Summary
Модифицированная процедура постфиксации увеличивает контраст частиц гликогена в ткани. В этой статье представлен пошаговый протокол, описывающий, как обращаться с тканью, проводить визуализацию и использовать стереологические методы для получения объективных и количественных данных о распределении субклеточного гликогена в скелетных мышцах.
Abstract
С помощью просвечивающей электронной микроскопии можно получить изображения с высоким разрешением неподвижных образцов, содержащих отдельные мышечные волокна. Это позволяет количественно оценивать ультраструктурные аспекты, такие как объемные фракции, отношение площади поверхности к объему, морфометрия и физические контакты различных субклеточных структур. В 1970-х годах был разработан протокол усиленного окрашивания гликогена в клетках, который проложил путь для серии исследований субклеточной локализации гликогена и размера частиц гликогена с использованием просвечивающей электронной микроскопии. В то время как большинство анализов интерпретируют гликоген так, как если бы он равномерно распределялся внутри мышечных волокон, обеспечивая только одно значение (например, среднюю концентрацию), просвечивающая электронная микроскопия показала, что гликоген хранится в виде дискретных частиц гликогена, расположенных в отдельных субклеточных компартментах. Здесь описан пошаговый протокол от сбора тканей до количественного определения объемной фракции и диаметра частиц гликогена в отдельных субклеточных компартментах отдельных волокон скелетных мышц. Включены соображения о том, как 1) собирать и окрашивать образцы тканей, 2) выполнять анализ изображений и обработку данных, 3) оценивать точность оценок, 4) различать типы мышечных волокон и 5) методологические подводные камни и ограничения.
Introduction
Частицы гликогена состоят из разветвленных полимеров глюкозы и различных связанных с ней белков1 и являются важным топливом во время высоких метаболических потребностей2. Хотя частицы гликогена не получили широкого признания, они также представляют собой местное топливо, где некоторые субклеточные процессы преимущественно используют гликоген, несмотря на наличие других и более долговечных видов топлива, таких как глюкоза плазмы и жирные кислоты3,4.
Важность хранения гликогена в качестве субклеточного специфического локализованного топлива обсуждалась в нескольких обзорах5,6, в основном на основе некоторых из самых ранних документов о субклеточном распределении гликогена с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ)7,8. В первых исследованиях использовались различные протоколы для увеличения контраста гликогена от методов гистохимического окрашивания к отрицательным и положительным окрашиваниям9,10. Важной методологической разработкой стал уточненный протокол постфиксации с ферроцианидом калия-восстановленным осмием11,12,13,14, что значительно улучшило контраст частиц гликогена. Этот усовершенствованный протокол не использовался в некоторых новаторских работах по истощению гликогена, вызванному физическими упражнениями15, но был вновь введен Грэмом и его коллегами16,17.
Основываясь на 2-мерных изображениях, субклеточное распределение гликогена чаще всего описывается как частицы гликогена, расположенные в трех бассейнах: субсарколеммальном (прямо под поверхностной мембраной), интермиофибриллярном (между миофибриллами) или интрамиофибриллярном (в пределах миофибрилл). Однако частицы гликогена также могут быть описаны как связанные, например, с саркоплазматическим ретикулумом7 или ядрами18. В дополнение к субклеточному распределению, преимущество предполагаемого содержания гликогена, оцениваемого ТЕА, также заключается в том, что количественная оценка может проводиться на уровне одного волокна. Это позволяет исследовать изменчивость волокна к волокну и коррелятивный анализ с типами волокон и клеточными компонентами, такими как митохондрии и капли липидов.
Здесь описан протокол оценки ТЭМ типоспецифического объемного содержания трех общих субклеточных пулов гликогена (субсарколеммального, интермиофибриллярного и интрамиофибриллярного) в скелетных мышечных волокнах. Метод был применен к скелетным мышцам человека19, крыс20 и мышей21; а также птицы и рыбы22; и кардиомиоциты крыс23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Настоящий протокол с использованием образцов скелетных мышц человека с биопсией был одобрен Региональными комитетами по этике исследований в области здравоохранения для Южной Дании (S-20170198). Биопсию мышц получали через разрез в коже из мышцы vastus lateralis с использованием иглы Bergström с отсасыванием после подкожного введения местной анестезии (1-3 мл лидокаина 2% на разрез). Если использовались изолированные целые мышцы крысы, животных приносили в жертву при вывихе шейки матки до получения биопсии мышц в соответствии с руководящими принципами комитета по этике животных в университетской больнице Оденсе, Дания.
