Summary
Müller glia primære kulturer opnået fra musens nethinder repræsenterer et meget robust og pålideligt værktøj til at studere gliakonverteringen til retinale stamceller efter mikroRNA-behandling. Enkeltmolekyler eller kombinationer kan testes før deres efterfølgende anvendelse af in vivo-tilgange .
Abstract
Müller glia (MG) er den dominerende glia i neurale nethinden og kan fungere som en regenerativ kilde til retinale neuroner. I lavere hvirveldyr som fisk forekommer MG-drevet regenerering naturligt; hos pattedyr er stimulering med visse faktorer eller genetisk/epigenetisk manipulation imidlertid påkrævet. Da MG kun udgør 5% af retinal cellepopulationen, er der behov for modelsystemer, der udelukkende tillader undersøgelse af denne cellepopulation. Et af disse modelsystemer er primære MG-kulturer, der er reproducerbare og kan bruges til en række forskellige applikationer, herunder molekyle / faktor screening og identifikation, test af forbindelser eller faktorer, celleovervågning og / eller funktionelle tests. Denne model bruges til at studere potentialet af murine MG til at konvertere til retinale neuroner efter tilskud eller hæmning af microRNA'er (miRNA'er) via transfektion af kunstige miRNA'er eller deres hæmmere. Brugen af MG-specifikke reportermus i kombination med immunofluorescerende mærkning og enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq) bekræftede, at 80% -90% af cellerne, der findes i disse kulturer, er MG. Ved hjælp af denne model blev det opdaget, at miRNA'er kan omprogrammere MG til retinale stamceller (RPC'er), som efterfølgende differentierer sig til neuronallignende celler. Fordelene ved denne teknik er, at miRNA-kandidater kan testes for deres effektivitet og resultat, før de anvendes i in vivo-applikationer .
Introduction
Müller glia (MG) er den dominerende glia i neurale nethinden. De har lignende funktioner sammenlignet med andre glia i andre dele af centralnervesystemet, såsom at opretholde vand og ionhomeostase, nærende neuroner og beskytte vævet. MG har en anden fascinerende funktion: selvom de er modne glia, udtrykker de stadig mange gener udtrykt i retinale stamceller (RPC'er) under sen udvikling 1,2. Denne lighed antages at være årsagen til den naturligt forekommende MG-baserede neuronale regenerering i fiskehinden efter retinal skade 3,4. Under denne proces går MG ind i cellecyklussen igen og dedifferentierer i RPC'er, der derefter differentieres til alle seks typer retinale neuroner. Selvom dette fænomen forekommer naturligt i fisk, omdannes pattedyr MG ikke til neuroner 5,6. De kan dog omprogrammeres. En række faktorer har vist sig at omprogrammere MG til RPC'er / neuroner; blandt disse faktorer er den grundlæggende helix-loop-helix (bHLH) transkriptionsfaktor achaete-scute homolog 1 (Ascl1), der er involveret i fiskeregenerering 7,8. Hos mus udtrykkes Ascl1 kun i RPC'er under retinogenese, men er fraværende i modne MG- eller retinale neuroner9.
Omprogrammering af celler direkte in vivo er ikke kun metodisk udfordrende, men kræver også godkendelse fra et institutionelt dyrepleje- og brugsudvalg. For at opnå godkendelse kræves foreløbige data om den eller de anvendte eller ændrede faktorer, koncentrationer, virkninger uden for målet, underliggende mekanismer, toksicitet og effektivitet. Cellekultursystemer tillader test af disse kriterier før brug i in vivo-modeller. Da MG desuden kun udgør ca. 5% af hele retinal cellepopulation10, tillader MG-kulturer undersøgelse af deres funktion11 såvel som deres adfærd, herunder migration12,13, proliferation14, stressreaktion på skade / skade15,16, deres interaktion med andre celletyper såsom microglia17 eller retinale ganglionceller (RRGC'er)18, eller deres neurogene potentiale 19,20,21. Mange forskere bruger udødeliggjorte cellelinjer til deres studier, da de har et ubegrænset proliferativt potentiale og let kan vedligeholdes og transficeret. Primære celler foretrækkes imidlertid til biologisk relevante assays end udødeliggjorte celler, da de har sande celleegenskaber (gen- og proteinekspression), og endnu vigtigere repræsenterer de et bestemt udviklingsstadium og har derfor en "alder". Et dyrs alder (og følgelig af de celler, der er opnået fra et dyr) er en særlig afgørende faktor i cellulær omprogrammering, da celle plasticitet reduceres med fremskreden udviklingsstadium22.
Denne protokol beskriver detaljeret, hvordan man omprogrammerer primær MG med miRNA'er som en aktuel in vitro-metode til undersøgelse af regenerering. Denne MG primære kulturmodel blev etableret i 2012 for at evaluere celleproliferationsegenskaber for MG i P53 knock-out mus (trp53-/- mus)23. Det blev vist, at dyrket MG opretholder deres gliaegenskaber (dvs. ekspression af S100β-, Pax6- og Sox2-proteiner evalueret via immunofluorescerende mærkning), og at de ligner in vivo MG (mikroarray af FACS-renset MG)23. Kort tid derefter blev gliamRNA og proteinekspression valideret og bekræftet i en anden tilgang ved hjælp af virale vektorer20. Et par år senere blev det bekræftet, at langt de fleste celler, der findes i disse kulturer, er MG ved hjælp af mg-specifikke Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl reporter mus24. Desuden viste kvantificeringen af sættet af miRNA'er i både FACS-renset MG og dyrket primær MG, at niveauerne af MG miRNA'er (mGLiomiRs) ikke varierer meget i dyrket MG i vækstfasen. Langstrakte dyrkningsperioder forårsager imidlertid ændringer i miRNA-niveauer og følgelig i mRNA-niveauer og proteinekspression, da miRNA'er er translationelle regulatorer25.
I 2013 blev denne MG-kulturmodel brugt til at teste en række transkriptionsfaktorer med hensyn til deres evne til at omprogrammere MG til retinale neuroner20. Ascl1 viste sig at være en meget robust og pålidelig omprogrammeringsfaktor. Overekspression af Ascl1 via virale vektorer inducerede morfologiske ændringer, ekspression af neuronale markører og erhvervelse af neuronale elektrofysiologiske egenskaber. Endnu vigtigere er det, at den indsigt og de resultater, der blev opnået fra disse første in vitro-forsøg, med succes blev overført til in vivo-applikationer 22,26, hvilket viser, at primære MG-kulturer repræsenterer et solidt og pålideligt værktøj til indledende faktorscreeninger og evaluering af gliale træk inden in vivo-implementering.
