생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기
Summary
이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.
Abstract
기도 조직에 대한 반복적 인 손상은 폐 기능을 손상시키고 만성 폐쇄성 폐 질환과 같은 만성 폐 질환을 일으킬 수 있습니다. 재생 의학 및 생물 반응기 기술의 발전은 약물을 스크리닝하고, 질병을 모델링하고, 조직 교체를 엔지니어링하는 데 사용할 수있는 실험실 성장 기능 조직 및 장기 구조물을 생산할 수있는 기회를 제공합니다. 여기에서, 시험관내 조직 조작 및 배양 동안 외식화된 래트 기관지의 내강을 계내에서 시각화할 수 있게 하는 이미징 양식과 결합된 소형화된 생물반응기가 설명된다. 이 생물반응기를 사용하여, 프로토콜은 기도 조직 매트릭스의 본질적인 생화학적 특징과 울트라구조를 보존하면서 내인성 세포 성분의 영상화 유도 선택적 제거를 입증한다. 더욱이, 계내에서 광학 모니터링을 갖는 탈세포화된 기도 루멘 상의 외인성 세포의 전달, 균일한 분포, 및 후속적인 연장된 배양이 도시된다. 이 결과는 영상-유도된 생물반응기가 잠재적으로 기능적인 시험관내 기도 조직의 생성을 용이하게 하는데 사용될 수 있다는 것을 강조한다.
Introduction
호흡기의 발광 표면은 주로 다중 섬모, 클럽, 잔 및 기저 줄기 세포 1,2로 구성된 상피 층으로 줄 지어 있습니다. 상피층은 폐의 주요 방어 메커니즘 역할을하며, 흡입 된 병원균, 미립자 또는 화학 가스로부터 기저기도 조직을 보호하는 생물 물리학 적 장벽 역할을합니다. 그것은 세포 간 단단한 접합 형성, 점액 균 클리어런스, 항균 및 항산화 분비 3,4를 포함한 여러 메커니즘을 통해기도 조직을 보호합니다. 결함이있는기도 상피는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)5, 원발성 섬모 운동 장애 (PCD)6 및 낭포성 섬유증 (CF)7과 같은 치명적인 호흡기 질환과 관련이 있습니다.
폐 온 칩 (LOC) 기술의 발전은 인간의 폐 발달을 연구하고, 다양한 폐 질환을 모델링하고, 엄격하게 조절되는 체외 환경에서 새로운 치료 물질을 개발할 수있는 기회를 나타냅니다. 예를 들어, 기도 상피 및 내피는 폐 조직을 교환하는 가스를 모방하기 위해 얇고 다공성 멤브레인의 반대편에서 배양될 수 있어, 충실한 질병 모델링 및 약물 테스트(8)를 가능하게 한다. 유사하게, 시험관내 질환 모델은 COPD9 및 낭포성 섬유증10과 같은 시험관내 기도 질환을 모델링하기 위해 생성되었다. 그러나, LOC 디바이스의 주요 과제는 시험관내(11)에서 폐 조직 및 동적 세포-조직 매트릭스 상호작용의 복잡한 3차원(3D) 아키텍처를 재반복하는 것이다.
최근에, 생체외 폐 조직(12)의 조작을 허용하는 혁신적인 조직 공학 방법론이 개발되었다. 이들 방법론을 사용하여, 탈착된 동종성 또는 이종 조직 이식편은 화학적, 물리적, 기계적 치료(13)를 통해 폐 조직으로부터 내인성 세포를 제거함으로써 제조될 수 있다. 또한, 탈세포화된 폐 스캐폴드 내의 보존된 천연 조직 세포외 매트릭스(ECM)는 이식된 세포가 부착, 증식 및 분화하기 위한 물리-모방 구조적, 생화학적, 및 생체역학적 단서를 제공한다(14,15).
여기서, 시험 관내 조직 조작 및 삼출된 쥐 기관 조직의 배양을 허용하기 위해 LOC와 조직 공학 기술을 결합하여 만들어진 영상-유도 생물반응기 시스템이 보고된다. 이 기도 조직 생물반응기를 사용하여, 프로토콜은 기도 조직의 근본적인 상피하 세포 및 생화학적 성분을 파괴하지 않으면서 내인성 상피 세포의 선택적 제거를 입증한다. 다음으로 우리는 새로 시딩된 외인성 세포, 예컨대 중간엽 줄기 세포 (MSCs)의 균질한 분포 및 순간적인 침착을 보여주고, 세포가 로딩된 콜라겐 I 프리겔 용액을 주입함으로써 뾰족한 기도 루멘 상에 나타낸다. 또한, 생물반응기에 집적된 미세광학 이미징 장치를 이용함으로써, 상피 제거 및 내인성 세포 전달 동안 기관 내강의 시각화도 행해진다. 또한, 기관 및 새로 이식된 세포는 눈에 띄는 세포 사멸 및 조직 분해 없이 4일 동안 생물반응기에서 배양될 수 있음을 보여준다. 우리는 영상 지원 생물반응기 플랫폼, 박막 기반 탈상피화 기술, 및 본 연구에 사용된 세포 전달 방법이 시험관내 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 기도 조직 생성에 유용할 수 있다고 구상한다.
생물반응기는 프로그램가능한 시린지 펌프, 관류 펌프, 및 분리된 래트 기관을 배양하기 위한 인공호흡기에 연결된 직사각형 챔버를 포함한다. 생물반응기는 기관 또는 조직 배양 챔버에 연결된 입구 및 출구를 특징으로 하여 기관지의 내부 및 외부 공간에 시약(예를 들어, 배양 배지)을 별도로 공급합니다(그림 1). 맞춤형 이미징 시스템을 사용하여 시험 관 내에서 배양된 쥐의 내부를 세포 수준에서 시각화할 수 있습니다(그림 2). 기관지의 내인성 상피는 세제 기반 탈세포화 용액의 점적과 진동 보조 기도 세척을 통해 제거됩니다 (그림 3). 타입 I 콜라겐과 같은 하이드로겔 용액은 외인성 세포를 뾰족한 기관 루멘을 가로질러 균일하고 순간적으로 시딩하기 위한 전달 비히클로서 사용된다(도 4). 생물반응기를 구성하고 실험을 수행하는 데 사용되는 모든 물질은 물질 표에 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작업에서, 우리는 (i) 세포 제거 및 외인성 세포 전달 후 계내에서 기관 내강의 모니터링과 (ii) 세포 시딩된 기관 조직의 장기 시험관내 배양을 허용할 수 있는 이미징 유도 생물반응기를 만들었습니다. 이 맞춤형 생물반응기를 사용하여, 우리는 (i) 세제 및 진동 보조 기도 세척을 사용하여 기관 내강으로부터 내인성 상피 세포를 선택적으로 제거하고 (ii) 세포가 로딩된 콜라겐 I 프…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 흉부 학회 재단 연구 프로그램, 뉴저지 건강 재단 및 국립 과학 재단 (CAREER Award 2143620)이 J.K.에 부분적으로 지원했습니다. 그리고 국립 보건원 (P41 EB027062)에서 G.V.N.
Materials
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 – D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
Referências
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