1. Первичная фиксация, постфиксация, встраивание, секционирование и контрастирование
- Готовят 1,6 мл первичного фиксирующего раствора (2,5% глутарового альдегида в буфере какодилата натрия 0,1 М (рН 7,3)) в микроцентрифугирующей трубке объемом 2 мл. Храните при температуре 5 °C в течение максимум 14 дней.
- Из биопсии мышцы или всей мышцы выделяют небольшой образец, который имеет максимальный диаметр 1 мм в любом направлении и немного длиннее в направлении продольного волокна, чем в поперечном сечении (для целей ориентации).
- Поместите образец в трубку, содержащую холодный раствор первичной фиксации. Хранить при температуре 5 °C в течение 24 ч.
- Промыть образец четыре раза (15 мин между каждой промывкой) в буфере какодилата натрия 0,1 М (рН 7,3). Используя переносные пипетки, извлеките использованный буфер из трубки, оставив образец нетронутым, а затем добавьте свежий буфер.
ПРИМЕЧАНИЕ: После окончательной промывки образец можно хранить в буфере какодилата натрия 0,1 М при 5 °C в течение нескольких месяцев11. Здесь протокол можно приостановить. - Постфикс с 1% тетроксида осмия (OsO4) и 1,5% ферроцианида калия (K4Fe(CN)6) в буфере 0,1 М какодилата натрия (рН 7,3) в течение 120 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 1,5% ферроцианида калия (K4Fe(CN)6) необходимо для оптимального контраста частиц гликогена11,12,13. - Дважды промыть в двухдистиллированной воде комнатной температуры (RT).
- Обезвоживание путем погружения в градуированную серию спирта (этанола) в РТ используют следующие концентрации: 70% (10 мин), 70% (10 мин), 95% (10 мин), 100% (10 мин) и 100% (10 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: На каждой стадии образец погружают в этанол, который впоследствии удаляется только частично, чтобы избежать высыхания образца. Наконец, оставшийся этанол выбрасывается. - Инфильтрировать градуированными смесями оксида пропилена и эпоссидной смолы на РТ используют следующие объемные соотношения (оксид пропилена/эпоссидная смола): 1/0 (10 мин), 1/0 (10 мин), 3/1 (45 мин), 1/1 (45 мин), 1/3 (45 мин), 0/1 (на ночь). На следующий день встраивают образцы в 100% свежую эпоссидную смолу в формы и полимеризуют при 60 °C в течение 48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот градуированный метод соответствует предыдущим протоколам11,12. Здесь протокол можно приостановить. - Вырежьте ультратонкие (60-70 нм) срезы продольно ориентированных волокон и соберите их на одноотвершинных медных сетках следующим образом.
- Установите блок образца на держатель ультрамикротома.
- Обрежьте блок на поверхности лезвием бритвы, чтобы достичь уровня ткани.
- Установите алмазный нож (ультрагранка 45) перед образцом и выровняйте поверхность образца параллельно ножу.
- Изготовьте полутонкий (1 мкм) участок алмазным ножом для проверки ориентации образца. Окрашивание полутонкого сечения толуидиновым синим цветом для наблюдения с помощью световой микроскопии.
- Обрежьте блок дальше, чтобы уменьшить интересующую область, чтобы получить правильные ультратонкие участки.
- Огранка ультратонких (60-70 нм) секций вторым алмазным ножом (ультрагранка 45).
- Соберите 1-2 секции на одноотщенных медных сетках с помощью Perfect Loop.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одностворчатая медная сетка имеет одно отверстие посередине с поддерживающей мембраной Formvar.