For et par år siden blev det vist, at det hjerneberigede miRNA miR-124, som også er stærkt udtrykt i retinale neuroner, kan inducere Ascl1-ekspression i dyrket MG21. Ascl1-ekspression i levende celler blev visualiseret via en Ascl1-reportermus (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl). En reportermus er en gensplejset mus, der har et reportergen indsat i sit DNA. Dette reportergen koder for et reporterprotein, som i dette studie er tdTomato, et rødt fluorescerende protein. Denne reporter protein rapporterer ekspressionen af et gen af interesse, i dette tilfælde Ascl1. Med andre ord bliver celler, der udtrykker Ascl1 , røde. Da Ascl1 kun udtrykkes i RPC'er9, tillader denne Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-mus sporing af MG-konvertering til Ascl1 , der udtrykker RPC'er, hvilket betyder, at konverterende celler vil udtrykke rødt fluorescerende tdTomato reporterprotein. Dette er irreversibel mærkning, da DNA'et i disse celler ændres. Følgelig vil enhver efterfølgende neuronal differentiering blive visualiseret, fordi tdTomato-etiketten forbliver i differentierende celler. Hvis Ascl1 , der udtrykker MG-afledte RPC'er (med tdTomato-etiket), differentieres til neuroner, vil disse neuroner stadig have deres røde etiket. Denne mus tillader derfor ikke kun mærkning af MG-afledte RPC'er til levende cellebilleddannelse, men tillader også skæbnekortlægning og afstamning af disse MG-afledte (røde) RPC'er. For nylig blev sættet af miRNA'er i RPC'er identificeret, og MG-kulturer af Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermus blev brugt til at screene og teste effekten af disse miRNA'er på omprogrammeringskapacitet og effektivitet27. En kandidat, RPC-miRNA miR-25, blev fundet i stand til at omprogrammere dyrket MG til Ascl1-ekspressive (Ascl1-Tomato+) celler. Disse omprogrammerede celler vedtager neuronale træk over tid, herunder neuronal morfologi (små somata og enten korte eller lange fine processer), ekspression af neuronale transkripter målt via scRNA-Seq samt ekspression af neuronale proteiner valideret via immunofluorescerende mærkning27.
Her beskriver protokollen, hvordan man dyrker og transfekterer MG fra P12-mus tilpasset fra det tidligere arbejde 21,24,27. Valgt til denne protokol er den førnævnte miRNA miR-25, et miRNA stærkt udtrykt i RPC'er, med lave ekspressionsniveauer i MG eller retinale neuroner. For at overudtrykke miR-25 efterligner murine miR-25, dvs. kunstige miRNA-molekyler. Som kontrol vælges efterligninger af et miRNA fra Caenorhabditis elegans, der ikke har nogen funktion i pattedyrceller. Visualisering af konverteringen af MG til RPC'er blev udført via RPC-reportermusen (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl), en mus med blandet baggrund (C57BL / 6, S129 og ICR-stammer). Denne dyrkning kan dog udføres med alle musestammer, herunder vildstammer. I de sidste par år er den oprindelige protokol blevet ændret for at reducere vækstfasevarigheden og den samlede kulturperiode og sikre en mere robust gliacellestatus og minimere graden af cellulær degeneration, som forekommer i længere dyrkningsperioder. Det almindelige transfektionstidsvindue blev også forlænget fra 3 timer til 2 dage. Som tidligere nævnt, selvom den nuværende protokol beskriver MG-kulturer som et værktøj til regenereringsundersøgelser, er metoden ikke kun nyttig til test af omprogrammeringsfaktorer, men kan også tilpasses til andre applikationer, herunder undersøgelser om MG-migrerende eller proliferativ adfærd, skade / celleskaderelaterede paradigmer og / eller identifikation af underliggende mekanismer og veje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer, der involverer forsøgspersoner, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved SUNY College of Optometry.
BEMÆRK: Denne kulturprotokol består af tre faser: vækst, transfektion og konverteringsfase. Et resumé af den samlede protokol med tidslinjen er angivet i figur 1.
1. Fremstilling af medier og alle nødvendige reagenser
BEMÆRK: Alle trin skal udføres i et A2- eller B2-biosikkerhedsskab (BSC). I vækstfasen anvendes et vækstmedium med højt serum, som består af et basalt neuronalt medium suppleret med epidermal vækstfaktor (EGF). Til konverteringsfasen anvendes et neurofysiologisk basalmedium med lavt serum suppleret med neuronale kosttilskud for at sikre neuronal differentiering og overlevelse.
- Forbered vækstmedium (anvendes i vækstfasen) ved at supplere 200 ml basalneuronalt medium med 20 ml føtalt bovint serum (FBS, 10%), 1 ml 200 ml L-glutamin (0,5%), 2 ml penicillin / streptomycin (1%) og 2 ml N2-supplement (1%). Udfør steril filtrering (filterenheder med 0,22 μm porestørrelse). Forvarm mediet i 37 °C metalperlebad før brug.
- Forbered neuronalt medium (anvendt i konverteringsfasen) efter producentens anvisninger (se materialetabel) ved at supplere 100 ml serumfrit neurofysiologisk basalmedium med 2 ml B27 neuronalt supplement (2%), 1 ml N2-supplement (1%), 20 μL 100 ng / ml hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF, rekonstitueret i 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i phosphatbufferet saltvand (PBS, endelig koncentration 20 ng/ml), 20 μL 100 ng/ml gliacelleafledt neurotrofisk faktor (GDNF, rekonstitueret i steril Hanks' Balanced Salt Solution [HBSS], slutkoncentration 20 ng/ml), 500 μL 100 mg/ml Dibutyryl-cAMP (rekonstitueret i DMSO), 70 μL 50 ng/ml ascorbinsyre (rekonstitueret i steril PBS) og 1,5 ml penicillin/streptomycin. Udfør steril filtrering (filterenheder med 0,22 μm porestørrelse). Forvarmt medium i 37 °C metalperlebad før brug.
BEMÆRK: Disse medier kan opbevares ved 4 °C i 1 måned. - Rekonstituere Papain-, DNase I- og Ovomucoidreagenser, der kræves til retinal dissociation efter producentens protokol. Aliquot 750 μL Papain i sterile 1,5 ml rør, 75 μL DNase I i sterile 0,6 ml rør og 750 μL ovomucoid proteasehæmmer i 2 ml rør. Papain- og DNase I-alikvoter ved -20 °C nedfryses, og Ovomucoid-alikvoter opbevares ved 4 °C for at undgå nedbrydning af reagenserne. Optø ved stuetemperatur lige før brug.
