aegypti

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63008
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology and Agrilife Research, Texas A&M University

Summary

В этой статье подробно описывается протокол быстрой идентификации инделов, индуцированных CRISPR/Cas9, и выбора мутантных линий у комара Aedes aegypti с использованием анализа расплава с высоким разрешением.

Abstract

Редактирование генов комаров стало обычным делом в нескольких лабораториях с созданием таких систем, как транскрипционно-активатор-подобные эффекторные нуклеазы (TALENs), нуклеазы цинкового пальца (ZFNs) и самонаводящиеся эндонуклеазы (HEs). Совсем недавно технология кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) / CRISPR-ассоциированного белка 9 (Cas9) предложила более простую и дешевую альтернативу для точной геномной инженерии. После действия нуклеазы пути репарации ДНК будут исправлять сломанные концы ДНК, часто вводя индели. Эти внекадровые мутации затем используются для понимания функции генов в целевых организмах. Недостатком, однако, является то, что мутантные особи не несут доминирующего маркера, что затрудняет идентификацию и отслеживание аллелей мутантов, особенно в масштабах, необходимых для многих экспериментов.

Анализ расплава с высоким разрешением (HRMA) является простым методом выявления вариаций последовательностей нуклеиновых кислот и использует кривые плавления ПЦР для обнаружения таких изменений. Этот метод анализа после ПЦР использует флуоресцентные двухцепочечные ДНК-связывающие красители с приборами, которые имеют возможность сбора данных о контроле температуры и легко масштабируются до форматов пластин с 96 лунками. Здесь описан простой рабочий процесс с использованием HRMA для быстрого обнаружения CRISPR/Cas9-индуцированных инделей и установления мутантных линий у комара Ae. aegypti. Критически важно, что все этапы могут быть выполнены с небольшим количеством ткани ноги и не требуют жертвоприношения организма, позволяя проводить генетические скрещивания или фенотипирование после генотипирования.

Introduction

Как переносчики патогенов, таких как вирусы денге1, Зика2 и чикунгунья3, а также малярийные паразиты4, комары представляют значительную угрозу для здоровья людей. В связи со всеми этими заболеваниями основное внимание уделяется мерам по борьбе с комарами-переносчиками. Изучение генов, важных, например, в отношении вседозволенности к патогенам, приспособленности комаров, выживания, размножения и устойчивости к инсектицидам, является ключом к разработке новых стратегий борьбы с комарами. Для таких целей редактирование генома у комаров становится обычной практикой, особенно с развитием таких технологий, как HEs, ZFN, TALENs и совсем недавно CRISPR с Cas9. Создание генетически отредактированных штаммов обычно включает в себя обратное скрещивание людей, несущих желаемые мутации в течение нескольких поколений, чтобы свести к минимуму нецелевые и фаундокторные (узкие места) эффекты, с последующим скрещиванием гетерозиготных особей для генерации гомозиготных или трансгетерозиготных линий. В отсутствие доминирующего маркера молекулярное генотипирование необходимо в этом процессе, поскольку во многих случаях у гетерозиготных мутантов не может быть обнаружено четких фенотипических признаков.

Хотя секвенирование является золотым стандартом для генотипической характеристики, выполнение этого для сотен или, возможно, тысяч особей сопряжено со значительными затратами, трудом и временем, необходимыми для получения результатов, что особенно важно для организмов с короткой продолжительностью жизни, таких как комары. Обычно используемыми альтернативами являются Surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 и анализ расплава с высоким разрешением (HRMA, рассмотрено в 7). И SNA, и T7E1 используют эндонуклеазы, которые расщепляют только несоответствующие основания. Когда мутированная область гетерозиготного мутантного генома амплифицируется, фрагменты ДНК из аллелей мутантного и дикого типа отжигаются, чтобы сделать несоответствующую двухцепочечную ДНК (dsDNA). СНС обнаруживает наличие несоответствий через пищеварение с несоответствующей специфической эндонуклеазой и простым электрофорезом агарозного геля. В качестве альтернативы HRMA использует термодинамические свойства dsDNA, обнаруженные флуоресцентными красителями, связывающими dsDNA, при этом температура диссоциации красителя изменяется в зависимости от наличия и типа мутации. HRMA использовался для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)8, мутантного генотипирования рыб данио9, микробиологических приложений10 и генетических исследований растений11.