- Контрастные срезы с уранилацетатом и свинцовым цитратом путем погружения вышеуказанных решеток в раствор уранилацетата (0,5% в двухдистиллированную воду) на 20 мин, а затем в раствор цитрата свинца (1% в двухдистиллированную воду) на 15 мин. Вымойте сетки в двойной дистиллированной воде между и после двух пятен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
2. Визуализация
- Включите просвечивающий электронный микроскоп (работающий при ускоряющем напряжении 80 кВ), компьютер и программное обеспечение для записи изображений. Записывайте цифровые изображения с помощью цифровой ПЗС-камеры с медленным сканированием 2 k x 2 k и соответствующего программного обеспечения для обработки изображений.
- Вставьте сетку с несколькими секциями в стадию микроскопа.
- Экран сетки изначально при небольшом увеличении (например, x100) для определения качества секций (т.е. отверстий в несущей мембране, мусора и т.д.) и выбора наиболее качественных секций. При малом увеличении определяют направление мышечных волокон.
- Затем увеличьте увеличение с помощью луча, центрированного на периферийном волокне в сечении. Сфокусируйте изображение с увеличением выше 30 k, чтобы обеспечить достаточную детализацию изображения, руководствуясь быстрым преобразованием Фурье в реальном времени, если оно доступно. Наконец, записывайте изображения со временем экспозиции 1 с при нужном увеличении.
- Получите в общей сложности 24 изображения случайно выбранного волокна, то есть 12 изображений миофибриллярного пространства и 12 изображений субсарколеммального пространства, с увеличением от 10 k до 40 k. Убедитесь, что изображения распределены по длине и ширине волокна в рандомизированном, но систематическом порядке для получения объективных результатов (рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное увеличение зависит от доступного разрешения камеры и размера микроснимков. Цель состоит в том, чтобы достичь окончательного разрешения, при котором диаметры частиц гликогена могут быть измерены в пределах 1 нм шагов, и включить общую площадь миофибриллярной области по меньшей мере 70 мкм2 и общую длину волокна по меньшей мере 25 мкм, распределенных на 12 изображений миофибриллярного пространства и 12 изображений субсарколеммального пространства на волокно, соответственно. 24 изображения на волокно, скорее всего, дадут точность (коэффициент погрешности) объемного содержания различных пулов гликогена между 0,1 и 0,2 в отдельных волокнах скелетных мышц человека, крысы и мышей20,21,24 (рисунок 2E). - Повторяйте шаги 2.4 и 2.5 до тех пор, пока не будет получено изображение в общей сложности 6-10 волокон. При необходимости вырежьте дополнительные участки (разделенные не менее чем 150 мкм, чтобы избежать перекрытия уже изображенных волокон) и повторите шаги 1,9-2,5.
3. Анализ изображений
- Импортируйте изображения в ImageJ, щелкнув Файл > Открыть.
- Установите глобальный масштаб в соответствии с исходным размером изображения, щелкнув Анализ > Задать масштаб.
- Увеличьте масштаб на 100%, нажав на Image > Zoom > In.
- Измерьте толщину одного Z-диска на изображение миофибриллярного пространства (12 на волокно) с помощью инструмента «Прямая линия » из меню «Инструменты» (рисунок 1D). Рассчитайте среднюю толщину Z-диска каждого из 6-10 волокон.
- Определите 2-3 волокна с самым толстым средним Z-диском как волокна типа 1 и 2-3 волокна с самым тонким средним Z-диском как волокна типа 2. Не обращайте внимания на промежуточные 2-4 волокна для дальнейшего анализа (рисунок 1Е).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги повторяются для каждого из 4-6 волокон из образца. Объемные фракции гликогена оцениваются по точечному подсчету, как описано в другом месте25,26. Размер сетки выбирается для получения удовлетворительно высокой точности оценок. Это часто получается путем достижения 250 попаданий, которые затем диктуют общее количество необходимых очков и, в свою очередь, площадь на очко. - Используйте инструмент «Сегментированная линия » для измерения длины самой внешней миофибрюли, видимой чуть ниже субсарколеммальной области (рисунок 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта длина используется для экспрессии субсарколеммального гликогена на площадь поверхности (т.е. длина самого внешнего миофибриллы, умноженная на толщину сечения (60 нм); см. шаг 4.5). Поэтому в анализ включается только субсарколеммальная область, которая представлена этой длиной. - Вставьте сетку, щелкнув Инструменты анализа > > сетку и установите площадь на точку на уровне 32 400 нм2. Подсчитайте количество попаданий в пределах доступной длины на 12 субсарколеммальных изображениях, где крест попадает в субсарколеммальный гликоген (рисунок 2А). Удар определяется как частица гликогена, присутствующая в правом верхнем углу креста.