BEMÆRK: Papain, DNase I og Ovomucoid findes i et sæt kaldet Papain Dissociation System (se Materialetabel). - Rekonstituere poly-L-ornithin (Poly-O) og Laminin til dækslipbelægning, hvis immunofluorescerende mærkning udføres i henhold til databladsinstruktionerne (Poly-O: 0,1 mg / ml i sterilt vand; Laminin: fortynd 1,2 mg/ml ved 1:50 i DMEM). Aliquot Poly-O og Laminin (2,5 ml) og fryse aliquoter ved -20 °C. Optø ved stuetemperatur lige før brug.
BEMÆRK: Trin 1.4. er kun påkrævet, hvis immunofluorescerende mærkning og laserscanningsmikroskopi udføres.
2. Mus og vævsekstraktion
BEMÆRK: Til disse omprogrammeringsundersøgelser blev Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-musen oprettet ved at krydse en Ascl1CreERT-mus (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) med en tdTomatoSTOPfl / fl-mus (B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J: Jax # 007914). Denne mus har en blandet baggrund (C57BL/6, S129 og ICR stamme). Genotypen af denne mus er vist i figur 1A. Alle stammer kan bruges til denne protokol.
- Brug handsker og desinficering af arbejdsområdet, herunder dissektionsmikroskop og alt fint værktøj (Dumont # 5 fint og Dumont # 7 buede tang, fin saks og Vannas saks) med 70% ethanol. Desinficer en 10 cm silikonebelagt sort dissektionsskål ved at udsætte den for UV-lys i 20 min.
- Tilberedning af tallerkener og tallerkener til vævsekstraktion
- Forbered en 24-brønds plade til øjenopsamling og prøveseparation (to øjne pr. mus i en brønd, mærket med muse-id'er) med ~ 1 ml kold HBSS (4 ° C) pr. Brønd. Læg pladen med 24 brønde på is.
- Fyld en steril 10 cm petriskål (til vask) og den desinficerede silikonebelagte dissektionsskål med flere ml kold HBSS (4 °C) for at sikre, at vævet er fuldt dækket med HBSS.
- Forbered et sterilt 1,5 ml rør med 1 ml 70% ethanol.
- Forbered en 12 brøndkulturplade ved at mærke pladen med kulturnummer, dato, stamme og alle de nødvendige oplysninger.
- Afliv P12-mus ved hjælp af en hvilken som helst godkendt metode.
- Fjernelse af øjne
- Hold forsigtigt musehovedet med tommelfingeren og pegefingeren rundt om øjet.
- Brug Dumont #7 buede tang, gå forsigtigt bag øjeæblet og klip synsnerven. Tag forsigtigt øjet ud.
BEMÆRK: Hvis der anvendes voksne mus, må du ikke bruge buede tang og ikke trække øjet. Skær i stedet forsigtigt rundt om øjenkloden ved hjælp af fine sakse; skære synsnerven, men ikke skære øjet selv. Brug pincet til forsigtigt at fjerne øjeæblet.
- Rengøring af øjeæble
- Dyp øjeæblet kort i et ethanolholdigt rør for at undgå overførsel af bakterier fra dyret.
- Vask øjeæblet kort i 10 cm petriskålen, inden du lægger det i 24 brøndpladen på is.
- Trin 2.4 og 2.5 gentages for de andre øjne. Hold brøndpladen på isen under processen. Placer to øjne fra et dyr i dissektionsskålen placeret under et dissektionsmikroskop med en lyskilde.
- Retina ekstraktion
- Fix det ene øjeæble ved at gribe fat i synsnerven og det omgivende bindevæv omkring scleraen med Dumont #5 fine pincet og tryk den forsigtigt mod dissektionsskålen (hornhinden opad).
- Lav et hul i midten af hornhinden ved hjælp af en 30 G nål for at give lettere adgang til Vannas saks.
- Disseker hornhinden omkring ciliarylegemet ved hjælp af Vannas saks og fjern hornhinde, linse, iris og glaslegeme omhyggeligt med Dumont # 5 fine tang. Figur 2A illustrerer en øjenkop med nethinden indeni.
- Disseker sclera med Vannas saks, indtil synsnerven er nået. Klip synsnerven og træk forsigtigt nethinden ud ved hjælp af Dumont #5 fine pincet.
- Brug et andet par Dumont # 5 fine tang til at skubbe mod nethinden og tillade fuldstændig fjernelse af glaslegemet. Figur 2B illustrerer to ekstraherede nethinder.
- Overførsel og vask
- Skær ca. 2,5 cm af spidsen af en steril overførselspipette for at forstørre diameteren. Brug dette tip til at samle (suge ind) hele nethinder uden at beskadige vævet.
- Overfør nethinden til en ny steril petriskål med kold HBSS (4 °C) og vip fadet (frem og tilbage, venstre og højre).
- Brug overførselspipettespidsen til forsigtigt at skubbe nethinden rundt for at vaske retinale pigmentepitelceller (RPE) af.
BEMÆRK: Alternativt kan hele nethinden med linse og glaslegeme fjernes fra øjenkoppen. Derefter kan linsen og glaslegemet fjernes fra den ekstraherede nethinde. Hvis nethinden er revet, skal du sørge for at samle alle stykker til dissociation; ellers vil der ikke være tilstrækkelige mængder væv til at vokse sammenflydende cellelag.
- Placer straks den isolerede nethinde i en ny, ren brønd af 24-brøndpladen fyldt med 1 ml HBSS. Hold pladen med 24 brønde på isen under dissektionsprocessen.
- Gentag trin 2.7-2.9 for at isolere den anden nethinde.
3. Nethinden dissociation
BEMÆRK: Alle følgende trin (indtil cellehøstning) skal udføres i et A2- eller B2-biosikkerhedsskab (BSC).
- Papain/DNase I dissociationsblandingen forberedes som følger.
- For seks nethinder tilsættes 75 μL DNase I i røret indeholdende 750 μL Papain (fra trin 1.3) og blandes omhyggeligt (dissociationsblanding).
- For individuel prøveforberedelse, der kræves til denne protokol, opdeles det samlede volumen på 825 μL i tre alikvoter: 275 μL af blandingen i et 1,5 ml rør pr. Mus (to nethinder). Beregn de krævede mængder af DNase I og Papain i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: Op til seks nethinder kan dissocieres i et rør af Papain / DNase I-blanding. Individuel prøveforberedelse resulterer imidlertid i færre klumper og bedre cellevækst end i kombinerede prøver.