В этой статье описывается HRMA, простой метод молекулярного генотипирования для комаров-мутантов, генерируемый технологией CRISPR / Cas9. Преимущества HRMA перед альтернативными методами включают в себя 1) гибкость, поскольку она доказала свою полезность для различных генов, широкий диапазон размеров инделя, а также различие между различными размерами инделя и гетерозиготной, гомозиготной и трансгетерозиговой дифференцировкой12,13,14, 2) стоимость, поскольку она основана на широко используемых реагентах ПЦР, и 3) экономию времени, так как это может быть выполнено всего за несколько часов. Кроме того, протокол использует небольшую часть тела (ногу) в качестве источника ДНК, что позволяет комару выжить в процессе генотипирования, позволяя устанавливать и поддерживать мутантные линии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Сканирование на наличие однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), проектирование праймера HRMA и валидация праймера

  1. Идентификация SNP у комаров лабораторных колоний дикого типа
    1. Выберите целевой экзон, чтобы нарушить правильную трансляцию полипептидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мишень должна быть близка к исходному кодону или среди ключевых остатков, необходимых для функции белка. Чем короче экзон (например, ≤200 оснований), тем сложнее его нацеливать и анализировать. Избегайте редактирования близко к границам экзона, так как это заставляет один из праймеров HRMA либо пересекать интрон, либо находиться в интроне. Это нежелательно, поскольку ставки SNP, как правило, намного выше в этих регионах.
    2. Конструкция грунтовки
      1. Перейдите на веб-сайт NCBI Blast - Primer Blast15, скопируйте и вставьте выбранный экзон в поле в верхней части страницы | выберите размер продукта ПЦР (убедитесь, что он охватывает большую часть экзона) | выберите организм.
      2. Нажмите на Дополнительные параметры | Выберите (для продукта ПЦР Tm) и добавьте 60 (для оптимальной температуры 60 °C) | Получите грунтовки. Остальные параметры оставить по умолчанию.
    3. Получение геномной ДНК (гДНК) из лабораторной колонии дикого типа. Отложите 10 комаров, обезбольте их CO2 и поместите в чашку Петри на льду, чтобы они оставались неактивными. Установите 10 пробирок, содержащих 0,5 мкл реагента для высвобождения ДНК из ткани и 20 мкл буфера разбавления, которые предусмотрены в наборе для высвобождения ДНК, предложенном в Таблице материалов.
    4. С помощью щипцов удалить одну ногу с помощью щипцов и поместить ее в соответствующую пробирку разбавленного раствора реагента с высвобождением ДНК (из стадии 1.1.3), полностью погружая ножку в раствор. Повторите этот шаг с оставшимися комарами, протерев щипцы 70% этанолом, прежде чем перейти к следующему.
    5. Инкубировать легочный раствор при комнатной температуре в течение 2-5 мин, затем при 98 °С в течение 2 мин, и дать ему остыть при настройке реакции ПЦР.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины, содержащие высвобожденную гДНК, могут храниться при -20 °C, и протокол может быть приостановлен в этот момент.
    6. Подготовьте 10 пробирок, содержащих 10 мкл 2x PCR Master Mix, грунтовки до конечной концентрации 0,5 мкМ и воду молекулярного класса до конечного объема 20 мкл и перенесите 1 мкл разбавленного образца в каждую пробирку. Выполняют ПЦР по следующим параметрам цикла: 98 °C 5 мин, 40 циклов 98 °C в течение 5 с, 60 °C 30 с, 72 °C 20 с на кб; окончательное продление 72 °C в течение 1 мин.
    7. Очистите продукты ПЦР ферментом для разложения остаточных праймеров ПЦР и дефосфорилировать избыточные dNTP или любой комплект для очистки колонны. Приступайте к виртуализации образцов.
    8. Анализируйте каждую электроферограмму на наличие двойных пиков/неоднозначных оснований и корректируйте базовые вызовы вручную в каждой последовательности, используя соответствующий вырожденный базовый код.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен перед выравниванием нескольких последовательностей, так как программное обеспечение, вызывающее базу, обычно выбирает более заметный пик в качестве «истинного» базового вызова, создавая ложное впечатление отсутствия SNP.
