Summary
この記事では、網膜入力が視蓋の成長と発達にどのように影響するかを調査するための第一歩として、生きているゼブラフィッシュの幼虫から外科的に目を取り除く方法について説明します。さらに、この記事では、幼虫の麻酔、固定、および脳解剖に関する情報を提供し、続いて免疫組織化学および共焦点イメージングを行う。
Abstract
ゼブラフィッシュは生涯にわたる顕著な成長と再生能力を示します。例えば、胚発生中に確立された特殊な幹細胞ニッチは、眼および脳の両方において、視覚系全体の継続的な成長をサポートする。網膜と視蓋の間の協調的な成長は、新しいニューロンが目と脳に追加されるにつれて、正確な網膜トピックマッピングを保証します。網膜軸索が、生存、増殖、および/または分化などの眼底幹および前駆細胞の挙動を調節するための重要な情報を提供するかどうかに対処するには、同じ動物内および動物間で神経支配および脱神経化されたテクタルローブを比較できることが必要である。
生きている幼虫ゼブラフィッシュから片目を外科的に除去し、続いて視蓋骨を観察することで、この目標を達成します。付属のビデオは、幼虫を麻酔し、タングステン針を電気的に鋭くし、それらを使用して片目を除去する方法を示しています。次に、固定されたゼブラフィッシュ幼虫から脳を解剖する方法を示します。最後に、このビデオでは、免疫組織化学のプロトコルの概要と、顕微鏡検査のために染色された胚を低融点アガロースにマウントする方法のデモンストレーションを提供します。
Introduction
この方法の目的は、網膜入力がゼブラフィッシュ脳の視覚処理センターである視蓋骨の成長と発達にどのように影響するかを調べることです。片目を取り除いた後、視蓋の両側を比較することで、同一試料内のテクタル変化を観察・正規化することができ、複数の検体間での比較が可能となります。この技術と組み合わせた現代の分子アプローチは、視覚系の成長と発達、ならびに軸索の変性と再生の根底にあるメカニズムへの洞察をもたらすでしょう。
視覚、聴覚、体性感覚などの感覚系は、外部器官から情報を収集し、その情報を中枢神経系に中継し、中脳全体の外界の「マップ」を生成します1,2。視覚は、多くの魚を含むほぼすべての脊椎動物にとって支配的な感覚様式です。眼の神経組織である網膜は、網膜の投影ニューロンである視受容体、双極性細胞、網膜神経節細胞(RGC)を主体とする神経回路で情報を収集します。RGCは長い軸索を持ち、網膜の内面を横切って視神経頭に向かい、そこで脳を魅了して一緒に移動し、最終的に背側中脳の視覚処理センターで終わる。この構造は、魚類や他の哺乳類以外の脊椎動物では視蓋骨と呼ばれ、哺乳類の優れた丘陵地帯と相同である3。
視蓋骨は、背側中脳における両側対称の多層構造である。ゼブラフィッシュおよび他のほとんどの魚類では、視蓋の各葉は対側眼からのみ視覚入力を受け取るため、左視神経は右眼房で終了し、右視神経は左眼球4で終了する(図1)。哺乳類の対応物である上甲骨と同様に、オプティックテクタムは視覚情報をオーディションや身体感覚などの他の感覚入力と統合し、視覚的注意の変化やサッケードなどの眼球運動を制御します1,5,6。しかし、哺乳類の上斜膜とは異なり、視蓋骨は、テクタル増殖ゾーン7と呼ばれるテクタルローブの内側および尾縁付近の特殊な幹細胞ニッチから新しいニューロンおよびグリアを連続的に生成する。視蓋および中枢神経系の他の領域における増殖性前駆細胞の維持は、部分的には、ゼブラフィッシュ8に文書化された顕著な再生能力に寄与する。
盲目または片目の魚の脳を調べた以前の研究は、視蓋の大きさがそれが受ける網膜神経支配の量に正比例することが明らかになった 9,10,11.初期胚発生で目が退化する成体の洞窟魚類では、オプティックテクタムは、近縁の、目の見える表面魚9のそれよりも著しく小さい。洞窟魚眼の変性は、胚発生時に内因性レンズを表面魚由来のレンズと交換することによって阻止することができる。これらの片目の洞窟魚が成体期まで飼育されると、神経支配されたテクタルローブは、非神経化されたテクタルローブ9よりも約10%多くの細胞を含む。同様に、同じ個体内で異なるサイズの目を生成するために化学的処置を用いて孵化した幼虫キリフィッシュにおいて、より神経支配されたテクタムの側面はより大きく、より多くのニューロン10を含んでいた。成体金魚における視神経圧潰実験からの証拠は、神経支配が増殖を促進し、神経支配が破壊されるとテクタル細胞増殖が減少することを示している11。
これらの古典的な研究を確認し、拡張して、いくつかの最近の報告は、神経支配に応答した増殖が、少なくとも部分的には、BDNF-TrkB経路12、13によって調節されることを示唆するデータを提供する。発達中の感覚系が損傷および軸索変性にどのように対処するか、どの細胞および分子シグナルが網膜入力が視蓋成長を調節することを可能にするか、これらのメカニズムがいつアクティブになるか、神経支配に関連した増殖および分化が網膜およびその標的組織が成長速度を調整し、正確な網膜トピックマッピングを確実にすることを可能にするかどうかなど、眼テクタムの成長および発達に関する多くの未解決の疑問が残っている。さらに、活動依存性の発達については、以下に説明するような外科的アプローチでゼブラフィッシュ視覚系を尋問することによって対処できるはるかに大きな質問がある。
神経活動、特に視覚入力からの神経活動が細胞の生存と増殖を変化させる細胞および分子のメカニズムを調べるために、記載されたアプローチは、個々のゼブラフィッシュ幼虫内の神経支配および脱神経化されたテクタルローブ(図1)を直接比較する。この方法は、視蓋におけるRGC軸索変性の文書化および有糸分裂細胞の数が神経支配と相関することを確認することを可能にする。
