Imaging-geführter Bioreaktor zur Erzeugung von biotechnologisch hergestelltem Atemwegsgewebe
Summary
Das Protokoll beschreibt einen bildgebenden Bioreaktor, der die selektive Entfernung des endogenen Epithels aus der Luftröhre der Ratten und die homogene Verteilung exogener Zellen auf der Lumenoberfläche ermöglicht, gefolgt von einer langfristigen In-vitro-Kultur des Zell-Gewebe-Konstrukts.
Abstract
Wiederholte Verletzungen des Atemwegsgewebes können die Lungenfunktion beeinträchtigen und chronische Lungenerkrankungen wie chronisch obstruktive Lungenerkrankungen verursachen. Fortschritte in der regenerativen Medizin und Bioreaktortechnologien bieten Möglichkeiten, im Labor gezüchtete funktionelle Gewebe- und Organkonstrukte herzustellen, die zum Screening von Medikamenten, zum Modellieren von Krankheiten und zum Entwickeln von Gewebeersatz verwendet werden können. Hier wird ein miniaturisierter Bioreaktor in Verbindung mit einer Bildgebungsmodalität beschrieben, die eine In-situ-Visualisierung des inneren Lumens der explantierten Rattenluftröhre während der In-vitro-Gewebemanipulation und – kultur ermöglicht. Mit diesem Bioreaktor demonstriert das Protokoll die bildgebungsgeführte selektive Entfernung endogener zellulärer Komponenten unter Beibehaltung der intrinsischen biochemischen Eigenschaften und der Ultrastruktur der Atemwegsgewebematrix. Weiterhin werden die Abgabe, gleichmäßige Verteilung und anschließende verlängerte Kultur exogener Zellen auf dem dezellularisierten Atemwegslumen mit optischer Überwachung in situ gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass der bildgebende Bioreaktor potenziell verwendet werden kann, um die Bildung von funktionellem In-vitro-Atemwegsgewebe zu erleichtern.
Introduction
Die luminale Oberfläche der Atemwege ist von einer Epithelschicht ausgekleidet, die hauptsächlich aus mehrfach beritzelten, Keulen-, Kelch- und basalen Stammzellen besteht 1,2. Die Epithelschicht dient als primärer Abwehrmechanismus der Lunge und fungiert als biophysikalische Barriere, die das darunter liegende Atemwegsgewebe vor eingeatmeten Krankheitserregern, Partikeln oder chemischen Gasen schützt. Es schützt das Atemwegsgewebe durch mehrere Mechanismen, einschließlich interzellulärer Tight-Junction-Bildung, mukoziliärer Clearance und antimikrobieller und antioxidativer Sekretion 3,4. Das defekte Atemwegsepithel ist mit verheerenden Atemwegserkrankungen wie chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD)5, primärer ziliärer Dyskinesie (PCD)6 und Mukoviszidose (CF)7 assoziiert.
Fortschritte in der Lung-on-Chip (LOC)-Technologie bieten die Möglichkeit, die Entwicklung der menschlichen Lunge zu untersuchen, verschiedene Lungenerkrankungen zu modellieren und neue therapeutische Materialien in streng regulierten In-vitro-Umgebungen zu entwickeln. Zum Beispiel können Atemwegsepithel und Endothel auf gegenüberliegenden Seiten einer dünnen, porösen Membran kultiviert werden, um das Gas nachzuahmen, das Lungengewebe austauscht, was eine originalgetreue Krankheitsmodellierung und Drogentests ermöglicht8. In ähnlicher Weise wurden In-vitro-Krankheitsmodelle erstellt, um Atemwegserkrankungen in vitro zu modellieren, wie COPD 9 und Mukoviszidose10. Eine große Herausforderung von LOC-Geräten besteht jedoch darin, die komplexe dreidimensionale (3D) Architektur des Lungengewebes und die dynamischen Zell-Gewebe-Matrix-Interaktionen in vitro11 zu rekapitulieren.
In jüngster Zeit wurden innovative Tissue-Engineering-Methoden entwickelt, die die Manipulation von Ex-vivo-Lungengewebe ermöglichen12. Mit diesen Methoden können denudierte allogene oder xenogene Gewebetransplantate hergestellt werden, indem die endogenen Zellen durch chemische, physikalische und mechanische Behandlungen aus dem Lungengewebe entferntwerden 13. Darüber hinaus liefert die konservierte extrazelluläre Matrix (ECM) des nativen Gewebes in den dezellularisierten Lungengerüsten die physio-mimetischen strukturellen, biochemischen und biomechanischen Hinweise für implantierte Zellen zum Anheften, Proliferationieren und Differenzieren14,15.
Hier wird über ein bildgebungsgesteuertes Bioreaktorsystem berichtet, das durch die Kombination von LOC- und Tissue-Engineering-Technologien geschaffen wurde, um eine In-vitro-Gewebemanipulation und -kultur von explantiertem Trachealgewebe von Ratten zu ermöglichen. Mit diesem Bioreaktor für Atemwegsgewebe zeigt das Protokoll die selektive Entfernung der endogenen Epithelzellen, ohne die darunter liegenden subepithelialen zellulären und biochemischen Komponenten des Atemwegsgewebes zu stören. Als nächstes zeigen wir die homogene Verteilung und sofortige Ablagerung der neu ausgesäten exogenen Zellen, wie mesenchymale Stammzellen (MSCs), auf dem entblößten Atemwegslumen, indem wir die zellbeladene Kollagen-I-Vorgellösung einträufeln. Darüber hinaus erfolgt durch den Einsatz des in den Bioreaktor integrierten mikrooptischen Bildgebungsgerätes auch die Visualisierung des Luftröhrenlumens während der Epithelentfernung und der körpereigenen Zellabgabe. Weiterhin wird gezeigt, dass die Luftröhre und neu implantierte Zellen im Bioreaktor ohne merklichen Zelltod und Gewebeabbau für 4 Tage kultiviert werden können. Wir stellen uns vor, dass die bildgebende Bioreaktorplattform, die dünnschichtbasierte Deepithelialisierungstechnik und die in dieser Studie verwendete Zellabgabemethode für die Erzeugung von Atemwegsgewebe für die Modellierung von In-vitro-Erkrankungen und das Screening von Medikamenten nützlich sein können.
Der Bioreaktor umfasst eine rechteckige Kammer, die mit einer programmierbaren Spritzenpumpe, einer Perfusionspumpe und einem Beatmungsgerät zur Kultivierung isolierter Rattenluftröhre verbunden ist. Der Bioreaktor verfügt über Einlässe und Auslässe, die mit der Luftröhre oder der Gewebekulturkammer verbunden sind, um Reagenzien (z. B. Kulturmedien) separat an die inneren und äußeren Räume der Luftröhre zu liefern (Abbildung 1). Ein speziell entwickeltes Bildgebungssystem kann verwendet werden, um das Innere der in vitro kultivierten Rattenluftröhre auf zellulärer Ebene sichtbar zu machen (Abbildung 2). Das endogene Epithel der Luftröhre wird durch Instillation einer dezellularisierenden Lösung auf Waschmittelbasis mit anschließender vibrationsunterstützter Atemwegswäsche entfernt (Abbildung 3). Hydrogellösung, wie Typ-I-Kollagen, wird als Abgabevehikel für die gleichmäßige und sofortige Aussaat exogener Zellen über das entblößte Luftröhrenlumen verwendet (Abbildung 4). Alle Materialien, die für den Bau des Bioreaktors und die Durchführung der Experimente verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit haben wir einen bildgebungsgeführten Bioreaktor entwickelt, der (i) die Überwachung des Luftröhrenlumens in situ nach der Zellentfernung und exogenen Zellabgabe und (ii) die langfristige In-vitro-Kultur des zellgesäten Luftröhrengewebes ermöglichen kann. Mit diesem speziell angefertigten Bioreaktor demonstrierten wir (i) die selektive Entfernung der endogenen Epithelzellen aus dem Luftröhrenlumen unter Verwendung von Waschmittel und vibrationsunterstützter Atemwegswäsche und (i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde zum Teil vom Forschungsprogramm der American Thoracic Society Foundation, der New Jersey Health Foundation und der National Science Foundation (CAREER Award 2143620) an J.K. unterstützt. und die National Institutes of Health (P41 EB027062) an G.V.N.
Materials
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 – D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
Referências
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
- Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
- Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
- De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
- Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
- Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
- Planchard, D. . Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).
- Coward, C. . A Beginner’s Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).
- Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. . 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
- O’Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
- Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
- Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
- O’Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
- Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
- Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).