    9. Выполните выравнивание нескольких последовательностей с помощью программного обеспечения для выравнивания SeqMan Pro, указанного в Таблице материалов, или другого программного обеспечения с открытым исходным кодом, такого как ClustalW16 или T-Coffee17.
      1. Откройте программное обеспечение выравнивания | нажмите на Добавить последовательности | выберите нужные последовательности и нажмите добавить | как только все последовательности выбраны, нажмите Готово.
      2. Нажмите кнопку Собрать , чтобы выполнить выравнивание. Чтобы открыть выравнивание, нажмите на Contig 1 и проанализируйте выравнивание и определите SNP (рисунок 1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы этапам 1.1.3-1.1.6 ПЦР может быть выполнена из изолированной геномной ДНК, полученной из объемных образцов (полученных от >10 особей). Секвенированные ампликоны могут быть проанализированы непосредственно на наличие SNP, появляющихся в виде двойных пиков в электроферограмме, хотя редкие SNP будет труднее обнаружить.
    10. Спроектируйте 3-5 одиночных направляющих РНК (sgRNAs), избегая областей, содержащих любой SNP, идентифицированный выше, следуя протоколу, описанному в 18.
  2. Конструкция грунтовки HRMA
    1. Проверьте последовательность экзонов на предмет возможного образования вторичных структур при ПЦР с помощью mFold19.
      1. Перейдите на веб-сервер UNAFold | нажмите на | mFold в выпадающем меню выберите приложения | Форма складывания ДНК.
      2. Введите имя последовательности в поле и вставьте экзон.
      3. Изменить температуру складывания до 60 °C; в ионных условиях измените [Mg++] на 1,5 , а на Units переключитесь на mM; нажмите на Fold DNA.
      4. На выходе в разделе Структура 1 нажмите на pdf , чтобы открыть Графики круговой структуры.
    2. Перейдите в NCBI Blast - Primer Blast15 для проектирования грунтовки.
    3. Скопируйте и вставьте выбранную последовательность экзонов, определенную путем виртуализации на шаге 1.1 (последовательность, содержащая наименьшее количество SNP или отсутствие SNP), в поле в верхней части страницы.
    4. Используйте символ < > для пометки и исключения последовательностей, содержащих SNP, целевой сайт и регионы с возможным формированием вторичной структуры.
    5. Выберите размер продукта ПЦР от 80 до 150 bp и выберите организм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно успешно использовать фрагменты больших размеров (~300 bp). Однако более длинные ампликоны могут снизить чувствительность между последовательностями, отличающимися одной или несколькими парами оснований.
    6. Нажмите на Получить грунтовки. Выберите 2–3 пары праймеров для тестирования (в идеале сайты грунтовки находятся ≥20–50 бит/с от любых целевых сайтов CRISPR).
  3. Проверка грунтовки
    1. Выполните градиентную ПЦР с использованием гДНК от одного человека.
      1. Подготовьте мастер-микс и извлеките один образец для нешаблонного элемента управления (NTC) в отдельной пробирке. Добавьте шаблон к оставшемуся мастер-миксу и аликвоту в 96-луночную пластину.
      2. Соблюдайте параметры цикла: 98 °C 30 с, 34 цикла 98 °C в течение 10 с, 55–65 °C 30 с, 72 °C 15 с; окончательное продление 72 °C в течение 10 мин.
      3. Генерируйте профили термического расплава в соответствии с параметрами: стадия денатурации 95 °C в течение 1 мин, отжиг 60 °C в течение 1 мин, обнаружение кривой расплава между 75 °C и 95 °C с шагом 0,2 °C с временем удержания 10 с при каждой температуре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следует использовать только температуры отжига с одним профилем термического расплава.
  4. Приступайте к генерации мутантных линий с помощью инъекций эмбрионов, как описано в 12.

