Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Detecção indel seguindo CRISPR/Cas9 Mutagenesis usando análise de derretimento de alta resolução no mosquito Aedes aegypti

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63008
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology and Agrilife Research, Texas A&M University

Summary

Este artigo detalha um protocolo para identificação rápida de indels induzidos pelo CRISPR/Cas9 e seleção de linhas mutantes no mosquito Aedes aegypti utilizando análise de derretimento de alta resolução.

Abstract

A edição de genes de mosquitos tornou-se rotina em vários laboratórios com o estabelecimento de sistemas como nucleases efeitos (TALENs) de ativação de transcrição, núcleos de dedo de zinco (ZFNs) e endonucleases (HEs). Mais recentemente, a tecnologia de repetições palindômicas curtas interespaçadas regularmente (CRISPR)/CRISPR(Cas9) ofereceu uma alternativa mais fácil e barata para a engenharia de genomas de precisão. Após a ação nuclease, as vias de reparação de DNA consertarão as extremidades de DNA quebradas, muitas vezes introduzindo indels. Essas mutações fora do quadro são então usadas para entender a função genética nos organismos alvo. Uma desvantagem, no entanto, é que indivíduos mutantes não carregam nenhum marcador dominante, tornando a identificação e o rastreamento de alelos mutantes desafiadores, especialmente em escalas necessárias para muitos experimentos.

A análise de derretimento de alta resolução (HRMA) é um método simples para identificar variações nas sequências de ácido nucleico e utiliza curvas de fusão pcr para detectar tais variações. Este método de análise pós-PCR usa corantes fluorescentes de ligação de DNA de dupla fita com instrumentação que tem capacidade de captura de dados de controle de rampa de temperatura e é facilmente dimensionado para formatos de placas de 96 poços. Descrito aqui é um simples fluxo de trabalho utilizando o HRMA para a detecção rápida de indeles induzidos pelo CRISPR/Cas9 e o estabelecimento de linhas mutantes no mosquito Ae. aegypti. Criticamente, todas as etapas podem ser realizadas com uma pequena quantidade de tecido da perna e não requerem o sacrifício do organismo, permitindo que cruzes genéticas ou ensaios de fenotipagem sejam realizados após a genotipagem.

Introduction

Como vetores de patógenos como os vírus da dengue1, zika2 e chikungunya3, bem como parasitas maláricos4, os mosquitos representam uma ameaça significativa à saúde pública para os seres humanos. Para todas essas doenças, há um foco substancial de intervenção de transmissão no controle de mosquitos vetores. O estudo dos genes importantes, por exemplo, na permissividade aos patógenos, na aptidão dos mosquitos, na sobrevivência, na reprodução e na resistência aos inseticidas é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias de controle de mosquitos. Para tais efeitos, a edição de genomas em mosquitos está se tornando uma prática comum, especialmente com o desenvolvimento de tecnologias como HEs, ZFNs, TALENs e, mais recentemente, CRISPR com Cas9. O estabelecimento de cepas editadas por genes normalmente envolve o backcrossing de indivíduos que carregam as mutações desejadas por algumas gerações para minimizar efeitos fora do alvo e fundador (gargalo), seguido pela travessia de indivíduos heterozigosos para gerar linhas homozigosas ou trans-heterozigosas. Na ausência de um marcador dominante, a genotipagem molecular é necessária nesse processo porque, em muitos casos, não podem ser detectados traços fenotípicos claros para mutantes heterozigosos.