図1:片側眼除去前後のゼブラフィッシュ幼虫のスケッチ 。 (A)解剖顕微鏡下で見た5 dpf幼虫の図面。各幼虫は、低融点アガロースに埋め込まれ、鋭い引っ掛けられた先端を有するタングステン針が上を向いて眼をすくい取るために使用される前に横方向に向けられる(この例では左目)。(B) Aに描かれた手術から生じた9dpf幼虫の背部図の図面。右目から高度に図式化された3つのRGC軸索のみが、左蓋葉のニューロンと脱魅惑的で連結していることが示されている。略語: dpf = 受精後日数;dps = 手術後の日数;RGC = 網膜神経節細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
この論文の方法は、リードカレッジとユニバーシティカレッジロンドンの施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインと承認に従って実施されました。この研究で使用されたゼブラフィッシュ株の詳細については、 材料表 を参照してください。
1. 材料と工具を準備する
- 解決策を作る。
- 60倍ストック(300 mM NaCl、10.2 mM KCl、20 mM CaCl 2-二水和物、および20 mM MgCl2-六水和物)をイオン交換水で希釈して胚培地(E314)を作り、オートクレーブ処理し、室温で保存した。10 L の脱イオン水に 60 x E3 160 mL を加えます。室温で保存してください。
- E3に1%の低融点(LMP)アガロースを作ります。1gのLMPアガロースを100mLのE3に溶解させ、マイクロ波で高出力で1〜2分間煮沸する。アリコート溶融アガロースを1.7mLマイクロフュージチューブに入れ、4°Cで保存した。 水浴中で沸騰させ、埋め込みに使用する準備ができたら40°Cのヒートブロックに保持する。
- 10倍ストック(1 M NaCl、20 mM KCl、10 mM MgSO4、20 mM CaCl2-二水和物、50 mM HEPES、10 M NaOHでpHを7.5に調整し、その後オートクレーブ処理し、室温で保存)を希釈することによって、Marc's Modified Ringers(MMR 15)等張溶液を作る。10 mL の 10x MMR を 90 mL の脱イオン水に加えます。
- 製造元の指示に従ってシルガードプレートを注ぎ、数日間セットして乾燥させる16。
- タングステン針を電気的に研ぐ(プロトコルは 17から変更)。
- まず、スクリュートップ蓋付きの口の広いガラス瓶に200mLの脱イオン水を加えて10%(w / v)KOH溶液を調製する。20gのKOHペレットをゆっくりとかき混ぜる。
注:この苛性溶液は非常に発熱性があります。手袋と目の保護具を着用し、フード内の溶液をかき混ぜる。 - 長さ2〜3cmのタングステン線を切断し、針ホルダーに挿入します。
- カソード線とアノード線を電源に接続します。陰極線の端にあるワニ歯クリップを部分的にまっすぐにしたペーパークリップに取り付け、ペーパークリップをKOH溶液に挿入して瓶の側面に取り付けます。
- 次に、陽極ワイヤーのワニ口クリップを針ホルダーの首に取り付けます。電源を入れ(〜20Vまで)、タングステンワイヤをKOH溶液に浸し、ワイヤを溶液から斜めに引き出して、ワイヤを電気的に鋭くして微細な先端にします。
注:気泡は、反応が進行するにつれてペーパークリップから来る。 - 解剖顕微鏡の下で針の先端をチェックして、十分に鋭いことを確認します。
- 脱イオン水で針をすすぎ、すべてのKOH残留物を除去します。事前にいくつかの針を作り、幼虫の手術と解剖までそれらを保管してください。
- まず、スクリュートップ蓋付きの口の広いガラス瓶に200mLの脱イオン水を加えて10%(w / v)KOH溶液を調製する。20gのKOHペレットをゆっくりとかき混ぜる。
- 直立共焦点顕微鏡でゼブラフィッシュ標本をイメージングするためのチャンバースライドを作成します。
- ガラス顕微鏡スライドと2液型エポキシ樹脂を得る( 材料表参照)。パッケージの説明書に従ってエポキシを混ぜ合わせ、スライドガラスに太いリングまたは長方形を塗ります。スライドを硬化させ、フード内で少なくとも24時間乾燥させてから使用してください。
2. 胚採取・飼育
- 午後遅く/夕方に繁殖箱で目的の遺伝子型の成体雄魚と雌魚をペアにします。翌朝、産卵後、メッシュストレーナーで新しく受精した卵を集め、100mmのペトリ皿でE3に移します。
- 手術当日まで、胚を約27.5°Cで14時間の明暗サイクルで孵化させる。E3 を毎日、または必要に応じて変更します。
- 収穫されたワムシでいっぱいのスポイトを使って幼虫に1日1回餌を与え、受精後5日(dpf)または手術後1日のいずれかから開始する。幼虫が数時間食べた後、E3を変更して残りのワムシや老廃物を取り除きます。
注:手術当日に幼虫に餌を与えないでください。
3.幼虫を手術のために準備する
- 手術当日は、広口径のガラスパスツールピペットを使用して、10〜15匹の幼虫を新鮮なE3で満たされた35mmのペトリ皿に移します。
- 0.4%w/vトリカイン溶液(210mM Trisに溶解した0.4gトリカイン、pH9;必要に応じてpH7.4に調整した最終溶液18)を3〜5滴の0.0015%w/vトリカインでディッシュに加えることによって幼虫を麻酔する。幼虫が適切に麻酔されているかどうかを判断するために、接触に対する反応の欠如を探してください。約3分経ってもまだタッチに反応しない場合は、トリカイン溶液付き0.4%の滴をさらに2〜3滴追加して再評価します。
注:発達のこの段階では、解剖顕微鏡下で運動性に加えて血流および心拍数を監視することが可能である。 - 麻酔をかけたゼブラフィッシュ幼虫をE3に溶解した1%LMPアガロースに埋め込んで固定化する。
- まず、35mmペトリ皿の蓋を解剖顕微鏡の下に上向きに置きます。次に、1匹の幼虫を少量のE3だけで狭い穴のガラスパスツールピペットに入れます。
- 次いで、融解した〜200μLの1%LMPアガロースを幼虫と共にピペットに温め(〜40°C)吸引する。最後に、幼虫とアガロースを逆さまのペトリ皿のふたに噴き出します。
- 鈍いタングステン針を使用して、片目が上を向いて横向きになるように幼虫を素早く、しかし穏やかに操縦します。アガロースがセットされるのを待ちます(〜5分)。
注:幼虫が側方でなくともアガロースが固まった場合は、アガロースから解放し(ステップ5で説明)、E3とトリカインを入れて皿に戻します。
4. 眼球除去
- アガロースがセットされ、幼虫が横方向に配置されたら、非常に細かく、電気的に研ぎ澄まされたタングステン針の先端を使用して、眼窩の端に続いて、目の周りの皮膚を突き刺す。
- 次に、針の端(先端ではない)を眼の側頭腹側から眼の下にスライドさせます。制御された圧力を使用して、ソケットから目を離します。
- 非常に細かい外科用鉗子を使用して、視神経をつまみ、目を内側から側方に押し込むことによって目を取り除きます。あるいは、針の側面で眼を背側と前方に押し続け、最終的に視神経を切り裂いて眼を解放する。
注:手術中に目以外の組織が誤って刺された場合は、迅速な断頭によって幼虫を迅速かつ人道的に殺してください。
5. 実験エンドポイントまでの術後ケア
- 眼の除去が成功したら、アガロースをMMR溶液で覆います。
- 鉗子でペトリ皿のふたを安定させながら、タングステン針を頭の周りに、次に体の周りに優しくブラッシングすることによって、各幼虫をアガロースから解放する。
- 片目の幼虫を、ペニシリン/ストレプトマイシンカクテルの1:100希釈を加えたMMRを含む35mmペトリ皿に移す。胚を〜27.5°Cで14時間の光/10時間の暗サイクルでインキュベートする。
注:抗生物質を補充したMMRのこの等張溶液は、最初は幼虫の治癒と生存を助けます。各皿は最大15匹の回復幼虫を保持することができます。 - 翌日、幼虫をE3に戻す。手術後の午後から、収穫されたワムシでいっぱいのスポイトを使って幼虫(〜6dpf以上)に1日1回餌をやる。幼虫が数時間食べた後、E3を変更して残りのワムシや老廃物を取り除きます。
6.幼虫の固定
- 幼虫が分析のための所望の発育段階に達したら、心臓が止まるまで致死量のトリカイン(〜0.4%最終濃度)で麻酔をかける。
- 1.5 mLマイクロフュージチューブあたり最大30匹の幼虫のピペット。過剰なE3を除去し、次いで0.5〜1mLの固定液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)および4%スクロース))を加えて組織を固定する。幼虫を4°Cで一晩孵化させる。
- 固定剤を除去し、PBSで幼虫を3〜4回すすぐことによって、翌日にPBSで幼虫を洗浄する。解剖前に最大7日間、幼虫を4°Cで保存する。
7.幼虫を解剖して脳を明らかにする( 15から適応)
- 固定した幼虫をPBS液滴に懸濁させ、解剖顕微鏡下でシルガードプレート上に滴下する。脊索を通して2本のタングステンピン(典型的には2cm未満の古いタングステン針)を配置し、1本のピンが大動脈 - 生殖腺 - 中腎(AGM)領域を覆う色素沈着領域のすぐ後方に置き、もう1本のピンを卵黄伸長の端に沿って配置することによって、それらを横方向に固定する。
注:タングステンピンは、穿刺するたびに組織がより砕けやすくなるため、できるだけ少ない試行で配置してください。 - 非常に鋭いタングステン針と針の鋭い鉗子を使用して、目、耳、顎、消化管、背側頭蓋皮膚をこの順序で除去することによって脳を露出させます。
- まず、ステップ4の外科的眼球除去と同様の手法を用いて眼を除去する。次に、幼虫のピンを外して反対側にひっくり返し、もう一方の目がアクセス可能になるようにして繰り返します。あるいは、針を顎から反対側に突き刺し、ピンを外さずに目を取り除きます。
注:この組織の分析が必要な場合は、この時点で目を集めることができます( 19と同様)。 - 次に、タングステン針を使用して、耳の側頭から腹側に引っ掻きます。同じ動作/動きで、針を顎に後部持ってきて、耳と顎が取り除かれるまで静かに前方に引っ張ります。
- 鉗子を使用して腹側器官と残りの卵黄を引き出します。
- 最後に、後脳と脊髄の接合部付近の背側頭蓋皮膚に浅い切開を行います。鉗子で皮膚を持ち上げ、それを前方および間脳の周りに引っ張る。これが難しすぎることが判明した場合は、後脳の最初の切開から始めて、まず皮膚を横方向に、次に腹側および前方に引っ張り、テクタムの側縁を傷つけないように細心の注意を払ってください。
注:中脳は研究対象であるため、後脳を切断することができます。しかし、深い切開は断頭につながる可能性があります。 - 鉗子で残りの組織を取り除きます。幼虫のピンを外し、1.5mLマイクロフュージチューブ内のPBSに移す。
メモ: テールを脳に取り付けたままにしておいて、全体マウントプロトコルを実行する際の視認性を高めてください。
- まず、ステップ4の外科的眼球除去と同様の手法を用いて眼を除去する。次に、幼虫のピンを外して反対側にひっくり返し、もう一方の目がアクセス可能になるようにして繰り返します。あるいは、針を顎から反対側に突き刺し、ピンを外さずに目を取り除きます。
8.脳の脱水と貯蔵
- 脳からPBSを除去し、0.1%TritonX-100(PBST)を含むPBSを1mL加える。室温で5〜10分間インキュベートする。
- PBSTを取り出し、50:50のメタノール:PBST溶液と交換してください。室温で5〜10分間インキュベートする。
- 100%メタノール(MeOH)で脳を室温で5分間2回洗浄する。
- 免疫組織化学または他のホールマウント手順を実行する前に、脳を-20°Cで100%MeOHに少なくとも16時間保存する。
注:脳は、-20°Cで最大2年間MeOHに保存することができます。
9. 免疫組織化学
メモ: ゼブラフィッシュの多くの有用なホールマウント技術に関する確立されたプロトコルは、ZFIN20 にあります。この原稿では、 Tg[atoh7:RFP] ラインの視神経軸索で発現している赤色蛍光タンパク質(RFP)または有糸分裂細胞を強調するリン酸化ヒストンH3(PH3)(図3)のいずれかを認識する抗体で免疫染色した片目と両目の幼虫を比較した例を提供します。ホールマウント胚および幼虫に対する標準的な免疫組織化学プロトコールを以下に要約する。
- まず、検体を50:50 MeOH:PBSTで5分間インキュベートし、次に30:70 MeOH:PBSTで5分間インキュベートし、PBSTを3回洗浄して終了することにより、室温での段階的な一連のMeOH:PBST洗浄で幼虫脳を再水和させる。
- 脳を透過させるために、プロテイナーゼK(PK)を添加したPBST中で、最終濃度20μg/ml PKで37°Cで30分間インキュベートする。 10 mg/mL PK のアリコートを -20 °C で保管し、使用前に解凍してください。
- PK溶液を除去し、PBSTで脳を15分間にわたって3回すすぐことによって、残りの酵素を洗い流す。
- 透過処理された脳を、4%PFA中で25°C(または室温)で20分間インキュベートすることによって、それらを固定する。その後、PFAを除去し、PBSTで15分間にわたって脳を3回すすぐことによって、残りの固定剤を洗い流す。
- 最終的なPBSTリンスを新しく作った免疫ブロッキング(IB)バッファー(PBST中の10%正常ヤギ血清および1%DMSO)と交換し、室温で少なくとも1時間インキュベートする。
- 一次抗体を適切な濃度(例えば、RFPの場合は1:500、 PH3抗体の場合は1:300)でIBバッファーに希釈します。
- 脳からIBバッファーを除去し、一次抗体希釈液と交換する。穏やかなロッキングを有するオービタルシェーカー上で4°Cで一晩インキュベートする。チューブが両側にしっかりと置かれていることを確認します。
- 翌朝、マイクロピペットで一次抗体溶液を取り出し、PBSTで数回すすぎ、PBSTで脳を室温で4 x 30分間洗浄します。
注:一次抗体希釈液は、4°Cで保存した場合、約7日以内に1回再利用することができます。 - 二次抗体を適切な濃度(例えば、 Alexa-fluor 568抗ウサギの場合は1:500)でIBバッファーに希釈しながら、脳をIBバッファーですすいでください。
- IBバッファーを除去し、二次抗体希釈液と交換する。軌道シェーカー上で4°Cで一晩インキュベートし、チューブの側面を穏やかに揺らします。
- 翌朝、二次抗体溶液を除去し、PBSTですすぎ、次いでPBST中で4 x 30分間PBSTで脳を洗浄する。
- 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)またはToPro3(PBST中1:5,000をPBSTで4°C一晩)で対比染色する。
- 翌朝、幼虫の脳をPBSに移し、以下の取り付けおよびイメージング手順に進みます。
10. 取り付けとイメージング
- 真空グリースで100mmのペトリ皿の蓋にチャンバー付きスライドを固定します。
- 免疫染色および処理された幼虫をウェルプレートまたは窪みスライドに移し、解剖顕微鏡でそれらを見る。
- 幼虫を1%LMPアガロースの柱のチャンバースライドに取り付ける。
- ガラス製パスツールピペットを使用して、チャンバー付きスライドに1匹の幼虫を置き、PBSをできるだけ少なく堆積させます。同じピペットで、幼虫を溶融した1%LMPアガロース(〜40°C)で覆う。
- 鈍いタングステン針または鉗子で、アガロースを柱に引き込み、背側表面が見えるように、幼虫をできるだけ対称的に配置します。
- 残りの幼虫に対してこの手順を繰り返します。
- アガロースがゲル化したら、数滴のPBSで覆い、共焦点顕微鏡のステージに置きます。
- 対物レンズをサンプルに合わせ、透過光を使用して顕微鏡に焦点を合わせ、適切なレーザーでサンプルを照らします。
メモ: この例では、DAPI と RFP を励起するためにそれぞれ 405 nm と 568 nm の波長が使用されています。 - ゲイン、オフセット、レーザー出力を調整するには、スライダバーを信号と使用する検出器に対して適切なレベルに動かします。各チャンネルのヒストグラムを確認し、画像の上にある飽和 インジケーターの状態 ボタンをクリックして露出レベルを測定し、どのピクセルも飽和していないこと、および信号対雑音比が高いことを確認します。ゼブラフィッシュ内の細胞および細胞内分解能のための最適な共焦点画像化パラメータの例については、 21を参照されたい。
- Z 平面のスタックの上限と下限を設定するには、マウスのスクロールホイールを使用してサンプルの上下を見つけます。画像取得の上限と下限をクリックし、[ 今すぐ実行 ] ボタンをクリックして Z-stack キャプチャをトリガーします。
注:脳がどれだけ対称的に取り付けられているかに応じて、9 dpf幼虫ゼブラフィッシュ脳の総z深さは〜150〜200μmになります。 - 色盲のアクセシビリティを念頭に置いて画像を処理および色付けします(たとえば、2 色の画像には青とオレンジ、またはマゼンタと緑を使用します)。画像のキャプチャに使用するソフトウェアや、Adobe の Photoshop などの画像処理ソフトウェアでルックアップテーブルを設定します。
- Photoshop では、(i) 画像モードを RGB に変換し、(ii) 画像モードの下にある [ 曲線 ] オプションにアクセスすることにより、カラーの生の顕微鏡写真が 8 ビットのタグ付き画像ファイル形式 (TIFF) として保存 さ|調整 メニュー、次いで(iii)所望の色を達成するために適切な色付き光出力を0または255レベルにスライドさせる。たとえば、 緑色の信号を得るには、 赤色チャンネル を選択し、その出力を0にスライド させます。次に、 Blueチャンネル を選択し、その出力も 0 にスライドさせます。同様に、 マゼンタ信号を得るには、 グリーンチャンネル を選択し、その出力を0にスライド させます。赤と青のチャンネルはそのままにしておきます。
注意: 同様の手順は、無料の Gnu Image Manipulation Program (GIMP) でも実行できます。 - 特定のマーカーを表示するセルの数を手動で定量化するには、ImageJ22 のセルカウンタープラグインを使用します (プラグインメニューの [分析 ] にあります)。細胞数に ImageJ を使用する方法の例は、 23 を含む多くのチュートリアルで見つけることができます。
- RStudio などの統計ソフトウェアでデータのグラフィカル表現を生成します (詳細については、「」の補足データを参照してください)。RMD ファイル)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
眼球除去が完了したかどうかを確認し、視蓋がどのように変化するかを評価するために、すべてのRGCを膜標的RFPでラベル付けし、したがって網膜から突出して視神経を形成するすべての軸索24を有するTg[atoh7:RFP]株で手術を行った。この菌株を使用することは絶対に必要ではありませんが、視蓋神経ニューロピルにおける視神経末端の簡単な観察と可視化を可能にします。親油性DiIまたはDiO色素25、26による軸索トレース、またはbrainbow 27によるマルチスペクトル標識など、視神経を標識するための他のアプローチも可能であるであろう。
図2に示すように、眼科神経鞘における網膜軸索の進行性変性は、眼球除去後に観察された。手術後2日までに、RFP標識軸索は、ブレビングおよびフラグメンテーションなどの急速なウォラー変性28の特徴を示した(図2A、B)。最近の研究は、ニューロンがサイレンシングされるとミクログリアがより多くのミエリン物質を包み込むことを示している29。ミクログリアが退化RGC軸索のビットを包み込み、変性源から離れるのと一致して、テクタルニューロピルの内外の明るいRFP標識穿刺が認められた(図1B、矢印)。術後4日までに、断片化された軸索およびRFP標識軸索破片がいずれの胸郭葉においてもかなり減少し、死にかけている軸索および退化した軸索の比較的迅速なクリアランスを示している(図2C、D)。
全卵免疫組織化学を行い、幼虫ゼブラフィッシュの視蓋を視覚化するために、皮膚および結合組織の眼、顎、耳、および頭蓋骨キャップを解剖することによって脳を露出させた。理想的には、この手順の間、脳は無傷のままである(例えば、図2C、D)。しかし、前脳の一部、特に嗅球は、皮膚または顎の頭蓋骨キャップを取り外すと、損傷または完全に除去される可能性が高い(図2A、矢じり)。さらに、皮膚を穿刺またはつまんで脳から引き離すときに、テクタムの側縁をスライスすることがあります(例えば、図2A;右胸蓋葉の裂け目)。
免疫組織化学はまた、PH3抗体で全脳を染色することによって、眼テクタムの神経支配された葉および非神経化された葉における有糸分裂細胞の数を評価するためにも使用された。これらのデータは、片目の幼虫の魚の脱神経側の有糸分裂細胞が有意に少ないことを示している(p = 0.00033、ウェルチの t検定; 図3)。
図2:5dpfでの眼球除去は、視神経軸索の変性を引き起こす。 (A-D)7dpf(A)または9dpf(C)で固定された無傷の幼虫、または5dpf、固定された2dps(B)または4dps(D)での眼摘出手術からの片目の幼虫の背部図を示す代表的な最大強度投影。すべての核はDAPI(緑色)で染色され、視神経テクタムのニューロピルで終端する視神経軸索はatoh7:RFP導入遺伝子(マゼンタ)によって標識される。アスタリスクは、右目のみが無傷の幼虫における神経支配されたテクタルニューロピルを示す。矢印は、脱神経化された光学テクタムから発せられる縮退したRGC軸索の断片の例を示す。矢印は、前脳の欠落部分を示す。スケールバー = 50 μm。略語: dpf = 受精後日数;dps = 手術後の日数;RGC = 網膜神経節細胞;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:視蓋内の有糸分裂細胞の数は、神経支配とともに増加する。 (A−B)無傷(A)または片目(B)からの野生型脳の背側図を示す代表的な最大強度突起9dpf幼虫は、有糸分裂マーカーPH3(マゼンタ)に対する抗体で免疫染色され、核はDAPIで対比染色された(緑色)。アスタリスクは、無傷の右目からの神経支配されたテクタルニューロピルを示す。(C)片目(n = 12)および両眼(n = 8)9 dpf幼虫の差比(左 - 右/合計)としての神経支配(左)対高密度(右)テクタルローブにおけるPH3+ 細胞の比の定量を示すすべての個々のデータポイントを重ね合わせた箱ひげ図。ウェルチの t検定と比較した2つの条件の平均(***, p < 0.0005)。スケールバー = 50 μm。略語: dpf = 受精後日数;dps = 手術後の日数;pH3 = リン酸化ヒストンH3;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル: 図 3C に示すプロットの概要と手順。 このファイルにはすべてのデータとコードが含まれているため、 図 3C に示すように、すべてのユーザーがすべてのデータ ポイントを重ねた箱ひげ図を再現できます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この論文で説明する技術は、ゼブラフィッシュにおける脊椎動物の視覚系発達を研究するための多くのアプローチの1つを示しています。他の研究者は、胚性網膜を解剖し、遺伝子発現解析19 を実行する方法、または視蓋骨30におけるニューロン活性を視覚化する方法を発表した。この論文は、差動網膜入力が視蓋内の細胞挙動にどのように影響するかを探るためのアプローチを提供する。
手術後の駆除と幼虫の生存を確実に成功させるためには、幼虫が健康で、適切に麻酔をかけ、1%のアガロースで固定することが重要です。鉗子とタングステン針が非常に鋭く清潔であることも重要です。幼虫は、手術の24時間前または手術後に給餌されていないときに最もよく生存し、抗生物質を補充したMMRで幼虫を飼育すると、治癒プロセスが速くなる。重要なことに、MMRのより高いイオン強度、特にカルシウムのより高い濃度は治癒を促進する14。しかし、より高い塩分濃度へのより長い曝露は、胚性ゼブラフィッシュ31で文書化されているものと同様に、生存率を低下させる可能性がある。最も重要なステップは、免疫染色されたサンプルの画像のデータ分析に不可欠な脳解剖を成功させるための固定です。4%スクロースを添加した作りたての4%PFA(愛情を込めて甘い固定と呼ばれる)を使用すると、皮膚除去と脳組織保存の容易さが向上する傾向があります。手術と同様に、鋭く清潔な道具は脳を解剖するために不可欠です。
このプロトコルの最大の課題の1つは、眼外科手術のために幼虫を埋め込むことです。幼虫の目を確実に素早く取り除くことができるように、各人が自分にとって最適な方法を見つけることが重要です。手術中に幼虫が誤って刺された場合は、斬首によって人道的に殺してください。もう1つの課題は、ホールマウント免疫染色に最も効果的な抗体濃度を決定することです。適切な抗体濃度を決定するときは、公開された文献を出発点として使用し、異なる組織(特に大型組織または高齢動物)で公開された試薬を使用すると、濃度および/またはインキュベーション時間の増加が必要になる可能性があるため、プロトコルを最適化します。
この方法の主な制限は、1回の実験が最初から最後までかかる時間と、いつでも研究できる魚の数です。たとえば、図 3 に示すすべてのデータは、魚の最初のペアリングから最終的なデータ収集と分析まで約 1 か月かかりました。この比較的低スループットのアプローチは、視覚系32,33における神経活動を選択的に沈黙させる異種遺伝的アプローチ、またはRGC軸索または活性34,35を欠く変異体によって補完され得る。
この方法の重要性は、それが現代のトランスジェニック魚系統に担う伝統的な発生学的技術をもたらし、同じ個体内の各テクタルローブで動作する細胞的および遺伝的メカニズムの直接比較を可能にすることである。さらに、この方法は、蛍光標識ミクログリア37、38、39およびアストロサイト40を有するアスチャナックス表面魚36および/またはトランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫を含む他の実験系への適用に熟しており、発達中の魚の神経系がそのような劇的な傷害にどのように反応するかを研究する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究のための資金は、主にリードカレッジからKLCへのスタートアップ資金、OLHへのヘレンスタッフォードリサーチフェローシップ資金、およびYKへのリードカレッジサイエンスリサーチフェローシップによって支えられました。このプロジェクトは、Wellcome Trust Studentship(2009-2014)の支援を受けたHRとのコラボレーションとして、Steve Wilsonの研究室で始まりました。このプロジェクトに関する最初の議論をしてくれたMáté Varga、Steve Wilson、およびWilson研究室の他のメンバーに感謝し、特にKLCにアガロースに胚をマウントし、ゼブラフィッシュの脳解剖を行う方法を最初に教えたFlorencia CavodeassiとKate Edwardsに感謝します。また、タングステン針研ぎ装置の組み立てに協力してくれたグレタ・グローバーとジェイ・ユーイングにも感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and supplies: | |||
| Breeding boxes | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Dow Corning high vacuum grease | Sigma or equivalent supplier | Z273554 | |
| Erlenmeyer flasks (125 mL) | For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation. | ||
| Fine forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipettes | DWK Lifescience | 63A53 & 63A53WT | For pipetting embryos and larvae. |
| Glass slides for microscopy | VWR or equivalent supplier | 48311-703 | Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers. |
| Glassware including graduated bottles and graduated cylinders | For making and storing solutions. | ||
| 2-part epoxy resin | ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent | 0.85 oz syringe | https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793 |
| Microcentrifuge tube (1.7 mL) | VWR or equivalent supplier | 22234-046 | |
| Nickel plated pin holder (17 cm length) | Fine Science Tools (FST) | 26018-17 | To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections. |
| Nylon mesh tea strainer or equivalent | Ali Express or equivalent | For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html | |
| Paper clip | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Petri dishes 100 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 50-190-0267 | |
| Petri dishes 35 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 08-757-100A | |
| Pipette pump | SP Bel-Art or equivalent | F37898-0000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma | 909122 | For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water. |
| Power supply (variable voltage) | For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis). | ||
| Sylgard 184 Elastomer kit | Dow Corning | 3097358 | |
| Tungsten wire (0.125 mm diameter) | World Precision Instruments (WPI) | TGW0515 | Sharpen to remove eye and dissect larvae. |
| Variable temperature heat block | The Lab Depot or equivalent supplier | BSH1001 or BSH1002 | Set to 40-42 °C ahead of experiments. |
| Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar) | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Wires with alligator clip leads | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Microscopes: | |||
| Dissecting microscope | Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred. | ||
| Laser scanning confocal microscope | High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work. |
||
| Reagents for surgeries and dissections: | |||
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| HEPES | Sigma | H7006 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 1374248 | For embryo medium (E3). |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock). |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333-20ML | Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | Diagnostic BioSystems | DMR E404-01 | Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration. |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4. |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tricaine-S | Pentair | 100G #TRS1 | Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE |
| Reagents for immunohistochemistry: | |||
| Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG | Invitrogen | A-11011 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| DAPI or ToPro3 | Invitrogen | 1306 or T3605 | Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | A component of immunoblock buffer. |
| Methanol (MeOH) | Sigma | 34860 | Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using. |
| Normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 50-062Z | A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C. |
| Primary antibody to detect phosphohistone H3 | Millipore | 06-570 | Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives) | MBL International | PM005 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Proteinase K (PK) | Sigma | P2308-10MG | Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS. |
| Software for data analysis | |||
| ImageJ (Fiji) | Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| RStudio | Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | ||
| Adobe Photoshop or GIMP | Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/) | ||
| Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains. | Available from the Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication. |
References
- Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
- Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
- Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
- Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
- Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021).
- Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021).
- Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
- White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
- Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
- Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
- Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Cold Spring Harbor Protocols. Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A.
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- ZFIN Tricaine recipe. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018).
- Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).
- ZFIN protocols. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021).
- Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).
- ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: https://figi.sc/ (2021).
- O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
- Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
- Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
- Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
- Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
- de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).
- Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
- Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
- Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
- Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
- Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
- Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).
- Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
- Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
- Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
- Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).