2. Получение геномной ДНК из ног комаров

  1. Разделите комаров G1 по полу на стадии куколки, чтобы они не спаривались перед генотипированием, и убедитесь, что соответствующие возрасту комары дикого типа будут доступны для использования для ссылок и бэккроссов. Разделите их по признаку пола.
  2. Соберите необходимые материалы (рисунок 2А) и подготовьте 96-луночную ПЦР-пластину с 0,5 мкл реагента с высвобождением ДНК и 20 мкл буфера разбавления (из набора высвобождения гДНК) на человека для генотипирования (рисунок 2B) и оставьте его на льду. Зарезервируйте две реакции для NTC.
  3. Пометьте лоток для флаконов комаров (флаконы Drosophila ), чтобы каждый колодец на 96-й пластине соответствовал соответствующему флакону комара в лотке.
  4. Обезболить комаров G1 CO2 и поместить их в стеклянную чашку Петри, чтобы они оставались седативными (рисунок 2C, D). Обезболить и поместить 8 комаров дикого типа во вторую чашку Петри.
  5. Протрите пару пинцетов 70% этанолом и удалите одну из задних лап комаров (рисунок 2E,F).
  6. Погрузите ножку в раствор реагента с высвобождением ДНК, поместите комара в соответствующий флакон и закройте его губкой (рисунок 2G,H).
  7. Снова протрите пинцет 70% этанолом и приступайте к удалению ноги от следующего комара. Повторяйте шаги 2,5-2,7 до тех пор, пока не будет завершена плита из 96 скважин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно протирать пинцет 70% этанолом. Это сводит к минимуму перекрестное загрязнение ДНК.
  8. Запечатайте пластину уплотнением оптической ПЦР-пластины (рисунок 2I) и инкубируйте 96-луночную пластину, содержащую ножки при комнатной температуре (RT) в течение 2-5 мин, а затем при 98 °C в течение 2 мин. Дайте пластине остыть до RT во время приготовления смеси ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс обычно занимает 3-4 часа. Если комары должны содержаться во флаконах в течение более длительного времени, чем ожидается (особенно ≥1 день), поместите небольшой кусочек изюма (или источника сахара и воды) с каждым комаром, чтобы обеспечить выживание комаров во время длительных инкубаций.

