Method Article

Culturas celulares primárias para estudar o potencial de regeneração de Murine Müller Glia após tratamento de MicroRNA

DOI:

10.3791/63651

⸱

March 28th, 2022

 , 
1Department of Biological and Vision Sciences, College of Optometry, The State University of New York

In This Article

Summary

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As culturas primárias de Müller glia obtidas a partir de retinas de camundongos representam uma ferramenta muito robusta e confiável para estudar a conversão gliaial em células progenitoras de retina após o tratamento de microRNA. Moléculas ou combinações únicas podem ser testadas antes de sua subsequente aplicação de abordagens in vivo .

Abstract

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Müller glia (MG) é a glia predominante na retina neural e pode funcionar como fonte regenerativa para neurônios da retina. Em vertebrados inferiores, como peixes, a regeneração orientada por MG ocorre naturalmente; em mamíferos, no entanto, é necessária estimulação com certos fatores ou manipulação genética/epigenética. Como a MG compreende apenas 5% da população de células da retina, há necessidade de sistemas de modelo que permitam o estudo dessa população celular exclusivamente. Um desses sistemas de modelo são culturas primárias de MG que são reprodutíveis e podem ser usadas para uma variedade de aplicações, incluindo triagem e identificação de moléculas/fatores, testes de compostos ou fatores, monitoramento celular e/ou testes funcionais. Este modelo é usado para estudar o potencial de mamão murina para converter em neurônios de retina após suplementação ou inibição de microRNAs (miRNAs) via transfecção de miRNAs artificiais ou seus inibidores. O uso de camundongos repórteres específicos de MG em combinação com rotulagem imunofluorescente e sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) confirmou que 80%-90% das células encontradas nessas culturas são MG. Usando este modelo, descobriu-se que miRNAs podem reprogramar MG em células progenitoras de retina (RPCs), que posteriormente se diferenciam em células neuronais. As vantagens dessa técnica são que os candidatos do miRNA podem ser testados para sua eficiência e resultado antes de seu uso em aplicações in vivo .

Introduction

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A glia Müller (MG) é a glia predominante na retina neural. Eles têm funções semelhantes em comparação com outras glia em outras partes do sistema nervoso central, como manter a água e a homeostase de íon, nutrir neurônios e proteger o tecido. Mg tem outra característica fascinante: embora sejam glia maduras, elas ainda expressam muitos genes expressos em células progenitoras de retina (RPCs) durante o desenvolvimento tardio 1,2. Essa semelhança é considerada a razão para a regeneração neuronal baseada em MG na retina do peixe após danos na retina 3,4. ....

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Protocol

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Os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade suny de Optometria.

NOTA: Este protocolo de cultura consiste em três fases: crescimento, transfecção e fase de conversão. Um resumo do protocolo geral com o cronograma é dado na Figura 1.

1. Preparação de mídia e todos os reagentes necessários

NOTA: Todas as etapas precisam ser realizadas em um gabinete de biossegurança A2 ou B2 (BSC). Durante a fase de crescimento, é utilizado um meio de crescimento de alt....

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Results

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Este protocolo descreve como cultivar MG a partir de retinas de camundongos P12 e como reprogramar essas células com miR-25 em neurônios de retina usando o rato repórter Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Este método foi utilizado em trabalhos anteriores relatando em detalhes outros miRNAs adequados (imitadores ou inibidores, como moléculas únicas ou em combinação) para reprogramar MG em RPC que, em seguida, adotam características celulares neuronais27. Este método f.......

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Discussion

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Este protocolo descreve como cultivar MG a partir de retinas de camundongos dissociados para estudos de reprogramação usando miRNAs. Como mostrado e confirmado em uma variedade de estudos anteriores, a grande maioria (80%-90%) das células encontradas nessas culturas são MG 20,23,24. Este método é uma técnica muito robusta e confiável e os resultados podem ser facilmente reproduzidos se o protocolo for seguido corretamente

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Disclosures

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Uma patente, incluindo algumas das conclusões deste relatório, foi arquivada pela Universidade de Washington com os inventores Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl e Thomas A. Reh. A patente é intitulada ''Métodos e composições para estimular a regeneração da retina.

Acknowledgements

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Os autores agradecem a Dra. Agradecimentos especiais aos Drs. Tom Reh, Julia Pollak e Russ Taylor por introduzirem culturas primárias de MG como uma ferramenta de triagem para a S.G.W. durante o treinamento de pós-doutorado na Universidade de Washington, em Seattle. O estudo foi financiado pelo Empire Innovation Program (EIP) Grant to S.G.W. e fundos in start-up da SUNY Optometria para a S.G.W., bem como o prêmio R01EY032532 do National Eye Institute (NEI) para s.G.W.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Ascl1-CreERT ratinho Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratories#012882Ascl1-CreERT camundongos foram cruzados com camundongos tdTomato
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JJax laboratories#007914A genotipagem é necessária para identificar camundongos positivos para Ascl1CreER
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifeno, ≥ Isómero Z a 98%Sigma-AldrichH7904-5MGreconstituído em etanol, alíquotas congeladas
16% Solução aquosa de paraformaldeído (PFA)VWR100504-7822% PFA feito com solução salina tamponada com fosfato (PBS), alíquotas congeladas
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragmento Burro Anti-Coelho IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152diluição 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragmento de burro Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147diluição 1:500
Anticorpo anti-humano Otx2, R& D SystemsFisher ScientificAF1979diluição 1:500
Anti-coelho MAP2 anticorpoSigma-AldrichM9942-200ULdiluição 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) anticorpoAnticorpos-OnlineABIN334653diluição 1:500
Ácido AscórbicoSTEMCELL Technologies72132reconstituído em PBS, alíquotas congeladas
B-27 SuplementoFisher Scientific17-504-044alíquotas congeladas
Brain Phys Neuronal MediumSTEMCELL Technologies05790usado como meio neuronal na seção 1.2, armazenar a 4 ° C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitFisher ScientificC10340reconstituir o seguinte manual, 4° C
Dibutiril-cAMPSTEMCELL Technologies73886reconstituído em Dimetil sulfóxido (DMSO), alíquotas congeladas
Dimetil Sulfóxido (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificMT35010CValíquotas congeladas
Gibco  Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement FisherScientific51-985-034loja em 4 ° C
Gibco  Enzima TrypLE Express (1X), vermelho de fenolFisher Scientific12-605-028usado como solução contendo tripsina, armazenar a 4 &graus; C
HBSSFisher Scientific14-025-134loja em 4 ° C
Proteína de camundongo laminina, naturalFisher Scientific23-017-015

alíquotas congeladas, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutaminaFisher Scientific25-030-081alíquotas congeladas
miRIDIAN microRNA Mimic Negative ControlHorizonCN-001000-01-50reconstituídas em água livre de RNase (200 µ M), alíquotas congeladas
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p imitamHorizonC-310564-05-0050reconstituído em água livre de RNase (200 µ M), alíquotas congeladas
N-2 SuplementoFisher Scientific17-502-048alíquotas congeladas
Meio neurobasalFisher Scientific21-103-049usado para meio de crescimento na seção 1.1, armazenar a 4 ° C
Sistema de Dissociação de PapaínaWorthingtonBiochemical LK003153reconstituído em Solução Salina Balanceada de Earle, alíquotas congeladas
Penicilina EstreptomicinaFisher Scientific15-140-122alíquotas congeladas
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Fisher Scientific20-012-043
Bromidrato de poli-L-ornitinaSigma-AldrichP4538-50MGreconstituído em água esterilizada, alíquotas congeladas
Proteína BDNF humana recombinanteR & D Systems248-BDB-050/CFreconstituído em PBS e FBS esterilizados, alíquotas congeladas
Recombinante Mouse EGF ProteinFisher Scientific2028EG200reconstituído em PBS esterilizado, alíquotas congeladas
Rato Recombinante GDNF Protein FisherScientific512GF010reconstituído em PBS esterilizado, alíquotas
congeladasVermelho de Rodamina 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragmento de Burro Anti-Rato IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories712-296-150diluição 1:1,000
Meio de Montagem de LâminasReagenteFisher Scientific OB100-01
(Lipofectamine 3000)Fisher ScientificL3000015loja a 4 ° C
plasticware/supplies
0.6 mL tubo de microcentrífugaFisher Scientific50-408-120
1.5 mL tubo de microcentrífugaFisher Scientific50-408-129
10 µ DICA EM L Filtro estéril  Ponteiras de PipetaFisher Scientific02-707-439
100 µ DICA EM L filtro estéril Pontas de PipetaFisher Scientific02-707-431
1000 µ Filtro estéril L TIP Pontas de pipetaFisher Scientific02-707-404
Tubo de microcentrífuga de 2,0 mLFisher Scientific50-408-138
20 µ DICA EM L Pontas de pipeta com filtro estérilFisher Scientific02-707-432
Pipetas de volume ajustável (2.5, 10, 20, 100, 200 e 1000 & micro; L)Eppendorf2231300008
Pipetas de Transferência DescartáveisFisher Scientific13-669-12
Placas Multipoços de Fundo Plano com Tampas, Nº de Poços=12Fisher Scientific08-772-29
Placas Multipoços de Fundo Plano com Tampas, Nº de Poços=24Fisher Scientific08-772-1
PIPET  filtro estéril 10ML Sorológico Descartável PipetasFisher Scientific13-676-10J
PIPET  filtro estéril 50ML Pipetas sorológicas descartáveisFisher Scientific13-676-10Q
PIPET  filtro estéril 5ML Pipetas sorológicas descartáveisFisher Scientific13-676-10H
Luvas de Exame de Nitrilo Sem PóFisher Scientific19-130-1597B
Lamínulas redondas (12 mm de diâmetro, 0.17 - 0.25 mm de espessura)de Vácuo 22293232Fisher
Scientific, Tamanho dos Poros=0.22 µ mFisher Scientific09-761-106
equipment
1300 B2 Gabinete de biossegurançaThermo Scientific1310
Microscópio de fluorescência tudo-em-um Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
Microscópio estéreo binocular ZoomVision ScientificVS-1EZ-IFR07
Placas de Petri descartáveis (100 mm de diâmetro)VWR25384-088
Pinça Dumont #5 - Biologie/TitaniumFine Science Tools11252-40
Dumont #55 Pinça - Biologie/InoxFine Science Tools11255-20
Dumont #7 curvada Pinça - Biologie/TitaniumFine Science Tools11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 REppendorf
Tesoura Fina-afiadaFerramentas de Ciência Fina14058-11
Tesoura McPherson-Vannas, 8 cmWorld Precision Instruments14124
Banheira de contas de metalLab Armor74309-714
Misturador de Nutação, Elétrico=115V, 60Hz, Velocidade=24 rpmVWR82007-202
Placa de Petri de dissecação revestida de silicone (90 mm diâmetro)Pinças de Instrumentação de Sistemas VivosDD-ECON-90-BLK-5PK
, economia #5World Precision Instruments501979
Incubadora de CO2 com camisa de águaVWR10810-744
de Transfecção Filtro 2231000508

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcript....

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Tags

Muller GliaPrimary Cell CultureMicroRNA TreatmentRetinal Progenitor CellsRetinal RegenerationImmunofluorescent LabelingSingle Cell RNA SequencingNeuronal DifferentiationCell TransfectionRegenerative Medicine

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