Summary
Artiklen forklarer, hvordan man kirurgisk fjerner øjne fra levende zebrafisklarver som det første skridt i retning af at undersøge, hvordan retinal input påvirker optisk tektumvækst og udvikling. Derudover giver artiklen information om larveanæstetisering, fiksering og hjernedissektion efterfulgt af immunohistokemi og konfokal billeddannelse.
Abstract
Zebrafisk udviser bemærkelsesværdig livslang vækst og regenerative evner. For eksempel understøtter specialiserede stamcellenicher etableret under embryogenese kontinuerlig vækst af hele det visuelle system, både i øjet og hjernen. Koordineret vækst mellem nethinden og det optiske tektum sikrer nøjagtig retinotopisk kortlægning, da nye neuroner tilføjes i øjnene og hjernen. For at imødegå, om retinale axoner giver afgørende information til regulering af tektal stamme og stamcelleadfærd såsom overlevelse, proliferation og / eller differentiering, er det nødvendigt at kunne sammenligne innerverede og denerverede tektale lobes inden for det samme dyr og på tværs af dyr.
Kirurgisk fjernelse af det ene øje fra levende larvezebrafisk efterfulgt af observation af det optiske tektum opnår dette mål. Den ledsagende video viser, hvordan man anæstetiserer larver, elektrolytisk skærper wolframnåle og bruger dem til at fjerne det ene øje. Det næste viser, hvordan man dissekerer hjerner fra faste zebrafisklarver. Endelig giver videoen et overblik over protokollen for immunhistokemi og en demonstration af, hvordan man monterer farvede embryoner i lavsmeltepunktsalgarose til mikroskopi.
Introduction
Målet med denne metode er at undersøge, hvordan retinal input påvirker væksten og udviklingen af det optiske tektum, det visuelle behandlingscenter i zebrafiskens hjerne. Ved at fjerne det ene øje og derefter sammenligne de to sider af det optiske tektum kan tektale ændringer inden for den samme prøve observeres og normaliseres, hvilket muliggør sammenligning på tværs af flere prøver. Moderne molekylære tilgange kombineret med denne teknik vil give indsigt i de mekanismer, der ligger til grund for visuel systemvækst og udvikling, samt aksonal degeneration og regenerering.
Sensoriske systemer - visuelle, auditive og somatosensoriske - indsamler information fra eksterne organer og videresender disse oplysninger til centralnervesystemet og genererer "kort" over den ydre verden på tværs af midterhjernen 1,2. Vision er den dominerende sensoriske modalitet for næsten alle hvirveldyr, herunder mange fisk. Nethinden, det neurale væv i øjet, samler information med et neuronalt kredsløb, der primært består af fotoreceptorer, bipolære celler og retinale ganglionceller (RGC'er), nethindens projektionsneuroner. RGC'er har lange axoner, der finder vej over nethindens indre overflade til det optiske nervehoved, hvor de fascikulerer og rejser sammen gennem hjernen og i sidste ende slutter i det visuelle behandlingscenter i den dorsale midterhjerne. Denne struktur kaldes det optiske tektum hos fisk og andre ikke-pattedyrs hvirveldyr og er homologt med den overlegne colliculus hos pattedyr3.
Det optiske tectum er en bilateralt symmetrisk flerlags struktur i den dorsale midterhjerne. I zebrafisk og de fleste andre fisk modtager hver lap af det optiske tectum udelukkende visuelt input fra det kontralaterale øje, således at den venstre optiske nerve slutter i højre tektale lap og den højre optiske nerve slutter i venstre tektale lap4 (figur 1). Ligesom sin pattedyrs modstykke, den overlegne colliculus, integrerer det optiske tectum visuel information med andre sensoriske input, herunder audition og somatosensation, der styrer skift i visuel opmærksomhed og øjenbevægelser såsom saccader 1,5,6. I modsætning til pattedyrets overlegne colliculus genererer det optiske tectum kontinuerligt nye neuroner og glia fra en specialiseret stamcelleniche nær de mediale og kaudale kanter af de tektale lobes kaldet den tektale proliferationszone7. Vedligeholdelse af proliferative forfædre i det optiske tektum og andre regioner i centralnervesystemet bidrager til dels til den bemærkelsesværdige regenerative kapacitet, der er dokumenteret i zebrafisk8.
Tidligere arbejde med at undersøge hjernen hos blinde eller enøjede fisk afslørede, at optisk tektumstørrelse er direkte proportional med mængden af retinal innervering, den modtager 9,10,11. Hos voksne hulefisk, hvis øjne degenererer i tidlig embryogenese, er det optiske tektum mærkbart mindre end for nært beslægtede, seende overfladefisk9. Cave fisk øjendegeneration kan blokeres ved at erstatte den endogene linse med en linse fra en overfladefisk under embryogenese. Når disse enøjede hulefisk opdrættes til voksenalderen, indeholder den innerverede tektale lap ca. 10% flere celler end den ikke-innerverede tektale lap9. På samme måde var siden af tektumet med mere innervering større og indeholdt flere neuroner10 i larve killifish, der blev inkuberet med kemiske behandlinger for at generere øjne af forskellig størrelse inden for det samme individ. Beviser fra optiske nerveknusningsforsøg i voksne guldfisk indikerer, at innervering fremmer spredning, hvor tektal celleproliferation falder, når innervation blev forstyrret11.
Ved at bekræfte og udvide disse klassiske undersøgelser giver flere nylige rapporter data, der tyder på, at spredning som reaktion på innervering moduleres, i det mindste delvist, af BDNF-TrkB-vejen12,13. Mange åbne spørgsmål om optisk tektumvækst og -udvikling forbliver, herunder hvordan et udviklende sensorisk system håndterer skade og axondegeneration, hvilke cellulære og molekylære signaler der muliggør retinal input til at regulere optisk tektumvækst, hvornår disse mekanismer bliver aktive, og om innerveringsbundet proliferation og differentiering gør det muligt for nethinden og dets målvæv at koordinere vækstrater og sikre nøjagtig retinotopisk kortlægning. Derudover er der meget større spørgsmål om aktivitetsafhængig udvikling, der kan løses ved at forhøre zebrafiskens visuelle system med kirurgiske tilgange som den, der er beskrevet nedenfor.
For at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, hvormed neural aktivitet, specifikt fra visuelt input, ændrer celleoverlevelse og proliferation, sammenligner den beskrevne tilgang direkte innerverede og denervaterede tektale lobes (figur 1) inden for individuelle zebrafisklarver. Denne metode muliggør dokumentation af RGC axondegeneration i det optiske tectum og bekræftelse af, at antallet af mitotiske celler korrelerer med innervering.
Figur 1: Skitser af zebrafiskelarver før og efter ensidig øjenfjernelse. (A) Tegning af 5 dpf larver set under et dissekerende mikroskop. Hver larve er indlejret i agarose med lavt smeltepunkt og orienteret sideværts, før en wolframnål med en skarp, kroget spids bruges til at øse øjet ud mod op (venstre øje i dette eksempel). (B) Tegning af dorsal visning af en 9 dpf larve som følge af operationen afbildet i A. Kun tre stærkt skematiserede RGC-axoner fra højre øje er vist defascikulerende og forbinde med neuroner i venstre tektale lap. Forkortelser: dpf = dage efter befrugtning; dps = dage efter operationen; RGC = retinale ganglionceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoderne i dette papir blev udført i overensstemmelse med retningslinjer og godkendelse af Institutional Animal Care and Use Committees of Reed College og University College London. Se materialetabellen for detaljer om zebrafiskestammer, der anvendes i denne undersøgelse.
1. Forbered materialer og værktøjer
- Lav løsninger.
- Lav embryomedium (E314) ved at fortynde en 60x stamme (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl2-dihydrat og 20 mM MgCl2-hexahydrat i deioniseret vand, autoklaveret og opbevaret ved stuetemperatur). Tilsæt 160 ml 60x E3 til 10 liter deioniseret vand. Opbevares ved stuetemperatur.
- Lav 1% lavt smeltepunkt (LMP) agarose i E3. 1 g LMP-agarose opløses i 100 ml E3 ved kogning i mikrobølgeovnen i 1-2 min ved høj effekt. Aliquot smeltet agarose i 1,7 ml mikrofugerør og opbevares ved 4 °C. Kog i et vandbad og hold i en 40 °C varmeblok, når den er klar til brug til indlejring.
- Lav Marc's Modified Ringers (MMR15) isotoniske opløsning ved at fortynde en 10x stamme (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl 2-dihydrat, 50 mM HEPES, pH justeret til 7,5 med 10 M NaOH, derefter autoklaveret og opbevaret ved stuetemperatur). Tilsæt 10 ml 10x MMR til 90 ml deioniseret vand.
- Hæld Sylgard plader i henhold til producentens anvisninger, så de kan sætte sig og tørre i flere dage16.
- Elektrolytisk skærpe wolframnåle (protokol modificeret fra 17).
- Forbered først en 10% (w/v) KOH-opløsning ved at tilsætte 200 ml deioniseret vand til en glasbur med bred mund med et skruelåg. Rør langsomt 20 g KOH-pellets i.
BEMÆRK: Denne kaustiske opløsning er meget eksoterm. Brug handsker og øjenbeskyttelse, og rør opløsningen i emhætten. - Skær en 2-3 cm længde wolframtråd og indsæt den i nåleholderen.
- Tilslut katode- og anodeledningerne til strømforsyningen. Fastgør alligatorclipsen i enden af katodetråden til en delvist rettet papirclips, og indsæt papirclipsen i KOH-opløsningen, fastgør den til siden af krukken.
- Fastgør derefter alligatorklemmen på anodetråden til nåleholderens hals. Tænd for strømmen (til ~ 20 V), og dypp wolframtråden i KOH-opløsningen, træk ledningen ud af opløsningen i en vinkel for elektrolytisk at skærpe ledningen til en fin spids.
BEMÆRK: Bobler kommer fra papirclipsen, når reaktionen fortsætter. - Kontroller spidsen af nålen under dissekeringsmikroskopet for at sikre, at den er skarp nok.
- Skyl nålen med deioniseret vand for at fjerne alle KOH-rester. Lav flere nåle på forhånd og opbevar dem indtil larveoperationer og dissektioner.
- Forbered først en 10% (w/v) KOH-opløsning ved at tilsætte 200 ml deioniseret vand til en glasbur med bred mund med et skruelåg. Rør langsomt 20 g KOH-pellets i.
- Lav kamrede dias til billeddannelse af zebrafiskprøver med et opretstående konfokalmikroskop.
- Få glasmikroskop dias og todelt epoxyharpiks (se materialetabellen). Bland epoxyen i henhold til instruktionerne på pakken, og mal tykke ringe eller rektangler på glasrutschebillederne. Lad gliderne hærde og tørre i emhætten i mindst 24 timer før brug.
2. Embryoopsamling og -opdræt
- Par voksne han- og hunfisk af de ønskede genotyper i avlskasser sidst på eftermiddagen/først på aftenen. Næste morgen, efter at de har gydt, samles nybefrugtede æg med en maskesil og overfører dem til E3 i 100 mm petriskåle.
- Inkuber embryonerne ved ~ 27,5 ° C med en 14 timers lys / 10 timers mørk cyklus indtil operationsdagen. Skift E3 dagligt eller efter behov.
- Foder larverne ved hjælp af en dråber fuld af høstede rotiferer en gang om dagen, begyndende enten 5 dage efter befrugtning (dpf) eller en dag efter operationen. Når larverne har flere timer at spise, skal du ændre E3 for at fjerne eventuelle resterende rotiferer og affaldsprodukter.
BEMÆRK: Foder ikke larver på operationsdagen.
3. Forbered larver til operation
- På operationsdagen skal du bruge en bredboret Pasteur-pipette af glas til at overføre 10-15 larver til en 35 mm petriskål fyldt med frisk E3.
- Anæstesi larverne ved at tilsætte 3-5 dråber 0,4% w/v Tricaine-opløsning (0,4 g Tricain opløst i 210 mM Tris, pH 9; endelig opløsning justeret til en pH på 7,4 om nødvendigt18) til fadet for en endelig koncentration på ~0,0015% w/v Tricain. Se efter manglende reaktion på berøring for at afgøre, om larverne er tilstrækkeligt anæstesi. Hvis de stadig reagerer på berøring efter ~ 3 minutter, skal du tilføje 2-3 dråber mere på 0,4% m / v Tricaine-opløsning og revurdere.
BEMÆRK: På dette udviklingsstadium er det muligt at overvåge blodgennemstrømningen og pulsen ud over bevægeligheden under dissekeringsmikroskopet. - Immobiliser de abesatte zebrafisklarver ved at indlejre dem i 1% LMP-agarose opløst i E3.
- Placer først låget på en 35 mm petriskål med forsiden op under dissekeringsmikroskopet. Tag derefter en larve op i en smalboret Pasteur-pipette af glas med kun en lille mængde E3.
- Derefter aspirerer ~ 200 μL smeltet, varmt (~ 40 ° C) 1% LMP agarose i pipetten med larven. Til sidst sprøjtes larven og agarose på det omvendte petriskålslåg.
- Brug en kedelig wolframnål til hurtigt, men forsigtigt at manøvrere larven, så den er lateral, med det ene øje vendt op. Vent på, at agarose sætter sig (~ 5 minutter).
BEMÆRK: Hvis agarose hærder, mens larven ikke er lateral, skal du frigøre den fra agarose (som beskrevet i trin 5) og returnere den til fadet med E3 og tricain.
4. Øjenfjerning
- Når agarose er sat, og larven er placeret sideværts, skal du bruge spidsen af en meget fin, elektrolytisk skærpet wolframnål til at gennembore huden omkring øjet efter kanten af øjenbanen.
- Skub derefter kanten af nålen (ikke spidsen) under øjet fra den tidsmæssige ventrale side af øjet. Brug kontrolleret tryk til at frigøre øjet fra stikkontakten.
- Brug meget fine kirurgiske tang til at fjerne øjet ved at klemme synsnerven og skubbe øjet fra mediale til laterale. Alternativt skal du blot fortsætte med at trykke på øjet dorsalt og anteriorly med siden af nålen, til sidst skære gennem synsnerven og frigive øjet.
BEMÆRK: Hvis andet væv end øjet ved et uheld bliver stukket ned under operationen, skal larven hurtigt og humant dræbes ved hurtig halshugning.
5. Postoperativ pleje indtil eksperimentelt endepunkt
- Efter vellykket øjenfjernelse skal du dække agarose med MFR-opløsning.
- Frigør hver larve fra agarose ved forsigtigt at børste en wolframnål rundt om hovedet og derefter rundt om deres krop, mens du stabiliserer petriskålslåget med tang.
- Overfør de enøjede larver til en 35 mm petriskål, der indeholder MFR suppleret med en 1:100 fortynding af en penicillin/streptomycincocktail. Inkuber embryonerne ved ~ 27,5 ° C med en 14 timers lys / 10 timers mørk cyklus.
BEMÆRK: Denne isotoniske opløsning af MFR suppleret med antibiotika hjælper oprindeligt larveheling og overlevelse. Hver skål kan rumme op til 15 genoprettende larver. - Den næste dag skal larverne returneres til E3. Fra eftermiddagen efter operationen fodrer larver (~ 6 dpf og ældre) ved hjælp af en dråber fuld af høstede rotiferer en gang om dagen. Når larverne har haft flere timer at spise, skal du skifte E3 for at fjerne eventuelle resterende rotiferer og affaldsprodukter.
6. Fastgørelse af larver
- Når larverne har nået det ønskede udviklingsstadium til analyse, skal du anæstesiere dem med en dødelig dosis tricain (~ 0,4% endelig koncentration), indtil deres hjerter er stoppet.
- Pipette op til 30 larver pr. 1,5 ml mikrofugerør. Fjern overskydende E3, og tilsæt derefter 0,5-1 ml fikseringsopløsning (4% paraformaldehyd (PFA) og 4% saccharose i fosfatbufret saltvand (PBS)) for at fiksere vævet. Inkuber larverne natten over ved 4 °C.
- Vask larverne med PBS dagen efter ved at fjerne fikseringsmidlet og skylle larverne 3-4 gange med PBS. Opbevar larverne ved 4 °C i op til 7 dage før dissektion.
7. Dissekering af larver for at afsløre hjerner (tilpasset fra 15)
- Suspender de faste larver i PBS-dråber på en Sylgard-plade under et dissekerende mikroskop. Fastgør dem sideværts ved at placere to wolframstifter (typisk gamle wolframnåle, der er mindre end 2 cm) gennem notokordet, med en stift lige bagud til det pigmenterede område, der dækker aorta-gonad-mesonephros (AGM) -regionen og en anden i overensstemmelse med slutningen af æggeblommeforlængelsen.
BEMÆRK: Placer wolframstifterne i så få forsøg som muligt, fordi vævet bliver mere sprødt med hver punktering. - Brug en meget skarp wolframnål og nåleskarpt tang til at eksponere hjernen ved i denne rækkefølge at fjerne øjet (e), øret, kæben, fordøjelseskanalen og den dorsale kraniale hud.
- Fjern først øjet ved hjælp af en teknik, der ligner den kirurgiske øjenfjernelse i trin 4. Derefter løsnes larven og vendes til den modsatte side, så det andet øje er tilgængeligt og gentages. Alternativt kan du stikke nålen gennem kæben til den anden side og fjerne øjet uden at løsne sig.
BEMÆRK: Øjne kan indsamles på dette tidspunkt, hvis analyse af dette væv ønskes (svarende til 19). - Brug derefter wolframnålen til at ridse fra den tidsmæssige til den ventrale side af øret. I samme handling/bevægelse skal du bringe nålen bagud til kæben og trække forsigtigt anteriorly, indtil øret og kæben er fjernet.
- Brug tang til at trække de ventrale organer og eventuelle resterende æggeblomme ud.
- Endelig lav et lavt snit i den dorsale kraniale hud nær krydset mellem baghjernen og rygmarven. Løft huden med tangen og træk den anteriorly og omkring telencephalon. Hvis dette viser sig for svært, skal du starte ved det indledende snit i baghjernen og trække huden først sideværts og derefter ventralt og forreste, idet du er meget forsigtig med ikke at ridse tektumets laterale kanter.
BEMÆRK: Fordi midterhjernen er genstand for undersøgelse, kan baghjernen skæres; dog kan et dybt snit resultere i halshugning. - Fjern eventuelt resterende væv med tang. Udpin larven og overfør til PBS i et 1,5 ml mikrofugerør.
BEMÆRK: Lad halen være fastgjort til hjernen for bedre synlighed, når du udfører fuldmonteringsprotokoller.
- Fjern først øjet ved hjælp af en teknik, der ligner den kirurgiske øjenfjernelse i trin 4. Derefter løsnes larven og vendes til den modsatte side, så det andet øje er tilgængeligt og gentages. Alternativt kan du stikke nålen gennem kæben til den anden side og fjerne øjet uden at løsne sig.
8. Hjerne dehydrering og opbevaring
- Fjern PBS fra hjernen, og tilsæt 1 ml PBS indeholdende 0,1% TritonX-100 (PBST). Inkuber i 5-10 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern PBST og erstat det med en 50:50 methanol:PBST-opløsning. Inkuber i 5-10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask hjernen med 100% methanol (MeOH) to gange i 5 min hver ved stuetemperatur.
- Opbevar hjernerne i 100% MeOH ved -20 °C i mindst 16 timer, før de udfører immunhistokemi eller andre helhedsprocedurer.
BEMÆRK: Hjerner kan opbevares i MeOH i op til 2 år ved -20 °C.
9. Immunohistokemi
BEMÆRK: Etablerede protokoller for mange nyttige fuldmonteringsteknikker i zebrafisk kan findes på ZFIN20. Dette manuskript giver eksempler, der sammenligner enøjede og toøjede larver, der var immunfarvede med antistoffer, der genkender enten det røde fluorescerende protein (RFP), som udtrykkes i optiske nerveaxoner i Tg[atoh7:RFP] -linjen (figur 2) eller phosphoryleret histon H3 (PH3), som fremhæver mitotiske celler (figur 3). En standard immunhistokemiprotokol for fuldmonterede embryoner og larver er opsummeret nedenfor.
- Rehydrer først larvehjernerne med en gradueret serie af MeOH:PBST-vasker ved stuetemperatur ved at inkubere prøverne i 50:50 MeOH:PBST i 5 minutter, derefter i 30:70 MeOH:PBST i 5 minutter og slutte med 3 vaske PBST.
- For at permeabilisere hjernerne skal du inkubere dem i PBST suppleret med proteinase K (PK) i en endelig koncentration på 20 μg/ml PK i 30 minutter ved 37 °C. Opbevar alikvoter på 10 mg/ml PK ved -20 °C og optø dem før brug.
- Fjern PK-opløsningen og vask eventuelt resterende enzym væk ved at skylle hjernen med PBST 3 gange over 15 min.
- Refix de permeabiliserede hjerner ved at inkubere dem i 4% PFA i 20 min ved 25 °C (eller stuetemperatur). Fjern derefter PFA og vask eventuelt resterende fikseringsmiddel væk ved at skylle hjernen 3 gange over 15 min med PBST.
- Udskift den endelige PBST-skylning med frisklavet immunblokerende buffer (IB) (10 % normalt gedeserum og 1 % DMSO i PBST), og inkuber ved stuetemperatur i mindst 1 time.
- Fortynd primære antistoffer i IB-buffer i den passende koncentration (f.eks. 1:500 for RFP og 1:300 for PH3-antistoffer).
- Fjern IB-buffer fra hjernen og erstat den med den primære antistoffortynding. Inkuber natten over ved 4 ° C på en orbital shaker med blid rocking. Sørg for, at rørene hviler sikkert på deres sider.
- Næste morgen skal du fjerne den primære antistofopløsning med en mikropipette, skylle et par gange i PBST og derefter vaske hjernen i PBST ved stuetemperatur i 4 x 30 minutter.
BEMÆRK: Primære antistoffortyndelser kan genbruges én gang inden for ~7 dage, hvis de opbevares ved 4 °C. - Skyl hjernen i IB-buffer, mens du fortynder sekundære antistoffer i IB-buffer i den passende koncentration (f.eks. 1:500 for Alexa-fluor 568 anti-kanin).
- Fjern IB-bufferen, og erstat den med den sekundære antistoffortynding. Inkuber natten over ved 4 ° C på en orbital ryster med blid rocking af rørene, der hviler på deres sider.
- Næste morgen skal du fjerne den sekundære antistofopløsning, skylle med PBST og derefter vaske hjerner i PBST ved stuetemperatur i 4 x 30 minutter.
- Modplet med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) eller ToPro3 (1:5.000 i PBST ved 4 °C natten over).
- Næste morgen overføres larvehjernerne til PBS og fortsætter til nedenstående monterings- og billeddannelsestrin.
10. Montering og billeddannelse
- Fastgør et kammerskred i låget på en 100 mm petriskål med vakuumfedt.
- Overfør de immunplettede og forarbejdede larver til en brøndplade eller depressionsdias for at se dem med et dissekerende mikroskop.
- Monter larverne på det kamrede dias i søjler af 1% LMP agarose.
- Brug en glaspastepa-pipette til at sætte en larve på det kamrede dias og deponere så lidt PBS som muligt. Med den samme pipette dækkes larven med smeltet 1% LMP-agarose (~ 40 °C).
- Med en stump wolframnål eller tang trækkes agarose i en søjle og placeres derefter larven så symmetrisk som muligt med den dorsale overflade synlig.
- Gentag denne procedure for de resterende larver.
- Når agarose er geleret, skal du dække den med et par dråber PBS og derefter placere den på scenen i det konfokale mikroskop.
- Juster objektivlinsen med prøven, fokuser mikroskopet ved hjælp af transmitteret lys, og belys prøven med de relevante lasere.
BEMÆRK: I dette eksempel blev 405 nm og 568 nm bølgelængder brugt til at ophidse henholdsvis DAPI og RFP. - Juster forstærknings-, forskydnings- og lasereffekten ved at flytte skyderen til et passende niveau i forhold til signalet og den anvendte detektor. Kontroller histogrammerne for hver kanal, og klik på indikatorknappen Tilstand for mætning over billedet for at måle eksponeringsniveauet, så det sikres, at ingen af pixels er mættede, og at signal-støj-forholdet er højt. For et eksempel på optimale konfokale billeddannelsesparametre for cellulær og subcellulær opløsning inden for zebrafisk, se 21.
- Indstil de øvre og nedre grænser for stakken af z-planer ved hjælp af rullehjulet på musen for at finde toppen og bunden af prøven. Klik på de øverste og nederste grænser for billedoptagelse, og udløs derefter z-stack-optagelsen ved at klikke på knappen Kør nu .
BEMÆRK: Afhængigt af hvor symmetrisk hjernen er monteret, vil den samlede z-dybde for en 9 dpf larve zebrafisk hjerne være ~ 150-200 μm. - Behandl og farvelægge billederne med farveblind tilgængelighed i tankerne (brug f.eks. blå og orange eller magenta og grøn til tofarvede billeder). Indstil opslagstabeller i den software, der bruges til at tage billeder eller billedbehandlingssoftware, f.eks. Photoshop fra Adobe.
- I Photoshop gemmes color raw-fotomikrografer som 8 bit TIFF (Tagged Image File Format) ved (i) at konvertere billedtilstand til RGB og (ii) få adgang til indstillingen Kurver under | Justeringsmenuer og derefter (iii) skubbe de relevante farvede lysudgange til 0 eller 255 niveauer for at opnå den ønskede farve. For eksempel for at opnå et grønt signal skal du vælge den røde kanal og skubbe dens udgang til 0; vælg derefter den blå kanal, og skub også dens output til 0. På samme måde skal du vælge den grønne kanal for at opnå et magentasignal og skubbe dens udgang til 0; lad de røde og blå kanaler være, som de er.
BEMÆRK: Lignende trin kan udføres i det gratis Gnu Image Manipulation Program (GIMP). - Kvantificer manuelt antallet af celler, der viser en bestemt markør, ved hjælp af celletæller-pluginet i ImageJ22, der er tilgængeligt under Analysér i menuen Plugins. Eksempler på, hvordan du bruger ImageJ til celletælling, findes i mange selvstudier, herunder 23.
- Generer grafiske repræsentationer af data i statistisk software såsom RStudio (se supplerende data for . Rmd-fil).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bekræfte, om øjenfjernelsen var fuldstændig og vurdere, hvordan det optiske tektum ændres, blev der udført operationer i Tg[atoh7:RFP]-stammen, som mærker alle RGC'er med en membranmålrettet RFP og dermed alle axoner, der projicerer fra nethinden og danner synsnerven24. Selvom det ikke er absolut nødvendigt at bruge denne stamme, muliggør det ligetil observation og visualisering af de optiske nerveterminini i den optiske tectum neuropil. Andre tilgange til mærkning af synsnerven, såsom axonsporing med lipofile DiI- eller DiO-farvestoffer25,26 eller multispektral mærkning med hjernebue27, ville også være mulige.
Som vist i figur 2 blev progressiv degeneration af retinale axoner i den optiske tectum neuropil observeret efter øjenfjernelse. To dage efter operationen udviste RFP-mærkede axoner kendetegn ved hurtig wallerisk degeneration28 såsom blebbing og fragmentering (figur 2A, B). Nylige arbejder har vist, at microglia opsluger mere myelinmateriale, når neuroner er tavse29. I overensstemmelse med microglia, der opsluger bits af de degenererende RGC-axoner og migrerer væk fra degenerationskilden, blev der noteret lyse RFP-mærkede puncta inden for og uden for den tektale neuropil (figur 1B, pile). Fire dage efter operationen reduceres fragmenterede axoner og RFP-mærket aksonaffald betydeligt i begge tektale lobe, hvilket indikerer relativt hurtig clearance af de døende og degenererende axoner (figur 2C,D).
For at udføre fuldmount immunhistokemi og visualisere den optiske tectum af larve zebrafisk, blev hjernen udsat ved at dissekere øjet (e), kæben, ørerne og kraniet hætte af huden og bindevæv. Ideelt set forbliver hjernen intakt under denne procedure (f.eks. Figur 2C,D). Imidlertid vil dele af forhjernen, især den olfaktoriske pære, sandsynligvis blive beskadiget eller helt fjernet, når kraniet på hud eller kæbe fjernes (figur 2A, pilespids). Desuden kan den laterale kant af tektum undertiden skæres, når man gennemborer eller klemmer huden for at trække den ud af hjernen (f.eks. Figur 2A; rive på højre tektale lap).
Immunohistokemi blev også brugt til at vurdere antallet af mitotiske celler i innerverede og ikke-innerverede lobes i det optiske tectum ved at farve hele hjerner med et PH3-antistof. Disse data viser signifikant færre mitotiske celler på den denerverede side af enøjede larvefisk (p = 0,00033, Welchs t-test; Figur 3).
Figur 2: Øjenfjernelse ved 5 dpf udløser degeneration af optiske nerveaxoner. (A-D) Repræsentative fremskrivninger med maksimal intensitet, der viser dorsale visninger af vildtypehjerner fra intakte larver fastgjort til 7 dpf (A) eller 9 dpf (C) eller enøjede larver fra øjenudstøvende operationer ved 5 dpf, fast 2 dps (B) eller 4 dps (D). Alle kerner er farvet med DAPI (grøn), og optiske nerveaxoner, der slutter i neuropilen i det optiske tectum, er mærket af atoh7: RFP-transgenet (magenta). Stjerne angiver innerveret tektal neuropil hos larver med kun højre øje intakt. Pile angiver eksempler på fragmenter af degenererede RGC-axoner, der stammer fra det denerverede optiske tektum. Pilespids angiver manglende dele af forhjernen. Skalastang = 50 μm. Forkortelser: dpf = dage efter befrugtning; dps = dage efter operationen; RGC = retinale ganglionceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Antallet af mitotiske celler i det optiske tektum stiger med innervering. (A-B) Repræsentative maksimalintensitetsfremskrivninger, der viser dorsale visninger af vildtypehjerner fra intakte (A) eller enøjede (B) 9 dpf larver immunplettet med antistoffer for den mitotiske markør PH3 (magenta) og kerner modfarvet med DAPI (grøn). Stjerne indikerer innerveret tektal neuropil fra det intakte højre øje. (C) Boksplot med alle individuelle datapunkter overlejret, der viser kvantationen af forholdet mellem PH3+ celler i innerveret (venstre) versus denervated (højre) tektallap som et forskelsforhold (venstre-højre/total) for enøjede (n = 12) og toøjede (n = 8) 9 dpf larver. Midler til de to betingelser sammenlignet med Welchs t-test (***, p < 0,0005). Skalastang = 50 μm. Forkortelser: dpf = dage efter befrugtning; dps = dage efter operationen; PH3 = fosforyleret histon H3; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil: Oversigt og instruktioner til plot vist i figur 3C. Denne fil indeholder alle data og kode, så alle kan gengive boksplottet med alle datapunkter overlejret, som vist i figur 3C. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De teknikker, der er beskrevet i dette papir, illustrerer en af mange tilgange til at studere hvirveldyrs visuelle systemudvikling i zebrafisk. Andre forskere har publiceret metoder til at dissekere den embryonale nethinde og udføre genekspressionsanalyser19 eller visualisere neuronal aktivitet i det optiske tektum30. Dette papir giver en tilgang til at undersøge, hvordan differentiel retinal input kan påvirke celleadfærd i det optiske tektum.
For at sikre en vellykket øjenekstrivering og larveoverlevelse efter operationen er det vigtigt, at larverne er sunde, tilstrækkeligt bedøvelsesbelyst og immobiliseret i 1% agarose. Det er også afgørende, at tang og wolframnåle er meget skarpe og rene. Larver overlever bedst, når de ikke fodres 24 timer før eller efter operationen, og opdræt af larver i MFR suppleret med antibiotika fremskynder helingsprocessen. Det er vigtigt, at den højere ionstyrke af MFR og især den højere koncentration af calcium fremmer heling14. Længere eksponering for den højere saltholdighed kan dog mindske overlevelsen, svarende til hvad der er dokumenteret i embryonale zebrafisk31. Et mest kritisk skridt er fiksering for at sikre vellykkede hjernedissektioner, som er afgørende for dataanalyse af billeder af immunplettede prøver. Brug af frisklavet 4% PFA suppleret med 4% saccharose (kærligt kaldet sweet fix) har tendens til at øge letheden ved fjernelse af hud og bevarelse af hjernevæv. Som med operationerne er skarpe og rene værktøjer et must for at dissekere hjerner.
En af de største udfordringer ved denne protokol er at indlejre larver til øjenekstirpationer. Det er vigtigt, at hver person finder den måde, der fungerer bedst for dem, så de trygt og hurtigt kan fjerne larveøjet. Hvis larven ved et uheld bliver stukket under operationen, skal du humant dræbe den ved halshugning. En anden udfordring er at bestemme de mest effektive antistofkoncentrationer til fuldmount immunstaining. Ved bestemmelse af de relevante antistofkoncentrationer skal du bruge den offentliggjorte litteratur som udgangspunkt og optimere protokollen, da anvendelse af offentliggjorte reagenser på forskellige væv (især på større væv eller ældre dyr) kan kræve øgede koncentrationer og / eller inkubationstider.
Den største begrænsning ved denne metode er den tid, et enkelt eksperiment tager fra start til slut, og antallet af fisk, der kan studeres til enhver tid. For eksempel tog alle de data, der er vist i figur 3, cirka en måned fra den første parring af fisk til den endelige dataindsamling og analyse. Denne relativt lave gennemstrømningstilgang kan suppleres med heterologe genetiske tilgange, der enten selektivt dæmper neural aktivitet i det visuelle system32,33 eller af mutanter, der mangler RGC-axoner eller aktivitet 34,35.
Betydningen af denne metode er, at den bringer en traditionel embryologisk teknik til at bære på moderne transgene fiskelinjer, hvilket muliggør direkte sammenligning af cellulære og genetiske mekanismer, der opererer i hver af de tektale lobes inden for det samme individ. Desuden er denne metode moden til anvendelse på andre eksperimentelle systemer, herunder Astyanax overfladefisk36 og / eller transgene zebrafisklarver med fluorescerende mærket microglia 37,38,39 og astrocytter 40 for at studere, hvordan det udviklende fiskenervesystem reagerer på en så dramatisk skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Finansiering til dette arbejde blev primært støttet af opstartsmidler fra Reed College til KLC, Helen Stafford Research Fellowship midler til OLH og et Reed College Science Research Fellowship til YK. Dette projekt begyndte i Steve Wilsons laboratorium som et samarbejde med HR, som blev støttet af et Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Vi takker Máté Varga, Steve Wilson og andre medlemmer af Wilson-laboratoriet for indledende diskussioner om dette projekt, og vi takker især Florencia Cavodeassi og Kate Edwards, som var de første til at lære KLC, hvordan man monterer embryoner i agarose og udfører zebrafisk hjernedissektioner. Vi takker også Greta Glover og Jay Ewing for hjælp til at samle vores wolframnåleslibeanordning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and supplies: | |||
| Breeding boxes | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Dow Corning high vacuum grease | Sigma or equivalent supplier | Z273554 | |
| Erlenmeyer flasks (125 mL) | For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation. | ||
| Fine forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipettes | DWK Lifescience | 63A53 & 63A53WT | For pipetting embryos and larvae. |
| Glass slides for microscopy | VWR or equivalent supplier | 48311-703 | Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers. |
| Glassware including graduated bottles and graduated cylinders | For making and storing solutions. | ||
| 2-part epoxy resin | ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent | 0.85 oz syringe | https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793 |
| Microcentrifuge tube (1.7 mL) | VWR or equivalent supplier | 22234-046 | |
| Nickel plated pin holder (17 cm length) | Fine Science Tools (FST) | 26018-17 | To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections. |
| Nylon mesh tea strainer or equivalent | Ali Express or equivalent | For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html | |
| Paper clip | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Petri dishes 100 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 50-190-0267 | |
| Petri dishes 35 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 08-757-100A | |
| Pipette pump | SP Bel-Art or equivalent | F37898-0000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma | 909122 | For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water. |
| Power supply (variable voltage) | For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis). | ||
| Sylgard 184 Elastomer kit | Dow Corning | 3097358 | |
| Tungsten wire (0.125 mm diameter) | World Precision Instruments (WPI) | TGW0515 | Sharpen to remove eye and dissect larvae. |
| Variable temperature heat block | The Lab Depot or equivalent supplier | BSH1001 or BSH1002 | Set to 40-42 °C ahead of experiments. |
| Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar) | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Wires with alligator clip leads | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Microscopes: | |||
| Dissecting microscope | Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred. | ||
| Laser scanning confocal microscope | High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work. |
||
| Reagents for surgeries and dissections: | |||
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| HEPES | Sigma | H7006 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 1374248 | For embryo medium (E3). |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock). |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333-20ML | Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | Diagnostic BioSystems | DMR E404-01 | Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration. |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4. |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tricaine-S | Pentair | 100G #TRS1 | Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE |
| Reagents for immunohistochemistry: | |||
| Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG | Invitrogen | A-11011 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| DAPI or ToPro3 | Invitrogen | 1306 or T3605 | Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | A component of immunoblock buffer. |
| Methanol (MeOH) | Sigma | 34860 | Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using. |
| Normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 50-062Z | A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C. |
| Primary antibody to detect phosphohistone H3 | Millipore | 06-570 | Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives) | MBL International | PM005 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Proteinase K (PK) | Sigma | P2308-10MG | Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS. |
| Software for data analysis | |||
| ImageJ (Fiji) | Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| RStudio | Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | ||
| Adobe Photoshop or GIMP | Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/) | ||
| Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains. | Available from the Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication. |
References
- Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
- Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
- Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
- Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
- Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021).
- Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021).
- Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
- White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
- Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
- Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
- Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Cold Spring Harbor Protocols. Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A.
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- ZFIN Tricaine recipe. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018).
- Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).
- ZFIN protocols. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021).
- Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).
- ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: https://figi.sc/ (2021).
- O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
- Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
- Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
- Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
- Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
- de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).
- Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
- Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
- Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
- Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
- Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
- Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).
- Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
- Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
- Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
- Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).