- Вставьте сетку, щелкнув Анализ > инструменты > сетку и установите площадь на точку на 160 000 нм2. Подсчитайте количество попаданий на 12 миофибриллярных изображениях, где крест попадает во внутримиофибриллярное пространство (рисунок 2B).
- Вставьте сетку, щелкнув Анализ > инструменты > сетке и установите площадь на точку на уровне 3 600 нм2. Подсчитайте количество попаданий на 12 миофибриллярных снимках, где крест попадает на интрамиофибриллярный гликоген (рисунок 2С).
- Вставьте сетку, щелкнув Анализ > Инструменты > Сетка и установите площадь на точку на 32 400 нм2. Подсчитайте количество попаданий на 12 миофибриллярных снимках, где крест попадает в межмиофибриллярный гликоген (рисунок 2D).
- Используя инструмент Straight Line , измерьте диаметр пяти случайно выбранных частиц гликогена каждого пула для каждого из 12 изображений, чтобы получить в среднем 60 частиц на пул на волокно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее значение в 60 частиц в значительной степени покрывает вариации внутри волокна (рисунок 2F).
4. Расчеты
- Вычислите кажущуюся долю площади (АА) интрамиофибриллярного пространства на миофибриллярное пространство как сумму всех попаданий, деленную на сумму всех точек из 12 изображений (из шага 3.8).
- Рассчитайте долю видимой площади интрамиофибриллярного гликогена на миофибриллярную область, межмиофибриллярного гликогена на миофибриллярную область и субсарколеммального гликогена на площадь изображения как сумму всех попаданий, деленную на сумму всех точек из 12 изображений (из шагов 3.7, 3.9 и 3.10).
- Рассчитать объемную долю (VV) интрамиофибриллярного, межмиофибриллярного и субсарколеммального гликогена соответственно как кажущуюся долю площади (АА) минус произведение поверхностной плотности (SV) с толщиной сечения (t), где поверхностная плотность — числовая плотность частиц, умноженная на среднюю поверхность частиц:
Vv = AA - (1 / 4) · Св · t
где
Sv (мкм-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (т + Н))
t = 0,06 мкм
H = средний диаметр частиц (мкм)
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемная доля меньше кажущейся доли площади из-за вклада колпачков частиц с их центром за пределами среза25. - Для экспрессии интрамиофибриллярного гликогена на интрамиофибриллярное пространство делят площадь фракции интрамиофибриллярного гликогена (стадия 4.2) на площадь фракции интрамиофибриллярного пространства (стадия 4.1). Межмиофибриллярный гликоген экспрессируют на миофибриллярное пространство, как рассчитано на предыдущем этапе (этап 4.3).
- Для экспрессии субсарколеммального гликогена на площадь поверхности волокна (VS) (самый внешний миофибрил) преобразуют объемную долю гликогена в абсолютное количество путем умножения на объем изображения (произведение площади и толщины сечения) и деления на произведение средней доступной длины (из стадии 3.6) на толщину сечения (t).