3. HRMA

  1. Выполните ПЦР.
    1. Подготовьте мастер-смесь, содержащую следующие компоненты для каждой реакции: 10 мкл 2x буфера (из набора для высвобождения гДНК), 0,5 мкМ каждого праймера, 1 мкл красителя EvaGreen, 0,4 мкл полимеразы (из набора для высвобождения гДНК) и до 19 мкл с водой молекулярного класса.
    2. Используя многоканальный пипетку, переведите 19 мкл мастер-микса в каждую скважину. Перенесите 1 мкл раствора высвобождения ДНК, содержащего ДНК комара, приготовленного в секции 2, на пластину (фиг.3A). Запечатайте пластину оптическим уплотнением ПЦР-пластины.
    3. Выполняют ПЦР по параметрам цикла: 98 °C в течение 5 мин, 39 циклов 98 °C в течение 10 с, выбранная температура отжига (72 °C) в течение 30 с; окончательное удлинение 72 °C в течение 2 мин.
  2. Генерируйте профили термического расплава в соответствии с параметрами: стадия денатурации 95 °C в течение 1 мин, отжиг 60 °C в течение 1 мин, обнаружение кривой расплава между 75 °C и 95 °C с шагом 0,2 °C с временем удержания 10 с при каждой температуре. Смотрите Дополнительные материалы и Дополнительный рисунок S1-S5 для подробного описания настройки программного обеспечения для HRMA, работающего с использованием системы реального времени CFX96.
  3. Изучите профили расплава (рисунок 3B). Назначьте элемент управления подстановочного типа ссылочному кластеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение (см. Таблицу материалов) автоматически нормализует данные и обозначает кластеры цветами для различных кривых расплава.
  4. Пометьте различные кластеры соответствующими цветами на шаблоне с 96 скважинами (рисунок 3C).
  5. Выберите людей с интересующими кривыми, удалите их из трубок и перекрестите обратно (рисунок 3D). Кормите спаренных самок кровью и собирайте яйца G2 .

4. Проверка последовательности с помощью секвенирования Сэнгера

  1. Очистите продукт ПЦР из колодцев с выбранными комарами (из пластины, приготовленной в разделе 3.1), используя фермент для разложения остаточных праймеров ПЦР, и дефосфорилируйте избыточные дНТП. В качестве альтернативы можно использовать любой комплект для очистки колонн и приступить к виртуализации образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прямое секвенирование может быть более сложным, когда размер продукта ПЦР невелик (≤200 bp). В таких случаях разрабатывают праймеры для амплификации более крупных фрагментов, охватывающих целевой участок (≥250 bp) и амплификации с помощью ПЦР с использованием ДНК в 96-луночной пластине (этап 2.2).
  2. Анализируйте и идентифицируйте indels с помощью программного обеспечения trace viewer (рисунок 4). Кроме того, программное обеспечение Poly Peak Parser20 может помочь обнаружить мутацию у гетерозиготных людей.
    1. Перейдите на веб-сайт Poly Peak Parser, выберите последовательность из числа мутантов в меню Обзор , а затем скопируйте и вставьте эталонную последовательность в поле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выравнивание между альтернативным аллелем и ссылкой автоматически появится в правой части экрана.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Комары, содержащие мутации в генах AaeZIP11 (предполагаемый транспортер железа21) и мио-фем (ген миозина с женским уклоном, связанный с летными мышцами13), были получены с использованием технологии CRISPR/Cas9, генотипированы с использованием HRMA и проверены последовательностью (рисунок 5). На рисунках 5A и 5C показана нормализованная интенсивность флуоресценции из кривых HRM из образцов мутантов AaeZIP11 и myo-fem , соответственно, наряду с контролем дикого типа. На рисунках 4B и 4D показано увеличение разностных кривых (из образцов мутантов AaeZIP11 и myo-fem соответственно) между профилями расплава различных кластеров, назначенных программным обеспечением после вычитания каждой кривой из эталона дикого типа. Гетерозиготные и гомозиготные мутантные особи AaeZIP11 были помещены в разные кластеры и легко отличаются от контрольных групп дикого типа (рисунок 5B). Гетерозиготные мутантные мио-фем-особи также отличаются от контрольных (рисунок 5D). Обратите внимание, что в обоих случаях присутствовали два кластера в элементах управления дикого типа, скорее всего, из-за присутствия SNP в целевой области (рисунок 5), что подчеркивает необходимость использования нескольких контрольных образцов, чтобы избежать классификации элементов управления как мутантов, когда SNP нельзя избежать.