- Overfør to nethinder til Papain/DNase I dissociationsblanding. Der anvendes en overføringspipette med forstørret spidsdiameter (trin 2.8.1), nethinden tages op, venter, indtil nethinden sætter sig nederst på spidsen, og nethinden uden for meget HBSS slippes ud i røret, der indeholder Papain/DNase I-blandingen.
- Anbring på en møtrik og inkuber den i 10 minutter i en cellekulturinkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Dissocier cellerne ved forsigtigt at pipettere op og ned (ca. 20-30 gange) med en 1 ml pipette. Efter at celler er dissocieret (dvs. hvilket resulterer i en homogen opløsning uden bidder), tilsættes 275 μL Ovomucoid proteasehæmmer fra Papain Dissociation Kit for at neutralisere Papain. Bland forsigtigt ved at pipettere op og ned.
BEMÆRK: Hvis seks nethinder blev dissocieret i 825 μL Papain / DNase I-blanding, kræves 825 μL Ovomucoid. - Blandingen centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Epidermal vækstfaktor (EGF, 1 μL pr. 1 ml vækstmedium, rekonstitueret ved 200 μg/ml i PBS) tilsættes til den beregnede mængde vækstmedium (1 ml pr. mus), der er forvarmet ved 37 °C.
BEMÆRK: Afhængigt af det eksperimentelle design kan proliferationsmarkøren 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) samt 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) eller andre krævede faktorer tilsættes i begyndelsen af kulturperioden. - Fjern rørene forsigtigt fra centrifugen. Rør ikke ved pelleten i bunden af røret.
- Fjern supernatanten forsigtigt og helt. Cellepilletpenteres med 500 μL EGF-suppleret vækstmedium.
- Overfør cellesuspensionen til en brønd i den mærkede 12-brøndplade (figur 2C). Skyl røret med yderligere 500 μL EGF-suppleret vækstmedium, og tilsæt det til brønden (samlet volumen på 1 ml pr. Brønd).
- Trin 3.8 og 3.9 gentages sammen med alle andre prøver.
- Vip brøndpladen tre gange forsigtigt (frem og tilbage; venstre og højre). Pladen anbringes i inkubatoren (37 °C, CO2).
BEMÆRK: Hvis der anvendes transgene mus, skal du udføre genotypning for hvert dyr (figur 2D). Identificer Cre rekombinase positive og negative mus og mærk pladen i overensstemmelse hermed. Til denne protokol blev kun celler af Cre-rekombinasepositive reportermus brugt til de næste trin. Celler af Cre negative prøver fryses og anvendes til andre anvendelser.
4. Vækstfase
BEMÆRK: Vækstfasen har en varighed på ca. 4-5 dage (figur 1B). For at tilføje væsker til brønde, der indeholder celler, skal pipetten pege på brøndens væg, og væsken skal frigives langsomt for at undgå celleafmontering. Pipetter ikke direkte oven på cellerne.
- En dag efter dissociation fjernes mediet og tilsættes 1 ml frisk EGF-suppleret vækstmedium.
- På dag 3 skal du fjerne mediet og tilføje 1 ml HBSS (stuetemperatur) for at fjerne celleaffald. Rock forsigtigt frem og tilbage fra venstre mod højre. Fjern HBSS, gentag vasketrinnet, og tilsæt 1 ml forvarmet EGF-suppleret vækstmedium.
- Overvåg cellerne hver dag og evaluer deres vækststatus, indtil cellerne når 90% -100% sammenløb. Figur 3 viser et eksempel på god MG-vækst over tid. Kontroller for mulig forurening eller celledød (supplerende figur 1). Kassér forurenede kulturer.
BEMÆRK: For at overvåge og optage celletilstand skal du tage billeder ved forskellige forstørrelser ved hjælp af et lysmikroskop med et vedhæftet kamera og 4x, 10x eller 20x mål. I denne undersøgelse anvendes et fluorescensmikroskop.
5. Fremstilling af dækslips med poly-L-ornithin (Poly-O) og Laminin pels
BEMÆRK: Dette trin er kun nødvendigt, hvis immunofluorescerende mærkning og konfokal laserscanningsmikroskopi udføres. Runde glasdæksler (12 mm diameter) er nødvendige for korrekt billeddannelse. Belægningsprotokollen kan også findes i databladet neuronalt medium (se Materialetabel).
- Placer sterile dæksler forsigtigt i midten af hver brønd på en 24-brønds plade ved hjælp af sterile Dumont #2AP pincet.
BEMÆRK: Placer dæksler i midten af brønden. Placering af dækslips tæt på væggen i en brønd vil medføre overfladespændingsproblemer for de følgende trin. - Optø en 2,5 ml Poly-O aliquot ved stuetemperatur og placer 100 μL af den i midten af hver dækslip.
- Inkuber brøndpladen i 30 minutter i en 37 °C inkubator.
- Fjern Poly-O og vask brønden med dækslen tre gange med ~ 1 ml sterilt vand.
- Lad brøndpladen tørre natten over i BSC. Tø 2,5 ml Laminin ved 4 °C natten over.
- Næste morgen tilsættes 100 μL Laminin i midten af hver dækslip og inkuberes i 4 timer i en 37 °C inkubator.
- Fjern Laminin forsigtigt og helt.
- Pladen anbringes ved 4 °C, hvis der ikke umiddelbart kan foretages en passaging.
BEMÆRK: De coatede dæksler i forberedte plader kan opbevares i et par dage ved 4 °C.
6. Cellepassage for at fjerne neuronale overlevende
BEMÆRK: Cellepassage er nødvendig for at fjerne neuronale celler, ikke for at øge cellepopulationen. Glia deler sig kun et par gange og vil ikke vokse yderligere efter passage. Fortynd ikke cellesuspensioner. Cellerne i en sammenløbsbrønd i en 12-brøndplade kan fordeles på en brønd i en 12-brøndplade eller to brønde i en 24-brøndplade. Når der anvendes coatede dækslips, er kun ca. en tredjedel af dækslippen belagt. Derfor kan seks dækslips, der sidder i en 24-brøndplade med sammenløbende celler (~ 80% -90%), opnås fra en brønd af sammenløbsceller i en 12-brøndplade. Andre forhold kan også vælges for at øge eller mindske celletætheden. Til denne protokol anvendes en Cre+ reportermus [et eksperiment, to behandlinger: miR-25 eller control-miR; tekniske replikater n = 3 (tre dækslips pr. behandling), biologisk replikat n = 1]. Antallet af tekniske og biologiske replikater kan defineres forskelligt afhængigt af det eksperimentelle design.