- Оцените общее объемное содержание гликогена, используя значения шагов 4.1, 4.4 и 4.5 следующим образом:
Миофибриллярный гликоген = Интермиофибриллярный гликоген + (интрамиофибриллярный гликоген · площадь фракции интрамиофибриллярного пространства)
Предполагая, что средний радиус волокна составляет 40 мкм27, отношение объема к поверхности составляет 20:1, поэтому общий гликоген составляет:
Общий гликоген (VV) = Миофибриллярный гликоген + (субсарколеммальный гликоген (VS) / 20)
ПРИМЕЧАНИЕ: Отношение объема к поверхности 20:1 может варьироваться от волокна к волокну в зависимости от фактического размера волокна и размера субсарколеммальной области. Это не учитывается в настоящем протоколе. - Исходя из этого, относительный вклад каждого пула рассчитывается как доли общего гликогена:
Межмиофибриллярный гликоген / Общий гликоген = Межмиофибриллярный гликоген / Общий гликоген
Интрамиофибриллярный гликоген / Общий гликоген = (Интрамиофибриллярный гликоген · площадь фракции интрамиофибриллярного пространства) / Общий гликоген
Субсарколеммальный гликоген / Общий гликоген = Субсарколеммальный гликоген / 20 / Общий гликоген - Для каждого пула гликогена рассчитайте коэффициент погрешности (CE), который выражает неопределенность оценки гликогена на уровне волокон, основываясь на количестве изображений (n), общем количестве крестов на каждом изображении (x) и количестве крестов, попадающих на гликоген в соответствующем пуле на каждом изображении (y), следующим образом28:
CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑г) -2 - 2∑(xy) · ∑х-1 · ∑-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол, частицы гликогена выглядят черными и отчетливыми (рисунки 1 и 2). Нормальные значения гликогена изображены на рисунке 3. Эти данные основаны в общей сложности на 362 волокнах от 41 здорового молодого человека, собранных в различных предыдущих исследованиях19,24,29,30,31. Здесь видно, что значения межмиофибриллярного гликогена распределены близко к норме, тогда как как внутримиофибриллярный, так и субсарколеммальный гликоген показывают искаженное распределение, где волокна иногда имеют чрезмерное количество гликогена. Важно отметить, что в мышечном волокне нормального размера (диаметр 60-80 мкм) межмиофибриллярный гликоген является самым большим пулом, составляющим около 80% от общего содержания гликогена. Интрамиофибриллярный и субсарколеммальный гликоген составляют около 10% от общего содержания.
Рисунок 1: Визуализация и типирование волокон. (A) Каждое волокно визуализируется в рандомизированном систематическом порядке. (B) Пример изображения из субсарколеммального пространства. (C) Пример изображения из миофибриллярного пространства. (D) В каждом миофибриллярном изображении измеряется ширина одного Z-диска (красные линии). Измерения в общей сложности 12 Z-дисков (по одному на изображение) дают коэффициент погрешности приблизительно 0,03. (E) Типичное распределение среднего волокна по ширине Z-диска в 6-10 волокнах каждой из 10 биопсий. Из каждой биопсии 2-3 волокна определяются как типы 1 и 2 на основе распределения внутри биопсии. Изображения происходят из биопсии m. vastus lateralis пауэрлифтера, включенного в предыдущее исследование29. m: митохондрии и Z: Z-диск. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ гликогена. (A) Объем субсарколеммального гликогена на площадь поверхности оценивается путем подсчета точек с использованием размера сетки 180 нм х 180 нм в области, определяемой длиной самой внешней миофибрильной и субсарколеммальной области, перпендикулярной этой длине (синие пунктирные линии). (B) Миофибриллярная объемная доля оценивается путем подсчета точек с использованием сетки размером 400 нм x 400 нм. (C) Объемная доля интрамиофибриллярного гликогена оценивается путем подсчета точек с использованием сетки размером 60 нм x 60 нм. (D) Объемная доля интермиофибриллярного гликогена оценивается путем подсчета точек с использованием сетки размером 180 нм x 180 нм. В A-D красные круги указывают на попадания (крест, который ударяет частицу гликогена). (E) Расчетный коэффициент погрешности для оценки стереологического соотношения24 для 2-12 анализируемых изображений. Коэффициент погрешности оценивается на основе количества подсчетов и, следовательно, варьируется между образцами в зависимости от концентрации гликогена. Он часто относительно низок, когда содержание гликогена высокое, и наоборот. (F) Коэффициент изменения диаметра частиц гликогена после измерения 2-99 частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Нормальные значения трех субклеточных пулов гликогена в скелетных мышцах. Скрипичные сюжеты основаны на 362 волокнах от 41 здорового юноши (18-39 лет). Волокна происходят из предыдущих исследований, в которых были получены биопсии из m. vastus lateralis в состоянии покоя или контроля19,24,29,30,31. Значения отображаются в виде прямоугольного графика с маркером для медианы и прямоугольником, указывающим межквартильный диапазон. Линии представляют верхние и нижние смежные значения. Квадраты накладываются графиками плотности ядра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критическим этапом метода является использование восстановленного осмия ферроцианидом калия во время постфиксации. Селективность этого модифицированного фиксатора для обнаружения гликогена не может быть полностью объяснена химией, но также включает экспериментальные результаты, демонстрирующие отсутствие обнаружения таких частиц в тканях, которые, как известно, свободны от гликогена, или во внеклеточном пространстве11.
Критическими параметрами являются точность оценок и вариация волокна к волокну. Следуя настоящему протоколу для визуализации, получается коэффициент погрешности между 0,1 и 0,2 оценок различных пулов гликогена на волокно. Этот уровень погрешности значительно ниже вариации между отдельными волокнами (рисунок 3). Рекомендуется сообщать такие точные оценки при оценке объемного содержания гликогена. Представленный метод типирования волокон валидирован на соответствие изоформе миозина АТФазы29. Толщина Z-диска и митохондриальная объемная фракция также могут быть использованы в комбинации для обозначения типа волокна, но не только митохондриальной объемной фракции32.
Основными ограничениями способа являются неспособность обнаружить очень маленькие частицы гликогена и то, что профили частиц гликогена могут перекрываться на проецируемом изображении28. Первое ограничение делает недействительной истинную меру среднего размера частиц. Это становится серьезным смещением, когда частицы гликогена разлагаются во время высоких метаболических требований, тогда как смещение может быть незначительным, когда частицы гликогена растут от среднего до большего размера во время ресинтеза гликогена или суперкомпенсации. Хотя это может иметь огромные последствия для оценки среднего размера частиц гликогена при низких уровнях гликогена, оценки объемных концентраций гликогена являются надежными, поскольку небольшие, ненаблюдаемые частицы гликогена вносят очень небольшой вклад в общее содержание гликогена. Второе ограничение исходит из состояния, когда частицы гликогена намного меньше толщины срезов. Это смещение в основном присутствует при очень высоких концентрациях гликогена и может быть исследовано путем сравнения объемных фракций гликогена секций с различной толщиной. Если более толстый участок не параллельен высокой объемной фракции гликогена, это должно быть связано с недооценкой из-за большего количества перекрывающихся частиц в самом толстом участке. В предыдущих исследованиях объемная фракция гликогена коррелирует с концентрацией гликогена в диапазоне от 50 до 600 ммоль кг dw-1 , что указывает на отсутствие выраженного перекрытия частиц. Однако, если концентрация гликогена увеличивается выше этого уровня, увеличения межмиофибриллярного гликогена, что указывает на перекрытие33. Это может быть решено путем экстраполяции взаимосвязи между объемной фракцией гликогена и концентрацией при более низких концентрациях гликогена.
Основываясь на разрешении нм, предоставляемом TEM, этот протокол в настоящее время является единственным методом оценки субклеточного распределения гликогена. Кроме того, методология также допускает крупномасштабный количественный подход (как описано здесь), где количественные значения могут быть получены на уровне одного волокна. Это имеет огромное значение в скелетных мышцах с высокой гетерогенностью в наборе волокон во время различных видов упражнений2, где гликоген-зависимые механизмы усталости возникают только в некоторых волокнах. Метод также имеет потенциал для других возбудимых тканей в качестве кардиомиоцитов, где гликоген, как известно, необходим для нормальной работы сердца и критичен во время ишемии23,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Шведским олимпийским комитетом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H.
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , Academic Press. London. (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, American Physiological Society. Bethesda, MD. 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , Bios Scientific Publishers. Oxford. (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