На рисунке 4A показан анализ последовательности мутанта AaeZIP11 . Электроферограмма гетерозиготных мутантов AaeZIP11 указывает на нуклеотидное положение, где произошел индель. Это представлено сдвигом от одинарных к двойным пикам, поскольку полиморфные положения будут показывать оба нуклеотида одновременно (рисунок 4A). Количество пар оснований, удаленных или вставленных, было рассчитано путем подсчета одиночных пиков в конце пробега (рисунок 4B), поскольку одна из нитей ДНК будет короче или длиннее другой по количеству пар оснований, удаленных или вставленных, соответственно. Рекомендуется использовать проверенную последовательностью гДНК от мутантов в качестве ориентира для идентификации гетерозигот, чтобы помочь с анализом HRMA для последующих поколений. Ручное назначение кривых может потребоваться, если похожие кривые автоматически назначаются различным кластерам. Это можно сделать, сравнив кривые со сдвигом температуры и кривые разности. Для правильного назначения образцов кластерам может потребоваться ручная настройка программного обеспечения. Результаты HRMA от AaeZIP11 и мутанта под названием Aeflightin показывают, что для успешной классификации гетерозигот, гомозигот и трансгетерозигот необходимы отдельные анализы образцов. Первоначально автоматическое назначение кластера из программного обеспечения не могло провести надлежащее различие между группами (рисунок 6A, рисунок 6C, рисунок 6E и рисунок 6G). Затем каждый образец анализировали индивидуально и распределяли по правильным группам на основе сходства с эталонными образцами гетерозигот, гомозигот и трансгетерозигот (ранее проверенных секвенированием) (рисунок 6B, рисунок 6D, рисунок 6F и рисунок 6H).