Embora o sequenciamento seja o padrão-ouro para a caracterização genotipípica, realizar isso em centenas, ou possivelmente milhares de indivíduos, representa custos significativos, mão-de-obra e tempo necessários para obter resultados, o que é especialmente crítico para organismos com vida útil curta, como mosquitos. Alternativas comumente utilizadas são Surveyor nuclease assay5 (SNA), ensaio T7E1 e análise de derretimento de alta resolução (HRMA, revisado in7). Tanto o SNA quanto o T7E1 usam endonucleases que apenas se descompatem bases incompatíveis. Quando uma região mutante mutante mutada do genoma mutante heterozigoso é amplificada, fragmentos de DNA de alelos mutantes e do tipo selvagem são enais para fazer DNA de dupla cadeia incompatível (dsDNA). A SNA detecta a presença de incompatibilidades via digestão com uma endonuclease específica de incompatibilidade e eletroforese de gel de agarose simples. Alternativamente, o HRMA utiliza as propriedades termodinâmicas do dsDNA detectadas por corantes fluorescentes de ligação dsDNA, com a temperatura de dissociação do corante variando com base na presença e tipo de mutação. O HRMA tem sido utilizado para a detecção de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs)8, genotipagem mutante de peixe-zebra9, aplicações microbiológicas10 e pesquisa genética vegetal11, entre outros.

Este artigo descreve o HRMA, um método simples de genotipagem molecular para mosquitos mutantes gerado pela tecnologia CRISPR/Cas9. As vantagens do HRMA sobre técnicas alternativas incluem 1) flexibilidade, pois tem sido comprovadamente útil para vários genes, uma ampla gama de tamanhos indel, bem como a distinção entre diferentes tamanhos indel e heterozigous, homozygous e trans-heterozygous diferenciação12,13,14, 2) custo, pois é baseado em reagentes PCR comumente usados, e 3) economia de tempo, como pode ser realizado em apenas algumas horas. Além disso, o protocolo utiliza uma pequena parte do corpo (uma perna) como fonte de DNA, permitindo que o mosquito sobreviva ao processo de genotipagem, permitindo o estabelecimento e manutenção de linhas mutantes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Digitalização para polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs), projeto de primer HRMA e validação do primer