- Kontroller, om cellerne er 90% -100% sammenløbende (også ved brøndens margen; Figur 3E,F).
- Fjern mediet og tilsæt 1 ml HBSS (stuetemperatur) til vask. Vip forsigtigt pladen (frem og tilbage, venstre og højre). Fjern HBSS helt.
- Der tilsættes 500 μL af en forvarmet trypsinholdig opløsning (forvarmet ved 37 °C i et metalperlebad) for at løsne cellerne fra brønden. Rock forsigtigt (frem og tilbage, venstre mod højre) og inkuber i 2 minutter i en 37 ° C inkubator.
- Flyt pladen fra inkubatoren til BSC. Under hældning skal du aspirere den trypsinholdige opløsning og sprede den forsigtigt og langsomt over brønden flere gange, indtil cellerne løsnes helt. Hold pladen mod lyset, og sørg for, at der ikke er celler tilbage i bunden.
- Overfør denne cellesuspension til et sterilt 1,5 ml rør. Centrifuger ved 300 x g i 8 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes, og cellepillen genaktiveres forsigtigt ved tilsætning af 600 μL (100 μL pr. brønd for 6 brønde/dæksler) forvarmet vækstmedium (suppleret med EGF; 1:1000). og pipettering op og ned ~ 30-40 gange.
BEMÆRK: Cellerne kan fryses på dette tidspunkt ved -80 ° C eller i flydende nitrogen og optøes efter standardprotokoller til optøning af cellelinjer. Hvis celler fryses, vil de ikke blive resuspended i EGF-suppleret medium (vækstmedium). De vil blive resuspended i basisk medium (uden EGF) og fryseopløsning (1/1 forhold). Trin 6.1.1 til 6.6.2 beskriver trinene til frysning af cellerne. Hvis ingen celler er frosset, fortsættes trin 6.7.- Fryseopløsningen fremstilles ved at blande 100 μL DMSO og 400 μL FBS (samlet volumen på 500 μL pr. brønd/prøve).
- Resuspender cellepillen i 500 μL forvarmet vækstmedium. Cellesuspensionen tilsættes til 500 μL DMSO/FBS-fryseopløsning (samlet volumen på 1 ml). Opbevar rør på is, indtil alle prøver er behandlet. Celler fryses ved -20 °C i 1 time, og opbevares derefter ved -80 °C.
- Seed cells ved at placere 100 μL af 600 μL celle-/mediesuspensionen (trin 6.6) i midten af seks coatede dæksler (se trin 5) på pladen med 24 brønde. Placer pladen forsigtigt i inkubatoren og lad cellerne slå sig ned.
BEMÆRK: 100 μL af 600 μL cellesuspensionen (høstet fra en brønd af en 12-brønds plade) vil resultere i 90% -100% cellesammenløb, hvilket er nødvendigt for transfektion. - Kontroller cellerne efter 3 timer for at se, om de har sat sig på dækslen. Der tilsættes 400 μL vækstmedium suppleret med EGF.
BEMÆRK: Celler er normalt klar til transfektion den følgende dag (figur 3G). Hvis de ikke er sammenfaldende (90% -100%), skal du forlade dem i en anden dag. Hvis de stadig ikke er sammenfaldende, må du ikke bruge dem til transfektion. Hvis andre downstream-applikationer udføres, såsom miRNA-profilering, RNA-Seq, RT-qPCR eller western blot, skal celler føres ind i 12-brøndplader (1: 1-forhold; ingen pladebehandling kræves) og høstes til RNA / proteinekstraktion.
7. Transfektion
BEMÆRK: Transfektionsfasen består kun af en 3 timers fase i transfektionsmedium (transfektionsprocedurer er beskrevet i transfektionsmanualen, der følger med transfektionsreagenset) og en langstrakt fase, hvor transfektionsreagens og miRNA'er stadig er til stede, men neuronalt medium med krævede kosttilskud tilsættes (samlet varighed er 2 dage; Figur 1B). I denne protokol vil seks brønde blive transficeret: tre brønde vil modtage omprogrammering miRNA miR-25 og tre brønde vil modtage kontrol miRNA.
- Kontroller, om cellerne nåede 90% sammenløb, og optag / afbild cellerne før transfektion.
- Fjern vækstmediet og tilsæt 500 μL HBSS (stuetemperatur) for at vaske cellerne.
- Hbss fjernes, og der tilsættes 400 μL reduceret serummedium, der anvendes til transfektioner. Læg pladen tilbage i en 37 °C inkubator.
- Forbered transfektionsblandingen ved at følge instruktionerne i producentens transfektionsreagensprotokol. Lav to blandinger: transfektionsreagensblanding og miRNA-blanding (se figur 1B for illustration).
- Forbered transfektionsreagensblandingen: For en 24-brønds plade kræves 49 μL reduceret serummedium og 1 μL transfektionsreagens til et hul (50 μL i alt). For seks brønde kombineres og blandes 294 μL reduceret serummedium og 6 μL transfektionsreagens og blandes godt ved forsigtigt at pipettere op og ned.
- Forbered miRNA-efterligningsblanding: For en 24-brøndplade kræves et samlet volumen på 50 μL af efterligningsblandingen for en brønd. Tre brønde vil modtage kontrol miRNA og de andre tre brønde vil blive behandlet med miR-25. Til denne protokol anvendes en slutkoncentration på 200 nM.
- Til miR-25-behandlingen (tre huller) kombineres 150 μL reduceret serummedium og 3 μL miR-25-efterligninger (100 μM stamopløsning) og blandes godt ved forsigtig pipettering op og ned. Inkuberes i 5 min.
Til kontrolefterligningsbehandling (tre brønde) kombineres og blandes 150 μL reduceret serummedium og 3 μL kontrol-miRNA-efterligninger (100 μM stamopløsning) godt ved forsigtigt at pipettere op og ned. Inkuberes i 5 min.
BEMÆRK: Volumenet af miRNA-efterligninger afhænger af fortyndingsfaktoren og den nødvendige koncentration (20-500 nM). miRNA-hæmmere (antagomiR'er) eller andre molekyler, herunder plasmider, kan også anvendes. Kombinationer af molekyler er også mulige at blive transficeret.
- Til miR-25-behandlingen (tre huller) kombineres 150 μL reduceret serummedium og 3 μL miR-25-efterligninger (100 μM stamopløsning) og blandes godt ved forsigtig pipettering op og ned. Inkuberes i 5 min.