Figure 1
Рисунок 1: Идентификация SNP. Схематическое представление выравнивания нескольких последовательностей фрагмента AaeZIP11 от wild-type. Красным цветом выделены SNP, а зеленым — фрагменты, свободные от SNP; эта область, свободная от SNP, предлагается для проектирования sgRNA и праймера. Сокращения: SNP = однонуклеотидный полиморфизм; sgRNA = единая направляющая РНК; LVP = Ливерпульский штамм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Экспериментальная процедура получения геномной ДНК из ног комаров для HRMA. (A) Материалы для получения геномной ДНК, включая пипетки, наконечники, ПЦР-пластину, оптическую пломбу, резервуар, буфер разбавления и раствор для высвобождения ДНК. (B) Препарат ПЦР-пластины, содержащий реагент высвобождения ДНК и буфер разбавления. (C) Противомоскитная анестезия CO2. (D) Протирание пинцета 70% этанолом для предотвращения загрязнения между образцами. (E) Экспериментальная установка, включающая пинцет, стойку для флаконов комаров, чашку Петри поверх контейнера со льдом с обезболенными комарами и ранее подготовленную ПЦР-пластину. (F) Удаление ноги комара. (G) Увеличить вид ноги комара, погруженной в раствор реагента для высвобождения ДНК. H) Одиночный комар, помещенный во флакон. (I) Герметизация ПЦР-пластины, содержащей ноги комара. Аббревиатура: HRMA = анализ расплава с высоким разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Экспериментальная процедура анализа HRM. (A) Перенос высвобождаемой гДНК на 96-луночную пластину, содержащую смесь ПЦР. (B) Визуальный осмотр кривых разности. (C) Маркировка каждого образца на 96-луночном шаблоне тем же цветом, что и его соответствующий цвет разностной кривой. D) обратное пересечение лиц из одного и того же кластера. Сокращения: HRM = расплав высокого разрешения; гДНК = геномная ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Анализ последовательности мутанта AaeZIP11 . (A) Нуклеотидное выравнивание мутанта AaeZIP11Δ56. Тире, выделенные желтым цветом, являются удаленными основаниями. В коробке электроферограмма переходит от одинарных пиков к двойным пикам, изображая положение, где произошло удаление (стрелка). (B) Электроферограмма конца последовательного пробега и перехода от двойных пиков к одинарным пикам. Обратите внимание, что число одиночных пиков представляет собой количество удаленных оснований (серый прямоугольник). Последовательности грунтовок приведены в дополнительной таблице S1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: HRMA ДНК, извлеченной из ног комаров. ДНК была извлечена из одной ноги комаров AaeZIP11 (A и B) и myo-fem (C и D) и проанализирована HRMA. A и C обозначают нормализованные флуоресцентные сигналы образцов до относительных значений от 1,0 до 0. B и D обозначают увеличение разности кривых путем вычитания каждой кривой из эталона дикого типа (деформация Ливерпуля). Сокращения: HRMA = анализ расплава высокого разрешения; LVP = ливерпульский штамм; РФС = относительные единицы флуоресценции. Последовательности грунтовок приведены в дополнительной таблице S1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Примеры ручных групповых заданий. (A-D) HRMA для мутантов Aeflightin. (A и C) Кривые расплава (нормализованные линейные кривые масштаба и разностные кривые соответственно) автоматически группируются программным обеспечением precision Melt Analysis. (B) Нормализация дифференциальных кривых, измененных вручную. (D) После изменения нормализации дифференциальных кривых каждый образец был назначен индивидуально по пиковым температурам в разностных кривых для соответствующих положительных контрольных показателей (ранее секвенированные образцы, идентифицированные гетерозиготами Δ4 и Δ5 и трансгетерозиготами Δ4Δ5), что позволило четко идентифицировать 3 группы. Красные и коричневые стрелки добавляются, чтобы подчеркнуть пики при разных температурах. (Э-Н) HRMA для мутантов AaeZIP11. (E и G) Кривые расплава автоматически назначаются программным обеспечением. (F и H) Мутанты во втором гетерозиготном самокрещивании были соответствующим образом отнесены к правильным группам по сходству нормализованных и разностных кривых с ранее определенными ссылками (цветовая кодировка в кривых). Гетерозиготы asg, Homozygotes asg и Trans-heterozygotes asg: присвоены кривые расплава программным обеспечением Precision Melt Analysis. Сокращения: HRMA = анализ расплава высокого разрешения; LVP = ливерпульский штамм; РФС = относительные единицы флуоресценции. Последовательности грунтовок приведены в дополнительной таблице S1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный материал: Подробный протокол для настройки HRMA в системе реального времени CFX96 (например, Bio-rad). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S1: Пошаговые инструкции по настройке протокола циклирования на Bio-rad CFX Manager. Дополнительный материал 2.1-2.3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Пошаговая инструкция по установке пластины на Bio-rad CFX Manager. Дополнительный материал 3.1-3.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Пошаговые инструкции по настройке пластины на Bio-rad CFX Manager. Дополнительный материал 3.5-3.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S4: Пошаговая инструкция по настройке запуска на Bio-rad CFX Manager. См. Дополнительный материал 4.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S5: Пошаговая инструкция по анализу HRMA на Bio-rad CFX Manager. Дополнительный материал 5.1-5.3. Аббревиатура: HRMA = анализ расплава с высоким разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S1: Список грунтовок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ расплава с высоким разрешением предлагает простое и быстрое решение для идентификации инделей, генерируемых технологией CRISPR/Cas9 в комаре-переносчике Ae. aegypti. Он обеспечивает гибкость, позволяя генотипировать комаров, мутировавших для широкого спектра генов от мышц полета до метаболизма железа и более 13,14. HRMA может быть выполнен всего за несколько часов от сбора образцов до окончательного анализа. Дополнительное время требуется для проектирования грунтовки, а также будет зависеть от времени получения любых необходимых результатов секвенирования (для идентификации SNP), анализа последовательностей и упорядочения грунтовки.