  1. Identificação do SNP em mosquitos de colônia de laboratório silvestre
    1. Selecione o exon de destino para interromper a tradução adequada do polipeptídeo.
      NOTA: O alvo deve estar próximo do códon inicial ou entre os principais resíduos necessários para a função proteica. Quanto menor o exon (por exemplo, ≤200 bases), mais difícil é mirar e analisar. Evite editar perto dos limites de um exon, pois isso força um dos primers do HRMA a atravessar um intron ou estar em um intron. Isso é indesejável porque as taxas de SNP tendem a ser muito maiores nessas regiões.
    2. Design primer
      1. Vá para o site NCBI Blast - Primer Blast15, copie e cole o exon escolhido na caixa no topo da página | escolher o tamanho do produto PCR (certifique-se de que engloba a maior parte do exon) | escolher o organismo.
      2. Clique em Parâmetros Avançados | Opte (por PCR Product Tm) e adicione 60 (para uma temperatura ótima de 60 °C) | Pegue primers. Mantenha os outros parâmetros como padrão.
    3. Obtenha DNA genômico (gDNA) da colônia de laboratório silvestre. Reserve 10 mosquitos, anestesia-os com CO2, e coloque-os em uma placa de Petri no gelo para mantê-los inativos. Configure 10 tubos contendo 0,5 μL do reagente para liberação de DNA do tecido e 20 μL de tampão de diluição, ambos fornecidos no kit de liberação de DNA sugerido na Tabela de Materiais.
    4. Remova uma perna de um único mosquito usando fórceps e coloque-a em um tubo correspondente de uma solução diluída do reagente de liberação de DNA (a partir da etapa 1.1.3), submergindo completamente a perna na solução. Repita esta etapa com os mosquitos restantes, limpando os fórceps com 70% de etanol antes de prosseguir para o próximo.
    5. Incubar a solução contendo perna à temperatura ambiente por 2-5 min, depois a 98 °C por 2 min, e deixe esfriar durante a configuração da reação do PCR.
      NOTA: As placas contendo o gDNA liberado podem ser armazenadas a -20 °C, e o protocolo pode ser pausado neste momento.
    6. Prepare 10 tubos contendo 10 μL de 2x PCR Master Mix, primers para uma concentração final de 0,5 μM e água de grau molecular para um volume final de 20 μL, e transfira 1 μL da amostra diluída para cada tubo. Executar PCR seguindo estes parâmetros de ciclismo: 98 °C 5 min, 40 ciclos de 98 °C para 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s por kb; prorrogação final de 72 °C para 1 min.
    7. Purifique os produtos PCR com uma enzima para degradar os primers PCs residuais e desfosforilar o excesso de dNTPs ou qualquer kit de limpeza de coluna. Continue sequenciando as amostras.
    8. Analise cada eletroferograma para a presença de picos duplos/bases ambíguas e ajuste as chamadas base manualmente em cada sequência usando o código base degenerado apropriado.
      NOTA: Esta etapa deve ser executada antes do alinhamento de sequência múltipla, pois é comum que o software de chamada base selecione o pico mais proeminente como a chamada base "verdadeira", dando a falsa impressão de uma ausência de SNPs.
    9. Execute um alinhamento de sequência múltipla usando o software de alinhamento, SeqMan Pro, listado na Tabela de Materiais ou outro software de alinhamento de código aberto, como ClustalW16 ou T-Coffee17.
      1. Abra o software de alinhamento | clique em Adicionar sequências | selecione as sequências desejadas e clique em Adicionar | uma vez que todas as sequências são escolhidas, clique em Done.
      2. Clique em Montar para executar o alinhamento. Para abrir o alinhamento, clique em Contig 1 e analise o alinhamento e identifique os SNPs (Figura 1).
        NOTA: Como alternativa às etapas 1.1.3-1.1.6, o PCR pode ser realizado a partir de DNA genômico isolado obtido a partir de amostras a granel (derivadas de indivíduos >10). Amplicons sequenciados podem ser analisados diretamente para a presença de SNPs que aparecem como picos duplos no eletroferograma, embora SNPs raros sejam mais difíceis de detectar.
    10. Projeto 3-5 rnas de guia único (sgRNAs), evitando regiões contendo qualquer SNP identificado acima, seguindo o protocolo descrito em 18.
  2. Design de primer HRMA
    1. Teste a sequência de exon para a possível formação de estruturas secundárias durante a PCR usando mFold19.
      1. Vá para o | do Servidor Web do UNAFold clique em mFold | no menu suspenso, clique em Aplicativos | Forma dobrável de DNA.
      2. Digite o nome da sequência na caixa e cole o exon.
      3. Alterar a temperatura dobrável para 60 °C; nas condições Iônicas, alterar [Mg++] para 1,5 e mudar unidades para mM; clique no DNA do Fold.
      4. Em Saída, abaixo Estrutura 1, clique em pdf para abrir os Lotes de Estrutura Circular.
    2. Vá para NCBI Blast - Primer Blast15 para design primer.
    3. Copie e cole a sequência de exon selecionada determinada pelo sequenciamento na etapa 1.1 (a sequência que contém o menor número de SNPs ou nenhum SNPs) na caixa na parte superior da página.
    4. Use o símbolo < > para marcar e excluir sequências que contenham SNPs, o local de destino e regiões com possível formação de estrutura secundária.
    5. Selecione o tamanho do produto PCR entre 80 e 150 bp e escolha o organismo.
      NOTA: Tamanhos de fragmentos maiores podem ser usados com sucesso (~300 bp). No entanto, amplicons mais longos podem diminuir a sensibilidade entre sequências diferentes em um ou apenas alguns pares de base.
    6. Clique em Obter Primers. Selecione 2-3 pares de primers a serem testados (idealmente, os sites primer estão ≥20-50 bp de qualquer local alvo CRISPR).
  3. Validação do primer
    1. Execute um PCR gradiente usando gDNA de um único indivíduo.
      1. Prepare uma mistura mestre e remova uma amostra para o controle não-modelo (NTC) em um tubo separado. Adicione o modelo à mistura principal restante e aliquot em uma placa de 96 poços.
      2. Siga os parâmetros de ciclismo: 98 °C 30 s, 34 ciclos de 98 °C para 10 s, 55-65 °C 30 s, 72 °C 15 s; prorrogação final de 72 °C para 10 min.
      3. Gerar perfis de derretimento térmico seguindo os parâmetros: etapa de desinaturação 95 °C por 1 min, ressarem 60 °C por 1 min, detecção de curva de derretimento entre 75 °C e 95 °C em incrementos de 0,2 °C, com tempo de espera de 10 s a cada temperatura.
        NOTA: Apenas temperaturas de resaramento com um único perfil de derretimento térmico devem ser usadas.
  4. Prossiga para gerar as linhas mutantes com injeções de embriões como descrito em 12.