- Kombiner miRNA-efterligningsblanding og transfektionsreagensblanding. Bland forsigtigt ved at pipettere langsomt og grundigt ved forsigtigt at pipettere op og ned. Inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur (i henhold til producentens anvisninger).
- Ovennævnte transfektionsblanding tilsættes dråbevis og langsomt oven på cellerne tæt på medieoverfladen i brønden ved hjælp af en 20 μL pipette. Vip pladen forsigtigt (frem og tilbage, fra venstre mod højre).
- Inkuberes i en 37 °C inkubator i 3 timer.
- Efter 3 timer tilsættes neuronalt medium til brøndene (500 μL pr. Brønd) suppleret med 4-Hydroxytamoxifen (5 mM lager rekonstitueret med 2,58 ml ethanol, 250 nM slutkoncentration) for at aktivere Cre-rekombinasen og 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU, 10 mM stamopløsning rekonstitueret med 2 ml DMSO, 1 μM slutkoncentration) for at spore celleproliferation.
FORSIGTIG: 4-Hydroxytamoxifen og EdU er kendt for at være humane kræftfremkaldende stoffer, teratogener og mutagener. Læs sikkerhedsdatablad før brug, og brug handsker, beskyttelsesbriller og kittel. Rekonstituer begge reagenser i henhold til producentens anbefalinger. Stoffet/blandingen må ikke indåndes. Tæt tæt efter brug. Affaldsmateriale skal bortskaffes i henhold til nationale og lokale regler. Vask hænder og ansigt efter arbejde med stoffet. - Inkuberes i en 37 °C inkubator i 2 dage (figur 1B).
8. Celle konvertering
BEMÆRK: Cellekonverteringsfasen har en varighed på ca. 5-6 dage (figur 1B), men længere perioder er mulige.
- Kontroller celler dagligt for vellykket induktion af tdTomato-ekspression, potentiel celledød og / eller forurening. Celletætheden ændres ikke (figur 4). Første svage røde fluorescerende mærkede celler kan observeres 1 dag efter 4-Hydroxytamoxifen behandling. Et fluorescerende mikroskop er påkrævet for at overvåge og afbilde cellerne.
BEMÆRK: I denne undersøgelse anvendes et fluorescensmikroskop til levende billeddannelse. Billeder er taget med 4x, 10x eller 20x mål. - To dage efter transfektion fjernes mediet og tilsættes 500 μL forvarmet neuronalt medium suppleret med 4-Hydroxytamoxifen og EdU i hver brønd.
- Udskift mediet med et frisk medium hver anden dag, indtil cellerne er høstet.
- Tag levende billeder til evaluering og vurdering af antallet af røde fluorescerende (Ascl1 udtrykkende) celler og deres morfologiske ændringer (figur 4 og figur 5A-C).
9. Cellehøst: fiksering til immunofluorescerende mærkning
BEMÆRK: Celler kan høstes til andre downstream-applikationer, herunder bulk eller scRNA-Seq, RT-qPCR eller western blot.
- Fjern mediet, og tilsæt 500 μL kold HBSS (4 °C) pr. brønd, og vip pladen forsigtigt (frem og tilbage, fra venstre mod højre). Fjern HBSS.
- Cellerne fikseres ved at tilsætte 500 μL 2% Paraformaldehyd (PFA) og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Udfør immunofluorescerende mærkning i henhold til etablerede protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver, hvordan man dyrker MG fra P12-musens nethinder, og hvordan man omprogrammerer disse celler med miR-25 til retinale neuroner ved hjælp af Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC reportermus. Denne metode blev anvendt i tidligere arbejde, der detaljeret rapporterede andre egnede miRNA'er (efterligninger eller hæmmere, som enkeltmolekyler eller i kombination) til at omprogrammere MG til RPC, der derefter vedtager neuronale celleegenskaber27. Denne metode er blevet ændret for at dyrke kulturer hurtigere og dermed minimere de cellulære ændringer forårsaget af det kunstige miljø over tid 24,28,29.
Retinal dissociation og vækstfase af primære MG-kulturer
Den første MG kan ses så tidligt som dag et in vitro ved hjælp af et lysmikroskop. MG har en rørformet, langstrakt form og lysegrå cellelegemer (figur 3A-D, røde pilespidser). De fleste af dem er dog dækket af cellulært affald på disse tidlige stadier. MG fra to nethinder af en mus, dyrket i en brønd af en 12-brøndplade, når 90% -95% sammenløb inden for 4-5 dage (figur 3E, F). Over tid vil alt neuronalt affald blive ryddet, og et tæt cellelag vil være til stede. Celler er ikke klar til passage, hvis bunden af brønden ikke er helt sammenflydende. Passage bør dog ikke ske senere end 6 dage in vitro, da glia mister deres glialegenskaber i kultur over tid. Før transfektion eller anden behandling skal celler kontrolleres for tæthed og vitalitet. Transfektion bør kun udføres på 90%-95% sammenløbsceller (figur 3G). Til immunofluorescerende mærkning og konfokal mikroskopianalyse skal celler podes på overtrukne dækslips.
Tidlig og sen fase af cellekonverteringsperioden
Så tidligt som 15 timer efter transfektion og 4-Hydroxytamoxifen-behandling begynder de første celler at udtrykke svag rød fluorescens, dvs. tdTomato rødt fluorescerende reporterprotein drevet under den (aktiverede) Ascl1-promotor. Ascl1-ekspressive celler kaldes nu yderligere Ascl1-Tom+ celler. Mere robust Ascl1-Tom ekspression kan observeres 2 dage efter transfektion med stigende rød fluorescens over tid (figur 4). Omprogrammeringseffekten bliver synlig omkring 2 dage i kultur med mange Ascl1-Tom+ celler pr. felt fundet i omprogrammerings miRNA-behandlingen: vist her for kontrol-miR og miR-25 (henholdsvis figur 4B-B''' og figur 4C-C'''). I begge behandlinger er Ascl1-Tom+ celler stadig ret runde og relativt store, med en mere glia/stamcellelignende morfologi. Desuden påvirker induktionen af den røde fluorescerende reporter ikke kulturens celletæthed (stadig 90% -95% sammenløb).
