ביוריאקטור מונחה הדמיה ליצירת רקמת נתיב אוויר מהונדסת ביולוגית
Summary
הפרוטוקול מתאר ביוריאקטור התומך בהדמיה המאפשר הסרה סלקטיבית של האפיתל האנדוגני מקנה הנשימה של החולדה והתפלגות הומוגנית של תאים אקסוגניים על פני השטח של לומן, ולאחר מכן תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של מבנה רקמת התא.
Abstract
פגיעה חוזרת ונשנית ברקמת דרכי הנשימה עלולה לפגוע בתפקוד הריאות ולגרום למחלות ריאה כרוניות, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית. ההתקדמות ברפואה רגנרטיבית ובטכנולוגיות ביוריאקטורים מציעה הזדמנויות לייצר מבני רקמות ואיברים פונקציונליים שגודלו במעבדה, שניתן להשתמש בהם כדי לסנן תרופות, למדל מחלות ולהנדס תחליפי רקמות. כאן מתוארת ביוריאקטור ממוזער בשילוב עם שיטת הדמיה המאפשרת הדמיה באתרה של הלומן הפנימי של קנה הנשימה של חולדה מוסברת במהלך מניפולציה של רקמת מבחנה ותרבית. באמצעות ביוריאקטור זה, הפרוטוקול מדגים הסרה סלקטיבית מונחית הדמיה של רכיבים תאיים אנדוגניים תוך שמירה על התכונות הביוכימיות הפנימיות ומבנה האולטרה-מבנה של מטריצת רקמת דרכי הנשימה. יתר על כן, ההעברה, ההתפלגות האחידה והתרבית הממושכת שלאחר מכן של תאים אקסוגניים על לומן דרכי הנשימה נטולי התאים עם ניטור אופטי באתרו מוצגים. התוצאות מדגישות כי ניתן להשתמש בביוריאקטור מונחה ההדמיה כדי להקל על יצירת רקמות אוויריות פונקציונליות במבחנה .
Introduction
המשטח הלומינלי של דרכי הנשימה מרופד בשכבה של אפיתל המורכבת בעיקר מתאי גזע רב-ציליתיים, קלאב, גביעובזלתיים 1,2. שכבת האפיתל משמשת כמנגנון הגנה עיקרי של הריאה, ופועלת כמחסום ביופיזי המגן על רקמת דרכי הנשימה הבסיסית מפני פתוגנים, חלקיקים או גזים כימיים בשאיפה. הוא מגן על רקמת דרכי הנשימה באמצעות מנגנונים מרובים, כולל היווצרות צמתים הדוקים בין-תאיים, פינוי רירית, והפרשת מיקרוביאלית ונוגדת חמצון 3,4. אפיתל דרכי הנשימה הפגום קשור למחלות נשימה הרסניות, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD)5, דיסקינזיה סילארית ראשונית (PCD)6, וסיסטיק פיברוזיס (CF)7.
ההתקדמות בטכנולוגיית ריאה על שבב (LOC) מייצגת הזדמנות לחקור את התפתחות הריאות האנושיות, למדל מחלות ריאה שונות ולפתח חומרים טיפוליים חדשים בסביבות במבחנה המווסתות היטב. לדוגמה, אפיתל דרכי הנשימה והאנדותל יכולים להיות תרבית בצדדים מנוגדים של קרום דק ונקבובי כדי לחקות את הגז המחליף רקמת ריאה, מה שמאפשר מודלים נאמנים של מחלות ובדיקות סמים8. באופן דומה, מודלים של מחלות חוץ גופיות נוצרו כדי למדל מחלות בדרכי הנשימה במבחנה, כגון COPD9 וסיסטיק פיברוזיס10. עם זאת, אתגר גדול של התקני LOC הוא שחזור הארכיטקטורה התלת-ממדית (התלת-ממדית) המורכבת של רקמת הריאה והאינטראקציות הדינמיות בין מטריצת תאים לרקמות במבחנה11.
לאחרונה פותחו מתודולוגיות חדשניות להנדסת רקמות המאפשרות מניפולציה של רקמות ריאה ex vivo 12. באמצעות מתודולוגיות אלה, ניתן להכין שתלי רקמות אלוגניות או קסנוגניות על ידי הסרת התאים האנדוגניים מרקמת הריאה באמצעות טיפולים כימיים, פיזיקליים ומכניים13. בנוסף, המטריצה החוץ-תאית של הרקמה המקומית שהשתמרה (ECM) בפיגומי הריאה שעברו דה-תאיזציה מספקת את הרמזים המבניים הפיזיו-מימטיים, הביוכימיים והביו-מכניים עבור תאים מושתלים כדי לחבר, להתרבות ולהבדיל14,15.
כאן מדווחת מערכת ביוריאקטור מונחית הדמיה שנוצרה על ידי שילוב של טכנולוגיות LOC והנדסת רקמות כדי לאפשר מניפולציה של רקמת חוץ גופית ותרבית של רקמות קנה הנשימה של חולדות מוסברות. באמצעות ביוריאקטור זה של רקמת דרכי הנשימה, הפרוטוקול מדגים הסרה סלקטיבית של תאי האפיתל האנדוגניים מבלי לשבש את המרכיבים התת-תאיים והביוכימיים התת-אפיתליאליים הבסיסיים של רקמת דרכי הנשימה. לאחר מכן אנו מראים את ההתפלגות ההומוגנית ואת התצהיר המיידי של התאים האקסוגניים החדשים שנזרעו, כגון תאי גזע מזנכימליים (MSCs), על לומן דרכי הנשימה הפגוע על ידי החדרת תמיסת הקולגן I הקדם-ג’לית הטעונה בתאים. בנוסף, על ידי שימוש בהתקן ההדמיה המיקרו-אופטי המשולב בביוריאקטור, נעשה גם הדמיה של לומן קנה הנשימה במהלך הסרת אפיתל והעברת תאים אנדוגניים. יתר על כן, הוא הראה כי קנה הנשימה והתאים המושתלים החדשים יכולים להיות תרבית בביוריאקטור ללא מוות תאי מורגש והתפרקות רקמות במשך 4 ימים. אנו צופים כי פלטפורמת הביוריאקטורים התומכת בהדמיה, טכניקת הדה-אפיתליזציה המבוססת על סרט דק ושיטת העברת התאים המשמשת במחקר זה יכולות להיות שימושיות ליצירת רקמות דרכי הנשימה עבור מידול מחלות במבחנה ובדיקת תרופות.
הביוריאקטור כולל תא מלבני המחובר למשאבת מזרקים הניתנת לתכנות, משאבת פרפוזיה ומכונת הנשמה לצורך קיבוץ קנה הנשימה של חולדות מבודדות. הביוריאקטור כולל פתחים ושקעים המחוברים לקנה הנשימה או לתא תרביות הרקמה כדי לספק בנפרד ריאגנטים (למשל, מדיית תרבית) למרחבים הפנימיים והחיצוניים של קנה הנשימה (איור 1). ניתן להשתמש במערכת הדמיה שנבנתה בהתאמה אישית כדי לדמיין את פנים קנה הנשימה של חולדה בתרבית חוץ גופית ברמה התאית (איור 2). האפיתל האנדוגני של קנה הנשימה מוסר באמצעות החדרת תמיסת דה-תאיזציה מבוססת דטרגנטים ולאחריה שטיפת דרכי הנשימה בסיוע רטט (איור 3). תמיסת הידרוג’ל, כגון קולגן מסוג I, משמשת ככלי אספקה לזריעה של תאים אקסוגניים באופן אחיד ומיידי על פני לומן קנה הנשימה המנוקד (איור 4). כל החומרים המשמשים לבניית הביוריאקטור ולביצוע הניסויים מסופקים בטבלת החומרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה זו יצרנו ביוריאקטור מונחה הדמיה שיכול לאפשר (1) ניטור של לומן קנה הנשימה באתרו לאחר הסרת התאים והעברת התאים האקסוגנית ו-(ii) תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של רקמת קנה הנשימה הזורע בתאים. באמצעות ביוריאקטור זה שנבנה בהתאמה אישית, הדגמנו (1) הסרה סלקטיבית של תאי האפיתל האנדוגניים מ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר של קרן האגודה האמריקאית לרפואת החזה, קרן הבריאות של ניו ג’רזי, והקרן הלאומית למדע (פרס CAREER 2143620) לג’יי קיי; והמכונים הלאומיים לבריאות (P41 EB027062) ל- G.V.N.
Materials
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 – D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
Referências
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
- Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
- Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
- De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
- Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
- Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
- Planchard, D. . Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).
- Coward, C. . A Beginner’s Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).
- Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. . 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
- O’Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
- Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
- Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
- O’Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
- Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
- Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).
