Bioreator guiado por imagem para geração de tecido das vias aéreas bioengenharia
Summary
O protocolo descreve um bioreator habilitado para imagem que permite a remoção seletiva do epitélio endógeno da traqueia de rato e distribuição homogênea de células exógenas na superfície do lúmen, seguida pela cultura in vitro de longo prazo da construção do tecido celular.
Abstract
Lesões repetidas no tecido das vias aéreas podem prejudicar a função pulmonar e causar doenças pulmonares crônicas, como doença pulmonar obstrutiva crônica. Os avanços na medicina regenerativa e nas tecnologias bioreaatores oferecem oportunidades para produzir construções de tecidos e órgãos funcionais cultivados em laboratório que podem ser usados para triagem de drogas, doenças modelo e substituição de tecidos de engenheiros. Aqui, um bioreator miniaturizado aliado a uma modalidade de imagem que permite a visualização in situ do lúmen interno da traqueia de rato explantada durante a manipulação e cultura in vitro de tecidos. Utilizando este bioreator, o protocolo demonstra a remoção seletiva guiada por imagens de componentes celulares endógenos, preservando as características bioquímicas intrínsecas e a ultraestrutura da matriz tecidual das vias aéreas. Além disso, a entrega, distribuição uniforme e subsequente cultura prolongada de células exógenas nos lúmen descelularizados das vias aéreas com monitoramento óptico in situ são mostrados. Os resultados destacam que o bioreator guiado por imagem pode potencialmente ser usado para facilitar a geração de tecidos funcionais in vitro das vias aéreas.
Introduction
A superfície luminal do trato respiratório é forrada por uma camada de epitélio que consiste principalmente de células-tronco multi-ciliadas, club, cálice e basal 1,2. A camada epitelial serve como um mecanismo de defesa primária do pulmão, agindo como uma barreira biofísica que protege o tecido subjacente das vias aéreas contra patógenos inalados, partículas ou gases químicos. Protege o tecido das vias aéreas através de múltiplos mecanismos, incluindo formação de junção apertada intercelular, liberação mucociliaria e secreção antimicrobiana e antioxidante 3,4. O epitélio das vias aéreas defeituosas está associado a doenças respiratórias devastadoras, como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)5, diskinesia ciliar primária (PCD)6 e fibrose cística (CF)7.
Os avanços na tecnologia lung-on-chip (LOC) representam uma oportunidade para estudar o desenvolvimento pulmonar humano, modelar várias doenças pulmonares e desenvolver novos materiais terapêuticos em ambientes in vitro fortemente regulados. Por exemplo, o epitélio das vias aéreas e o endotélio podem ser cultivados em lados opostos de uma membrana fina e porosa para imitar o gás trocando tecido pulmonar, permitindo modelagem fiel de doenças e testes medicamentosos8. Da mesma forma, modelos de doenças in vitro foram criados para modelar doenças das vias aéreas in vitro, como DPOC9 e fibrose cística10. No entanto, um grande desafio dos dispositivos LOC é recapitular a complexa arquitetura tridimensional (3D) do tecido pulmonar e interações dinâmicas de matriz celular-tecido in vitro11.
Recentemente, foram desenvolvidas metodologias inovadoras de engenharia de tecidos que permitem a manipulação de tecidos pulmonares ex vivo 12. Utilizando essas metodologias, enxertos de tecido alergênico ou xenogênico desnudado podem ser preparados removendo as células endógenas do tecido pulmonar através de tratamentos químicos, físicos e mecânicos13. Além disso, a matriz extracelular de tecido nativo preservada (ECM) nos andaimes pulmonares descelularizados fornecem as pistas estruturais, bioquímicas e biomecânicas para as células implantadas anexarem, proliferarem e diferenciarem14,15.
Aqui, um sistema bioreator guiado por imagem criado pela combinação de tecnologias de engenharia de tecidos e LOC para permitir a manipulação in vitro de tecidos e cultura de tecidos traqueais de ratos explantados é relatado. Utilizando este bioreator de tecido das vias aéreas, o protocolo demonstra a remoção seletiva das células epiteliais endógenas sem interromper os componentes celulares e bioquímicos subjacentes do tecido das vias aéreas. Em seguida, mostramos a distribuição homogênea e a deposição instantânea das células exógenas recém-semeadas, como células-tronco mesenquimais (MSCs), no lúmen das vias aéreas desnudadas, instilando a solução de colágeno i pré-gel carregada por células. Além disso, utilizando o dispositivo de imagem micro-óptica integrado ao bioreator, a visualização do lúmen traqueia durante a remoção do epitélio e a entrega de células endógenas também é feita. Além disso, mostra-se que a traqueia e as células recém-implantadas podem ser cultivadas no bioreator sem morte celular perceptível e degradação tecidual por 4 dias. Prevemos que a plataforma bioreatorial habilitada para imagem, a fina técnica de desetelialização baseada em filmes e o método de entrega de células utilizado neste estudo podem ser úteis para a geração de tecidos das vias aéreas para modelagem de doenças in vitro e triagem de medicamentos.
O bioreator inclui uma câmara retangular conectada a uma bomba de seringa programável, bomba de perfusão e ventilador para cultivar traqueia de rato isolada. O bioreator apresenta entradas e tomadas conectadas à traqueia ou à câmara de cultura tecidual para fornecer separadamente reagentes (por exemplo, mídia cultural) aos espaços internos e externos da traqueia (Figura 1). Um sistema de imagem personalizado pode ser usado para visualizar o interior da traqueia de rato in vitro cultivada no nível celular (Figura 2). O epitélio endógeno da traqueia é removido através da instilação de uma solução de descelularização baseada em detergente, seguida pela lavagem das vias aéreas assistidas por vibração (Figura 3). A solução de hidrogel, como o colágeno tipo I, é usada como veículo de entrega para semear células exógenas uniformemente e instantaneamente através do lúmen traqueia desnudado (Figura 4). Todos os materiais utilizados para a construção do bioreator e a realização dos experimentos são fornecidos na Tabela de Materiais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho, criamos um bioreator guiado por imagem que pode permitir (i) o monitoramento do lúmen traqueia in situ após a remoção celular e a entrega de células exógenas e (ii) cultura in vitro de longo prazo do tecido traqueia semeado por células. Usando este bioreator personalizado, demonstramos (i) remoção seletiva das células epiteliais endógenas do lúmen traqueia usando detergente e lavagem de vias aéreas assistidas por vibração e (ii) distribuição uniforme de células exógena…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo American Toacic Society Foundation Research Program, pela New Jersey Health Foundation e pela National Science Foundation (CAREER Award 2143620) para J.K.; e os Institutos Nacionais de Saúde (P41 EB027062) para G.V.N.
Materials
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 – D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
Referências
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