2. Preparação de DNA genômico a partir de pernas de mosquito

  1. Separe os mosquitos G1 por sexo na fase pupal para que eles não acasalem antes da genotipagem, e certifique-se de que mosquitos de controle do tipo selvagem e combinados com a idade estarão disponíveis para serem usados para referências e backcrosses. Sexo-separá-los da mesma forma.
  2. Reúna os materiais necessários (Figura 2A) e prepare uma placa PCR de 96 poços com 0,5 μL do reagente de liberação de DNA e 20 μL de tampão de diluição (do kit de liberação gDNA) por indivíduo para ser genótipado (Figura 2B) e deixe-o no gelo. Reserve duas reações para ntc.
  3. Rotule uma bandeja para frascos de mosquito (frascos de Drosophila ) para que cada poço na placa de 96 corresponde ao respectivo frasco de mosquito na bandeja.
  4. Anestesiar os mosquitos G1 com CO2 e colocá-los em uma placa de vidro petri para mantê-los sedados (Figura 2C,D). Anestesiar e colocar 8 mosquitos selvagens em uma segunda placa de Petri.
  5. Limpe um par de pinças com 70% de etanol e remova uma das pernas traseiras do mosquito (Figura 2E,F).
  6. Submergir a perna na solução de reagente de liberação de DNA, colocar o mosquito no frasco correspondente e fechá-lo com uma esponja (Figura 2G,H).
  7. Limpe as pinças novamente com 70% de etanol e proceda com a remoção da perna do próximo mosquito. Repita as etapas 2.5-2.7 até que a placa de 96 poços esteja concluída.
    NOTA: É importante limpar a pinça com 70% de etanol. Isso minimiza a contaminação cruzada do DNA.
  8. Sele a placa com uma vedação óptica de placa PCR (Figura 2I) e incubar a placa de 96 poços contendo as pernas em temperatura ambiente (RT) por 2-5 min e depois a 98 °C por 2 min. Deixe a placa esfriar para RT durante o preparo da mistura PCR.
    NOTA: Todo o processo normalmente leva de 3 a 4 horas. Se os mosquitos devem ser mantidos nos frascos por mais tempo do que a duração esperada (especialmente ≥1 dia), coloque um pequeno pedaço de passa (ou fonte de açúcar e água) com cada mosquito para garantir a sobrevivência dos mosquitos durante incubações prolongadas.

3. HRMA

  1. Executar PCR.
    1. Prepare uma mistura mestre contendo os seguintes componentes por cada reação: 10 μL de tampão de 2x (do kit de liberação gDNA), 0,5 μM de cada primer, 1 μL de corante EvaGreen, 0,4 μL de polimerase (do kit de liberação gDNA) e completo a 19 μL com água de grau molecular.
    2. Usando um pipet multicanal, transfira 19 μL da mistura mestre em cada poço. Transferir 1 μL da solução de liberação de DNA contendo DNA de mosquito preparado na seção 2 para a placa (Figura 3A). Sele a placa com uma vedação óptica de placa PCR.
    3. Realize o PCR seguindo os parâmetros de ciclismo: 98 °C para 5 min, 39 ciclos de 98 °C para 10 s, a temperatura de ressarcial escolhida (72 °C) para 30 s; prorrogação final 72 °C por 2 min.
  2. Gerar perfis de derretimento térmico seguindo os parâmetros: etapa de desinaturação 95 °C por 1 min, ressarem 60 °C por 1 min, detecção de curva de derretimento entre 75 °C e 95 °C em incrementos de 0,2 °C, com tempo de espera de 10 s a cada temperatura. Consulte o Material Suplementar e a Figura Suplementar S1-S5 para obter uma descrição detalhada da configuração do software para execução do HRMA usando o sistema cfx96 em tempo real.
  3. Examine os perfis de derretimento (Figura 3B). Atribua controle de tipo selvagem ao cluster de referência.
    NOTA: O software (ver a Tabela de Materiais) normaliza automaticamente os dados e designa clusters com cores para diferentes curvas de fusão.
  4. Marque os diferentes clusters com cores correspondentes no modelo de 96 poços (Figura 3C).
  5. Selecione os indivíduos com curvas de interesse, remova-os dos tubos e backcross (Figura 3D). Alimentam as fêmeas acasaladas e coletam ovos G2 .