В протоколе, представленном здесь, подробно описываются пошаговые методы успешного анализа. Одним из наиболее важных шагов в этом процессе является правильное проектирование грунтовок. HRMA достаточно чувствителен, что присутствие даже одного SNP в усиленном фрагменте может привести к сильной разностной кривой, которая может быть неправильно истолкована как мутация. Секвенирование лабораторных образцов колоний до мутагенеза CRISPR позволяет обнаруживать и избегать богатых SNP областей при проектировании цели; праймеры HRMA помогут предотвратить эту проблему. Проектирование грунтовок для малых ампликонов (70-100 bp) также может улучшить чувствительность и воспроизводимость эксперимента, поскольку более крупные фрагменты могут представлять несколько доменов расплава, уменьшая вероятность различать варианты22. Ограничение метода заключается в том, что полное избегание SNP может быть невозможным в зависимости от гена; таким образом, секвенирование и дальнейшее использование нескольких контрольных особей дикого типа может помочь в анализе.

Специально для этого протокола важно поддерживать жизнь генотипированных комаров, чтобы их можно было скрещивать обратно для установления мутантных линий. Удаление одной из ног комаров для извлечения гДНК может быть наименее инвазивным способом достижения этой цели; однако количество гДНК, извлеченной из этой ткани, минимально. Набор, предложенный в Таблице материалов, был достаточным для получения ДНК из ноги комара и выполнения ПЦР для завершения HRMA.

HRMA может предложить большую гибкость с точки зрения обнаружения широкого диапазона размеров indel, варьирующихся от одноосных несоответствий до нескольких пар оснований (AaeZIP11 имел делецию 56 bp) и превосходящих методы, такие как SNA или T7E1 (оба анализа расщепления несоответствия ферментов), которые ограничены одноосным несоответствием или небольшими делециями (~ 20 bp)5, 23. Кроме того, СНС не обнаруживает гомозиготных мутантов, поскольку продукты ПЦР не содержат несоответствий. Кроме того, результаты СНС могут быть также замаскированы естественными аллельными полиморфизмами, когда продукты ПЦР, обработанные нуклеазами, имеют длину, аналогичную мутантным аллелям. Ни одно из этих ограничений не применимо к HRMA. В конечном счете, секвенирование необходимо для идентификации мутантной последовательности ДНК. Однако, как только мутация, о которой идет речь, известна, HRMA, используемая для идентификации мутантных особей, намного быстрее, чем прямое секвенирование. Этот метод сохраняет ценные образцы (чем больше комаров выживет, тем меньше им придется ждать результатов своего генотипа) и снижает потребность в секвенировании большого количества образцов, снижая общую стоимость эксперимента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

Все фигуры были созданы с Biorender.com по лицензии Техасского университета A&M. Эта работа была поддержана средствами Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (AI137112 и AI115138 до Z.N.A.), Texas A&M AgriLife Research в рамках Программы грантов на переносчики насекомых и Национального института продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США, проект Хэтч 1018401.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol 70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates VWR 82006-636 For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96 Bio Rad PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs VWR 490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit New England Biolabs E1050S
Glass Petri Dish VWR 89001-246 150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates Bio-rad HSP9665 For HRMA
Multi-channel pipettor (P10) Integra Biosciences 4721
Multi-channel pipettor (P300) Integra Biosciences 4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific VWR 37000-548 To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape Bio-rad 2239444 To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) Thermo Fisher F140WH For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers Genesee 59-128W
Precision Melt Analysis Software Bio Rad 1845025 Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro DNAstar Lasergene software For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm WPI 14098
White foam plugs VWR 60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene Genesee 32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue Genesee 59-164B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , Report No. 978 160 (2009).
  2. WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
  3. WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
  4. WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020).
  5. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  6. Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
  7. Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
  8. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
  9. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  10. Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
  11. Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
  12. Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
  13. O'Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
  14. Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
  15. Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  16. Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
  17. Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
  18. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
  19. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  20. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  21. Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
  22. Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
  23. Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).

Tags

Генетика выпуск 175
Обнаружение Indel после мутагенеза CRISPR/Cas9 с использованием анализа расплава высокого разрешения у комаров <em>Aedes aegypti</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes,… More

Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes, E., O'Leary, S., Adelman, Z. N. Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (175), e63008, doi:10.3791/63008 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter