Bioréacteur guidé par imagerie pour la génération de tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie
Summary
Le protocole décrit un bioréacteur basé sur l’imagerie qui permet l’élimination sélective de l’épithélium endogène de la trachée du rat et la distribution homogène des cellules exogènes à la surface de la lumière, suivie d’une culture in vitro à long terme de la construction du tissu cellulaire.
Abstract
Les lésions répétées des tissus des voies respiratoires peuvent altérer la fonction pulmonaire et causer des maladies pulmonaires chroniques, comme la maladie pulmonaire obstructive chronique. Les progrès de la médecine régénérative et des technologies de bioréacteur offrent des possibilités de produire des tissus fonctionnels et des organes cultivés en laboratoire qui peuvent être utilisés pour dépister des médicaments, modéliser des maladies et concevoir des remplacements tissulaires. Ici, un bioréacteur miniaturisé couplé à une modalité d’imagerie qui permet la visualisation in situ de la lumière interne de la trachée de rat explantée lors de la manipulation et de la culture de tissus in vitro est décrit. À l’aide de ce bioréacteur, le protocole démontre l’élimination sélective guidée par imagerie des composants cellulaires endogènes tout en préservant les caractéristiques biochimiques intrinsèques et l’ultrastructure de la matrice tissulaire des voies respiratoires. En outre, la livraison, la distribution uniforme et la culture prolongée ultérieure de cellules exogènes sur la lumière décellularisée des voies respiratoires avec surveillance optique in situ sont montrées. Les résultats soulignent que le bioréacteur guidé par imagerie peut potentiellement être utilisé pour faciliter la génération de tissus fonctionnels des voies respiratoires in vitro .
Introduction
La surface luminale des voies respiratoires est tapissée d’une couche d’épithélium qui se compose principalement de cellules souches multiciliées, en massue, en gobelet et basales 1,2. La couche épithéliale sert de mécanisme de défense primaire du poumon, agissant comme une barrière biophysique qui protège le tissu sous-jacent des voies respiratoires contre les agents pathogènes inhalés, les particules ou les gaz chimiques. Il protège le tissu des voies respiratoires par de multiples mécanismes, y compris la formation de jonctions étroites intercellulaires, la clairance mucociliaire et la sécrétion d’antimicrobiens et d’antioxydants 3,4. L’épithélium défectueux des voies respiratoires est associé à des maladies respiratoires dévastatrices, telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)5, la dyskinésie ciliaire primaire (PCD)6 et la fibrose kystique (FK)7.
Les progrès de la technologie des poumons sur puce (LOC) représentent une occasion d’étudier le développement pulmonaire humain, de modéliser diverses maladies pulmonaires et de développer de nouveaux matériaux thérapeutiques dans des environnements in vitro étroitement réglementés. Par exemple, l’épithélium et l’endothélium des voies respiratoires peuvent être cultivés sur les côtés opposés d’une membrane mince et poreuse pour imiter le tissu pulmonaire échangeant du gaz, ce qui permet une modélisation fidèle de la maladie et des tests demédicaments 8. De même, des modèles de maladies in vitro ont été créés pour modéliser les maladies des voies respiratoires in vitro, telles que la MPOC9 et la fibrose kystique10. Cependant, un défi majeur des dispositifs LOC est de récapituler l’architecture tridimensionnelle complexe (3D) du tissu pulmonaire et les interactions dynamiques de la matrice cellulaire-tissulaire in vitro11.
Récemment, des méthodologies innovantes d’ingénierie tissulaire ont été développées qui permettent la manipulation des tissus pulmonaires ex vivo 12. À l’aide de ces méthodologies, des greffes de tissus allogéniques ou xénogéniques dénudés peuvent être préparées en éliminant les cellules endogènes du tissu pulmonaire par des traitements chimiques, physiques et mécaniques13. En outre, la matrice extracellulaire (ECM) tissulaire native préservée dans les échafaudages pulmonaires décellularisés fournit les indices structurels, biochimiques et biomécaniques physio-mimétiques permettant aux cellules implantées de se fixer, de proliférer et de se différencier14,15.
Ici, un système de bioréacteur guidé par imagerie créé en combinant les technologies LOC et d’ingénierie tissulaire pour permettre la manipulation tissulaire in vitro et la culture de tissus trachéaux de rat explantés est rapporté. À l’aide de ce bioréacteur tissulaire des voies respiratoires, le protocole démontre l’élimination sélective des cellules épithéliales endogènes sans perturber les composants cellulaires et biochimiques sous-épithéliaux sous-jacents du tissu des voies respiratoires. Nous montrons ensuite la distribution homogène et le dépôt instantané des cellules exogènes nouvellement ensemencées, telles que les cellules souches mésenchymateuses (CSM), sur la lumière des voies respiratoires dénudées en instillant la solution de pré-gel de collagène I chargée de cellules. De plus, en utilisant le dispositif d’imagerie micro-optique intégré dans le bioréacteur, la visualisation de la lumière de la trachée lors de l’élimination de l’épithélium et de la livraison de cellules endogènes est également effectuée. En outre, il est démontré que la trachée et les cellules nouvellement implantées peuvent être cultivées dans le bioréacteur sans mort cellulaire notable et dégradation des tissus pendant 4 jours. Nous envisageons que la plate-forme de bioréacteur basée sur l’imagerie, la technique de désépithélialisation à base de couches minces et la méthode d’administration cellulaire utilisée dans cette étude peuvent être utiles pour générer des tissus des voies respiratoires pour la modélisation in vitro de la maladie et le dépistage des médicaments.
Le bioréacteur comprend une chambre rectangulaire reliée à une pompe à seringue programmable, une pompe de perfusion et un ventilateur pour la culture de la trachée isolée du rat. Le bioréacteur comporte des entrées et des sorties reliées à la trachée ou à la chambre de culture tissulaire pour fournir séparément des réactifs (p. ex. milieux de culture) aux espaces internes et externes de la trachée (figure 1). Un système d’imagerie sur mesure peut être utilisé pour visualiser l’intérieur de la trachée de rat cultivée in vitro au niveau cellulaire (Figure 2). L’épithélium endogène de la trachée est éliminé par instillation d’une solution de décellularisation à base de détergent suivie d’un lavage des voies respiratoires assisté par vibration (Figure 3). La solution d’hydrogel, telle que le collagène de type I, est utilisée comme vecteur pour l’ensemencement uniforme et instantané des cellules exogènes à travers la lumière de la trachée dénudée (Figure 4). Tous les matériaux utilisés pour construire le bioréacteur et mener les expériences sont fournis dans la table des matériaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce travail, nous avons créé un bioréacteur guidé par imagerie qui peut permettre (i) la surveillance de la lumière de la trachée in situ après l’élimination cellulaire et l’administration cellulaire exogène et (ii) la culture in vitro à long terme du tissu trachéal ensemencé cellulaire. À l’aide de ce bioréacteur sur mesure, nous avons démontré (i) l’élimination sélective des cellules épithéliales endogènes de la lumière de la trachée à l’aide d’un détergent et …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue en partie par l’American Thoracic Society Foundation Research Program, la New Jersey Health Foundation et la National Science Foundation (CAREER Award 2143620) à J.K.; et les National Institutes of Health (P41 EB027062) à G.V.N.
Materials
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 – D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
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