4. Verificação de sequência por sequenciamento Sanger

  1. Purifique o produto PCR dos poços com mosquitos selecionados (a partir da placa preparada na seção 3.1), utilizando uma enzima para degradar os primers de PCR residuais e desfosforilarar o excesso de dNTPs. Alternativamente, use qualquer kit de limpeza de coluna e proceda com o sequenciamento das amostras.
    NOTA: O sequenciamento direto pode ser mais desafiador quando o tamanho do produto PCR é pequeno (≤200 bp). Nesses casos, projete primers para amplificar fragmentos maiores que englobam o local alvo (≥250 bp) e amplificar por PCR usando o DNA na placa de 96 poços (etapa 2.2).
  2. Analisar e identificar os indels usando o software de visualização de rastreamento (Figura 4). Alternativamente, o software Poly Peak Parser20 pode ajudar a detectar a mutação em indivíduos heterozigosos.
    1. Acesse o site do Poly Peak Parser, selecione a sequência dos indivíduos mutantes no menu Procurar e copie e cole a sequência de referência na caixa.
      NOTA: O alinhamento entre o alelo alternativo e a referência aparecerá automaticamente no lado direito da tela.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mosquitos contendo mutações nos genes AaeZIP11 (transporte de ferro putativo21) e mio-fem (gene de miosina tendenciosa da fêmea relacionado aos músculos de voo13) foram obtidos utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9, genótipo usando HRMA e sequência verificada (Figura 5). As amostras mutantes Figura 5A e Figura 5C mostram a intensidade de fluorescência normalizada das curvas HRM das amostras mutantes de AaeZIP11 e mio-fem, respectivamente, juntamente com controles do tipo selvagem. As figuras 4B e Figura 4D mostram a ampliação das curvas de diferença (das amostras mutantes AaeZIP11 e myo-fem, respectivamente) entre os perfis de derretimento dos diferentes clusters atribuídos pelo software após subtrair cada curva da referência do tipo selvagem. Indivíduos heterozigosos e homozigos mutantes AaeZIP11 foram colocados em diferentes aglomerados e são facilmente distinguidos dos controles do tipo selvagem (Figura 5B). Os indivíduos mô-fem mutantes heterozigosos também são distintos dos controles (Figura 5D). Observe que dois clusters dentro dos controles do tipo selvagem estavam presentes em ambos os casos, provavelmente devido à presença de SNPs na região alvo (Figura 5), destacando a necessidade de usar múltiplas amostras de controle para evitar a categorização de controles como mutantes quando os SNPs não podem ser evitados.

A Figura 4A mostra a análise sequencial do mutante AaeZIP11 . O eletroferograma de AaeZIP11 mutantes heterozigosos indica a posição nucleotídea onde o indel ocorreu. Isso é representado por uma mudança de picos únicos para duplos, pois as posições polimórficas mostrarão ambos os nucleotídeos concomitantemente (Figura 4A). O número de pares de base excluídos ou inseridos foi calculado contando os picos únicos no final da execução (Figura 4B) como um dos fios de DNA será menor ou mais longo do que o outro pelo número de pares de base excluídos ou inseridos, respectivamente. Recomenda-se o uso de gDNA verificado por sequência dos mutantes como referência para a identificação das heterozygotes para ajudar nas análises do HRMA para as gerações subsequentes. A atribuição manual para as curvas pode ser necessária quando curvas semelhantes são automaticamente atribuídas a diferentes clusters. Isso pode ser feito comparando as curvas de mudança de temperatura e as curvas de diferença. O ajuste manual do software pode ser necessário para atribuir adequadamente amostras a clusters. Os resultados do HRMA de AaeZIP11 e de um mutante chamado Aeflightin mostram que análises de amostras individuais foram necessárias para categorizar com sucesso heterozygotes, homozygotes e trans-heterozygotes. Inicialmente, a atribuição automática de cluster do software não poderia fazer uma distinção adequada entre os grupos (Figura 6A, Figura 6C, Figura 6E e Figura 6G). Cada amostra foi então analisada individualmente e atribuída aos grupos corretos com base na similaridade com amostras de referência de heterozigotes, homozygotes e trans-heterozygotes (previamente verificadas por sequenciamento) (Figura 6B, Figura 6D, Figura 6F e Figura 6H).

Figure 1
Figura 1: Identificação do SNP. Representação esquemática do alinhamento de sequência múltipla do fragmento AaeZIP11 do tipo selvagem. Em vermelho estão os SNPs, e em verde estão os fragmentos livres de SNPs; esta região livre de SNP é sugerida para o design sgRNA e primer. Abreviaturas: SNP = polimorfismo de nucleotídeo único; sgRNA = RNA guia único; LVP = Tensão de Liverpool. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Procedimento experimental para obtenção de DNA genômico de pernas de mosquito para HRMA. (A) Materiais para obtenção de DNA genômico, incluindo pipetas, pontas, placa PCR, vedação óptica, reservatório, tampão de diluição e solução de liberação de DNA. (B) Preparação da placa PCR contendo reagente de liberação de DNA e tampão de diluição. (C) Anestesia de mosquitos com CO2. (D) Limpar a pinça com 70% de etanol para evitar contaminação entre as amostras. (E) Configuração experimental incluindo pinças, rack para frascos de mosquito, placa de Petri em cima de um recipiente de gelo com mosquitos anestesiados, e a placa PCR previamente preparada. (F) Remoção da perna do mosquito. (G) Visão de zoom da perna do mosquito sendo submersa na solução de reagente de liberação de DNA. (H) Mosquito único colocado no frasco. (I) Selar a placa PCR contendo as pernas do mosquito. Abreviação: HRMA = análise de derretimento de alta resolução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Procedimento experimental para análises de HRM. (A) Transferir o gDNA liberado para uma placa de 96 poços contendo a mistura PCR. (B) Inspeção visual das curvas de diferença. (C) Marcando cada amostra no modelo de 96 poços com a mesma cor da sua respectiva cor de curva de diferença. (D) Retroamendo os indivíduos do mesmo aglomerado. Abreviaturas: HRM = derretimento de alta resolução; gDNA = DNA genômico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise sequencial de um mutante AaeZIP11 . (A) Alinhamento nucleotídeo do mutante AaeZIP11Δ56. Traços destacados em amarelo são as bases excluídas. Na caixa, o eletroferograma passa de picos únicos para picos duplos, representando a posição onde ocorreu a exclusão (seta). (B) Eletroferograma do final da corrida de sequenciamento e da transição de picos duplos para picos únicos. Observe que o número de picos únicos representa o número de bases excluídas (retângulo cinza). As sequências de primer são fornecidas na Tabela Suplementar S1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: HRMA de DNA extraído de pernas de mosquito. O DNA foi extraído de uma única perna dos mosquitos AaeZIP11 (A e B) e myo-fem (C e D) e analisado pelo HRMA. A e C denotam os sinais de fluorescência normalizados das amostras a valores relativos de 1,0 a 0. B e D denotam a ampliação das diferenças de curva subtraindo cada curva da referência do tipo selvagem (tensão de Liverpool). Abreviaturas: HRMA = análise de derretimento de alta resolução; LVP = Tensão de Liverpool; RFU = unidades de fluorescência relativa. As sequências de primer são fornecidas na Tabela Suplementar S1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Exemplos de atribuições manuais de grupo. (A-D) HRMA para mutantes de Aeflightin. (A e C) As curvas de derretimento (curvas de escala linear normalizadas e curvas de diferença, respectivamente) são agrupadas automaticamente pelo Software de Análise de Derretimento de Precisão. (B) Normalização das curvas diferenciais alteradas manualmente. (D) Após alterar a normalização das curvas diferenciais, cada amostra foi atribuída individualmente pelas temperaturas máximas nas curvas de diferença para controles positivos correspondentes (amostras anteriormente sequenciadas identificadas por heterozygotes Δ4 e Δ5 e Δ4Δ5 trans-heterozygotes), permitindo a identificação clara dos 3 grupos. Setas vermelhas e marrons são adicionadas para destacar os picos em diferentes temperaturas. (E-H) HRMA para mutantes AaeZIP11. (E e G) As curvas de derretimento são automaticamente atribuídas pelo software. (F e H) Mutantes na segunda auto-cruz heterozigagous foram apropriadamente atribuídos aos grupos corretos pela semelhança das curvas normalizadas e de diferença com referências previamente determinadas (codificadas por cores em curvas). Heterozygotes asg, Homozygotes asg e Trans-heterozygotes asg: curvas de derretimento atribuídas pelo Software de Análise de Derretimento de Precisão. Abreviaturas: HRMA = análise de derretimento de alta resolução; LVP = Tensão de Liverpool; RFU = unidades de fluorescência relativa. As sequências de primer são fornecidas na Tabela Suplementar S1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Material Suplementar: Protocolo detalhado para configurar o HRMA no Sistema em Tempo Real CFX96 (por exemplo, Bio-rad). Por favor, clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S1: Instruções passo a passo para configurar o protocolo de ciclismo no Gerenciador CFX Bio-rad. Consulte Material Suplementar 2.1-2.3. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S2: Instruções passo a passo para uma configuração de placa no Gerenciador CFX Bio-rad. Consulte Material Suplementar 3.1-3.4. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S3: Instruções passo a passo para uma configuração de placa no Gerenciador CFX Bio-rad. Consulte Material Suplementar 3.5-3.6. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S4: Instruções passo a passo para a configuração de execução no Gerenciador CFX Bio-rad. Consulte Material Suplementar 4.1. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S5: Instruções passo a passo para análise de HRMA no Gerenciador CFX Bio-rad. Consulte Material Suplementar 5.1-5.3. Abreviação: HRMA = análise de derretimento de alta resolução. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Tabela Suplementar S1: Lista de primers. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A análise de derretimento de alta resolução oferece uma solução simples e rápida para a identificação de indels gerados pela tecnologia CRISPR/Cas9 no mosquito vetor Ae. aegypti. Ele fornece flexibilidade, permitindo a genotipagem de mosquitos mutados para uma ampla gama de genes, desde o músculo de voo até o metabolismo do ferro e mais 13,14. O HRMA pode ser realizado em apenas algumas horas, desde a coleta de amostras até as análises finais. Tempo adicional é necessário para o projeto de primer e também dependerá do tempo para receber quaisquer resultados necessários de sequenciamento (para identificação dos SNPs), análises de sequência e encomenda de primer.

O protocolo aqui apresentado detalha os métodos passo a passo para análises bem sucedidas. Uma das etapas mais críticas nesse processo é o design adequado dos primers. O HRMA é suficientemente sensível de que a presença de um único SNP dentro do fragmento amplificado pode resultar em uma forte curva de diferença que poderia ser mal interpretada como uma mutação. O sequenciamento de amostras de colônias laboratoriais antes da mutagênese CRISPR permite a detecção e prevenção de regiões ricas em SNP ao projetar o alvo; os primers hrma ajudarão a prevenir esse problema. Projetar primers para pequenos amplificadores (70-100 bp) também pode melhorar a sensibilidade e a reprodutibilidade do experimento, pois fragmentos maiores podem apresentar vários domínios de fusão, diminuindo a chance de distinguir variantes22. Uma limitação da técnica é que evitar completamente os SNPs pode não ser viável dependendo do gene; assim, o sequenciamento e o uso adicional de múltiplos indivíduos de controle do tipo selvagem podem auxiliar nas análises.

Especificamente para este protocolo, é importante manter vivos mosquitos genótipos para que possam ser cruzados para o estabelecimento de linhas mutantes. Remover uma das pernas do mosquito para extrair gDNA pode ser a maneira menos invasiva de conseguir isso; no entanto, a quantidade de gDNA recuperada deste tecido é mínima. O kit sugerido na Tabela de Materiais foi suficiente para a obtenção de DNA de uma perna de mosquito e a realização do PCR para completar o HRMA.

O HRMA pode oferecer mais flexibilidade em termos de detecção de uma ampla gama de tamanhos indel, variando de incompatibilidades de base única a múltiplos pares de base (AaeZIP11 teve uma exclusão de 56 bp) e métodos de superação, como o SNA ou OT7E1 (ambos ensaios de decote incompatíveis enzimáticos) que estão limitados a incompatibilidades de base única ou pequenas exclusões (~20 bp)5, Dia 23. Além disso, o SNA não detecta mutantes homozigos, pois os produtos PCR não contêm incompatibilidades. Além disso, os resultados de SNA também podem ser mascarados por polimorfismos alólicos que ocorrem naturalmente quando os produtos PCR tratados por nuclease têm um comprimento semelhante ao alelo mutante. Nenhuma dessas limitações é aplicável ao HRMA. Em última análise, o sequenciamento é necessário para identificar a sequência de DNA mutante. No entanto, uma vez que uma mutação em questão é conhecida, o HRMA usado para a identificação de indivíduos mutantes é muito mais rápido do que o sequenciamento direto. Este método preserva amostras valiosas (mais mosquitos sobreviverão, menos eles terão que esperar pelos resultados de seu genótipo) e reduz a necessidade de sequenciamento de um grande número de amostras, diminuindo o custo total do experimento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Acknowledgments

Todos os números foram criados com Biorender.com sob licença para a Texas A&M University. Este trabalho foi apoiado por fundos do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (AI137112 e AI115138 a Z.N.A.), Texas A&M AgriLife Research sob o Insect Vectored Disease Grant Program, e o UsDA National Institute of Food and Agriculture, projeto Hatch 1018401.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol 70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates VWR 82006-636 For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96 Bio Rad PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs VWR 490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit New England Biolabs E1050S
Glass Petri Dish VWR 89001-246 150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates Bio-rad HSP9665 For HRMA
Multi-channel pipettor (P10) Integra Biosciences 4721
Multi-channel pipettor (P300) Integra Biosciences 4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific VWR 37000-548 To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape Bio-rad 2239444 To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) Thermo Fisher F140WH For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers Genesee 59-128W
Precision Melt Analysis Software Bio Rad 1845025 Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro DNAstar Lasergene software For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm WPI 14098
White foam plugs VWR 60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene Genesee 32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue Genesee 59-164B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , Report No. 978 160 (2009).
  2. WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
  3. WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
  4. WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020).
  5. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  6. Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
  7. Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
  8. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
  9. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  10. Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
  11. Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
  12. Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
  13. O'Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
  14. Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
  15. Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  16. Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
  17. Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
  18. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
  19. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  20. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  21. Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
  22. Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
  23. Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).

Tags

Genética Edição 175
Detecção indel seguindo CRISPR/Cas9 Mutagenesis usando análise de derretimento de alta resolução no mosquito <em>Aedes aegypti</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes,… More

Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes, E., O'Leary, S., Adelman, Z. N. Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (175), e63008, doi:10.3791/63008 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter