Биореактор с визуальным контролем для создания биоинженерной ткани дыхательных путей
Summary
Протокол описывает биореактор с поддержкой визуализации, который позволяет селективно удалять эндогенный эпителий из трахеи крыс и гомогенное распределение экзогенных клеток на поверхности просвета с последующим долгосрочным посевом in vitro клеточно-тканевой конструкции.
Abstract
Повторное повреждение тканей дыхательных путей может ухудшить функцию легких и вызвать хроническое заболевание легких, такое как хроническая обструктивная болезнь легких. Достижения в области регенеративной медицины и технологий биореакторов предлагают возможности для производства выращенных в лаборатории функциональных тканей и структур органов, которые могут быть использованы для скрининга лекарств, моделирования заболеваний и инженерных замен тканей. Здесь описан миниатюрный биореактор в сочетании с модальностью визуализации, которая позволяет in situ визуализировать внутренний просвет эксплантированной трахеи крысы во время манипуляций с тканями in vitro и культивирования. Используя этот биореактор, протокол демонстрирует селективное удаление эндогенных клеточных компонентов с помощью визуализации при сохранении внутренних биохимических особенностей и ультраструктуры тканевого матрикса дыхательных путей. Кроме того, показаны доставка, равномерное распределение и последующая длительная культивирование экзогенных клеток на децеллюляризированном просвете дыхательных путей с оптическим мониторингом in situ . Результаты подчеркивают, что биореактор под визуальным контролем потенциально может быть использован для облегчения генерации функциональных тканей дыхательных путей in vitro .
Introduction
Просветная поверхность дыхательных путей выстлана слоем эпителия, который в основном состоит из мультиреснитильных, клубных, бокаловидных и базальных стволовых клеток 1,2. Эпителиальный слой служит основным защитным механизмом легкого, действуя как биофизический барьер, который защищает подлежащую ткань дыхательных путей от вдыхаемых патогенов, частиц или химических газов. Он защищает ткань дыхательных путей с помощью нескольких механизмов, включая образование межклеточных плотных соединений, мукоцилиарный клиренс и антимикробную и антиоксидантную секрецию 3,4. Дефектный эпителий дыхательных путей связан с разрушительными респираторными заболеваниями, такими как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ)5, первичная цилиарная дискинезия (PCD)6 и муковисцидоз (CF)7.
Достижения в технологии «легкие на чипе» (LOC) представляют собой возможность изучать развитие легких человека, моделировать различные заболевания легких и разрабатывать новые терапевтические материалы в жестко регулируемых средах in vitro . Например, эпителий дыхательных путей и эндотелий могут быть культивированы на противоположных сторонах тонкой пористой мембраны, чтобы имитировать газообменную легочную ткань, что позволяет точно моделировать заболевание и тестировать лекарства8. Аналогичным образом, модели заболеваний in vitro были созданы для моделирования заболеваний дыхательных путей in vitro, таких как ХОБЛ9 и муковисцидоз10. Однако основной проблемой устройств LOC является повторение сложной трехмерной (3D) архитектуры легочной ткани и динамических матричных взаимодействий между клетками и тканями in vitro11.
В последнее время были разработаны инновационные методологии тканевой инженерии, которые позволяют манипулировать тканями легких ex vivo 12. Используя эти методологии, оголенные аллогенные или ксеногенные тканевые трансплантаты могут быть получены путем удаления эндогенных клеток из легочной ткани с помощью химической, физической и механическойобработки 13. Кроме того, сохраненный нативный тканевый внеклеточный матрикс (ECM) в децеллюляризованных каркасах легких обеспечивает физио-миметические структурные, биохимические и биомеханические сигналы для имплантированных клеток для прикрепления, пролиферации и дифференцировки14,15.
Здесь сообщается о системе биореакторов с визуальным контролем, созданной путем объединения технологий LOC и тканевой инженерии, чтобы позволить манипулировать тканями in vitro и культивировать эксплантированные ткани трахеи крыс. Используя этот биореактор тканей дыхательных путей, протокол демонстрирует селективное удаление эндогенных эпителиальных клеток без нарушения нижележащих субэпителиальных клеточных и биохимических компонентов ткани дыхательных путей. Далее мы показываем однородное распределение и мгновенное осаждение вновь посеянных экзогенных клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки (МСК), на оголенный просвет дыхательных путей путем закапывания клеточного раствора коллагена I. Кроме того, с помощью микрооптического устройства визуализации, интегрированного в биореактор, также выполняется визуализация просвета трахеи при удалении эпителия и доставке эндогенных клеток. Далее показано, что трахею и вновь имплантированные клетки можно культивировать в биореакторе без заметной гибели клеток и деградации тканей в течение 4 дней. Мы предполагаем, что платформа биореактора с поддержкой визуализации, метод деэпителизации на основе тонкой пленки и метод доставки клеток, используемый в этом исследовании, могут быть полезны для создания тканей дыхательных путей для моделирования заболеваний in vitro и скрининга лекарств.
Биореактор включает в себя прямоугольную камеру, соединенную с программируемым шприцевым насосом, перфузионный насос и вентилятор для культивирования изолированной трахеи крысы. Биореактор имеет входы и выходы, соединенные с трахеей или камерой культуры тканей, для отдельной подачи реагентов (например, питательных сред) во внутреннее и внешнее пространства трахеи (рисунок 1). Специально разработанная система визуализации может быть использована для визуализации внутренней части трахеи крысиной культуры in vitro на клеточном уровне (рисунок 2). Эндогенный эпителий трахеи удаляется путем закапывания раствора для децеллюляризации на основе моющего средства с последующим вибрационным промыванием дыхательных путей (рисунок 3). Раствор гидрогеля, такой как коллаген I типа, используется в качестве средства доставки для равномерного и мгновенного посева экзогенных клеток через оголенный просвет трахеи (рисунок 4). Все материалы, используемые для построения биореактора и проведения экспериментов, приведены в Таблице материалов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе мы создали биореактор с визуальным контролем, который может позволить (i) мониторинг просвета трахеи in situ после удаления клеток и доставки экзогенных клеток и (ii) долгосрочную культуру in vitro ткани трахеи, засеянной клетками. Используя этот специально разработанны?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было частично поддержано Исследовательской программой Фонда Американского торакального общества, Фондом здравоохранения Нью-Джерси и Национальным научным фондом (CAREER Award 2143620). и Национальные институты здравоохранения (P41 EB027062) – G.V.N.
Materials
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 – D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
Referências
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
- Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
- Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
- De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
- Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
- Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
- Planchard, D. . Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).
- Coward, C. . A Beginner’s Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).
- Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. . 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
- O’Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
- Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
- Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
- O’Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
- Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
- Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).