Tre til fem dage efter transfektion (figur 4A og figur 5A) bliver stigningen i antallet af Ascl1-Tom+ celler mere tydelig i de miR-25-behandlede brønde (figur 5B-D), der viser en firedobling i antallet efter miR-25-behandlinger sammenlignet med kontroller. Desuden bliver de første morfologiske ændringer synlige. Disse ændringer omfatter reduktion af celle soma størrelse og udvikling af fine processer. Mens langt de fleste celler under kontrolforhold er store og flade (glial / stamfaderlignende, figur- 5B-B''), vises mange celler med små kerner og flere små processer, der ligner retinale neuroner, i miR-25-behandlingen (figur- 5C-C''). Disse neuronale-lignende celler repræsenterer ca. 70% af den samlede Ascl1-Tom-population (15% i kontrolbehandling; Figur 5E). Celler er mindre tætte på grund af cellekonvertering (mindre celler kræver mindre plads). Interessant nok ser disse neuronallignende celler endda ud til at danne små netværk (figur 5C ''). På dette tidspunkt kan celler høstes til immunofluorescerende mærkning for at bekræfte neuronal identitet.
Bekræftelse af neuronal identitet
Celler er mærket med antistoffer mod mikrotubulusassocieret protein 2 (Map2), en markør for neuronspecifikke cytoskeletale proteiner30,31 og mod Orthodenticle homeobox 2 (Otx2) for at validere neuronal identitet32,33. Begge markører blev også brugt i tidligere omprogrammeringsundersøgelser 21,27. Otx2 er en transkriptionsfaktor, der findes i RPC'er 34,35,36, modne bipolære celler 34,35,37,38,39 og fotoreceptorer 35,36,37,38,40 . DAPI nuklear mærkning bruges til at modvirke kulturerne. Immunofluorescerende mærkning viser lidt til fraværende Map2- eller Otx2-ekspression under kontrolforhold (figur 6A-A''', C). miR-25 behandlede prøver har imidlertid mange Map2+ og Otx2+ celler (figur 6B-B'''). Kvantificering af konfokale billeder viser, at der efter miR-25 overekspression er ca. 40 neuronale celler pr. felt til stede sammenlignet med fem neuronale celler pr. felt i kontroller (figur 6C, feltstørrelse: 630 μm x 630 μm). Billeder blev taget med 20x mål. Disse neuronale celler udgør ca. 70% af den samlede Ascl1-Tom+ cellepopulation af de miR-25 behandlede prøver (kontrol ~ 20%, figur 6D). Alle neuronal-lignende Ascl1-Tom+ celler var Map2+ og Otx2+, hvilket bekræfter neuronal identitet. Desuden var det absolutte antal Otx2+ og Map2+ celler højere efter miR-25-behandlinger sammenlignet med kontrol-miRNA-behandling (miR-25: 60 celler pr. felt; kontrol-miR: 10 celler pr. felt; Figur 6E).
Samlet set viser resultaterne, at MG-kulturer kan dyrkes og omprogrammeres med miRNA'er. miR-25 tilskud inducerer Ascl1-Tom udtryk i primær MG. Mange MG konverteres til RPC'er, der vedtager en neuronal morfologi og udtrykker de neuronale markører Map2 og Otx2 efter et par dage.
Figur 1: Eksperimentelt design og tidsforløb for en primær Müller glia-kultur. (A) Skematisk af Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-mus, en retinal stamfaderreportermus, der bruges til at spore omdannelsen af Müller glia (MG) til retinale stamceller (RPC'er). (B) Tidsforløb for dyrkningsperioderne bestående af vækstfase (blå, 0-4/5 dage in vitro, div), transfektionsfase (lilla, 5/6-7/8 div) og MG-konverteringsfase (gul, starter 7/8 div). Vækstfase: dissocierede nethinder (to nethinder af en mus) dyrkes i en brønd af en 12-brøndplade i et vækstmedium. Omkring dag 4/6 føres celler ind i en 24-brønds plade, der indeholder belagte dækslips. Transfektionsfase: 5-7 div (1 dag efter passage) celler transficeret med miRNA'er i 2 dage i transfektionsmedium. Cre rekombinase aktiveres med 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT). Celleproliferation spores med EdU. MG konverteringsfasen starter 1 dag efter transfektion. Celler dyrkes nu i neuronalt medium indtil høst (6-7 dage efter transfektioner, dpTF). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Retinal dissociation og genotypning. (A) Øjenkop med fjernet hornhinde, linse, iris og glaslegeme. (B) Isolerede nethinder; retinal pigment epitel (RPE) celler fjernes efter en grundig vask. (C) 12-brønds plade med dissocierede nethinder (to nethinder pr. Brønd). (D) Udskæring af et eksempel på genotypning af gel. Genotypning er påkrævet for at identificere de mus, der har Ascl1-drevet Cre-rekombinaseekspression og vil blive brugt til sporing af cellekonvertering. Vægtstænger: 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Primær Müller glia i vækstfasen. (A) Tidsforløb for dyrkningsperioder i vækstfasen (0-4/5 dage in vitro (div)) fremhævet med blåt. (B-G) Levende billeder (fase) af Müller glia (MG) i vækstfasen efter 1 div (B), 2 div efter mediumændringen (C), 3 div (D), 4 div før passage (E,F) og 5 div, 1 dag efter passage og før transfektion (G). MG-cellelegemer er angivet med røde pilespidser. Efter 3 div er kulturer 60% -80% sammenløbende (D), efter 4-5 div er kulturer 90% -100% sammenflydende og klar til at blive passeret (E-F). Efter passage på dækslips skal cellekulturer være 80% -90% sammenløb til efterfølgende transfektion (G). Skalastænger: 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Tidlige stadier i Müller glia-konverteringsfasen. (A) Tidsforløb for dyrkningsperioder i konverteringsfasen fremhævet med gult (starter 7/8 dage in vitro (div)). Analysetidspunktet vist i denne figur er angivet med den røde stjerne: 7 div, 2 dage efter transfektion (dpTF). (B-C''') Levende billeder af Müller glia (MG) kulturer i fase og rød fluorescens, kombineret eller enkelt rød fluorescens. Rød fluorescens visualiserer Ascl1, der udtrykker MG (tdTomato+, forkortet Ascl1-Tom), 2 dage efter transfektion med enten kontrol miRNA-efterligninger (control-miR, B-B''') eller miR-25 mimics (C-C'''). Områder i B/B' og C/C' vises i højere forstørrelse i B''/B''', C''/C'''. Skalabjælker 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sluttrin i Müller glia-konverteringsfasen. (A) Kulturperioders tidsforløb i konverteringsfasen fremhævet med gult (starter 7/8 dage in vitro (div)). Analysetidspunktet vist i denne figur er angivet med den røde stjerne: 10 div, 5 dage efter transfektion (dpTF). (B-C'') Levende billeder af Müller glia (MG) kulturer i fase og rød fluorescens, kombineret eller enkelt rød fluorescens. Rød fluorescens visualiserer Ascl1, der udtrykker MG (tdTomato+, forkortet Ascl1-Tom), 5 dage efter transfektion (pTF) med enten kontrol miRNA-efterligninger (control-miR, B-B'') eller miR-25 mimics (C-C''). Indsatser i B'/C' vises i højere forstørrelse i henholdsvis B''/C''. (D) Det absolutte antal Ascl1-Tomat+ celler pr. felt (10x; 1440 μm x 1080 μm) efter kontrol-miRNA- eller miR-25-behandling, 2- og 5-dages posttransfektion (dpTF; n =1, fem billeder pr. brønd tælles; gennemsnit ± S.D.). (E) Procentdel af neuronallignende Ascl1-Tomat+ celler af total Ascl1-Tomat+ celler pr. felt (10x; 1440 μm x 1080 μm) efter kontrol-miRNA eller miR-25 behandling, 5 dage efter transfektion (5dpTF, n = 1, gennemsnit ± S.D.). Vægtstænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Bekræftelse af neuronal identitet af omprogrammerede celler. (A-A'''; B-B''') Immunofluorescerende mærkning af primære mus Müller glia (MG) kulturer 5 dage efter transfektion behandlet med kontrol miRNA-efterligninger (kontrol-miR, A-A''') eller miR-25-efterligninger (B-B'''). Celler blev fikseret med 2% paraformaldehyd (PFA) og inkuberet med antistoffer mod RFP for at mærke tdTomato, Map2 og Otx2 for at mærke neuroner. DAPI nuklear mærkning (blå) blev brugt til at plette alle cellekerner. (C-E) Kvantificering (n = 1; fem billeder pr. dækslip tælles; gennemsnitlig ± S.D.) af det absolutte antal Ascl1-Tom+Otx2+ Map2+ celler pr. felt (C), procentdel af Ascl1-Tom+Otx2+Map2+-celler af det samlede Antal Ascl1-Tom+-celler (D) og det absolutte antal Otx2+Map2+-celler pr. felt (E). Resultaterne viser et højere antal neuroner i miR-25-behandlingen sammenlignet med kontroller. Feltstørrelse: 630 μm x 630 μm. Skalastænger: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Celledød og bakteriel forurening. (A-A'') Levende billeder af Müller glia (MG) kulturer 3 div forurenet med bakterier. Indsats 1 i A er vist i højere forstørrelse i A' og viser atrofisk, død glia. Indsats 2 i A er vist i A'' med levende glia. Skalabjælker: 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan man dyrker MG fra dissocierede musehinden til omprogrammering af undersøgelser ved hjælp af miRNA'er. Som vist og bekræftet i en række tidligere undersøgelser er langt størstedelen (80%-90%) af cellerne, der findes i disse kulturer, MG 20,23,24. Denne metode er en meget robust og pålidelig teknik, og resultaterne kan let gengives, hvis protokollen følges korrekt21,27. Kulturens vellykkede vækst og omprogrammeringseffektivitet afhænger imidlertid af en række faktorer.
For det første spiller musens alder en vigtig rolle i en vellykket cellevækst. Derfor, hvis MG-kulturer dyrkes fra vildtypemus eller transgene mus, der ligner vilde typer som reportermus, er den seneste alder for at dyrke sammenflydende MG-monolag P12. Ved P12 er alle retinale neuroner og MG differentieret, og ingen RPC'er er til stede i nethinden længere. MG ekspres modne MG markører såsom glutaminsyntetase eller glutamat aspartattransportør (GLAST)20,23,41,42. Dyrket P12 MG kan stadig komme ind i cellecyklussen igen, når den udsættes for EGF, men antallet af cyklusser er begrænset, omend nok til at danne sammenflydende cellelag in vitro. Ikke desto mindre kan det forekomme, at selv P12 MG ikke vokser godt, fordi EGF eller komponenter i mediet kan nedbrydes. Ufuldstændig dissociation (bidder) kan også resultere i mindre eller forsinket MG-vækst. En væsentlig årsag til ufuldstændig dissociation er inaktivering af DNase, som jeg brugte til retinal dissociation ved hård håndtering af enzymet (hurtig pipettering, hvirveldannelse osv.). Selvom cellerne vokser godt indtil passage, kan celler være mindre sammenflydende efter passage. Årsager til dette kan være hård håndtering under passageprocessen, der fører til øget celledød, eller fordi cellerne blev podet for sparsomt. Da glia ikke vokser meget, skal celler belagt i samme forhold som dyrket, ikke fortyndes (i modsætning til passaging procedurer for udødeliggjorte cellelinjer). Bemærk, fordi MG-kulturer vokser fra midten til periferien af en brønd, vil højere celletætheder altid findes i midten. Det er derfor bydende nødvendigt at kontrollere margenerne for hver brønd inden passage for at sikre, at hele brønden er dækket af celler. Cellekoncentrationsmålinger skal udføres for at sikre behandling af tilstrækkelige mængder celler.
Derudover vil primære kulturer opnået fra mus ved P6 eller yngre ikke indeholde nogen MG, da MG er lige ved at modnes på dette tidspunkt. Dette blev vist via enkeltcelle RNA-seq analyse43. Immunofluorescerende mærkning med modne MG-markører i denne alder vil også bekræfte dette. Andelen af RPC'er er dog betydelig ved P6. Resultaterne bør derfor fortolkes omhyggeligt. Desuden er markører såsom de mellemliggende filamentmarkører vimentin og nestin ikke egnede til at identificere primær MG, da disse markører også udtrykkes i astrocytter 44,45,46, microglia 47,48, endotelceller og pericytter 49,50,51,52 , og er ikke MG-specifikke. GFAP, udtrykt i retinale astrocytter, men ikke i MG af ubeskadigede nethinder, er ikke en god markør for dyrket MG. Selvom det er opreguleret i dissocieret MG på grund af den mekaniske skade under dissociation, nedreguleres det efter 3 dage i kultur28.
Da MG deler mange RPC-markører, er den sikreste procedure for at sikre en robust MG-kultur at bruge mus på P12 eller ældre mus. Selvom denne protokol beskriver kulturer opnået fra P12 mus MG, kan voksen mus MG dyrkes og omprogrammeres27. Imidlertid skal mere væv pr. Brønd belagt (fire til seks nethinder). Dette skyldes, at voksne glia ikke deler sig meget, selvom de udsættes for EGF og 10% serum. Reducerede cellekontakter vil føre til celledød og celledegeneration (udstrakte celler, forstørrede celler). Voksen glia er et godt værktøj til samkulturparadigmer18 , og celletæthed betyder muligvis ikke så meget i disse applikationer. For downstream-applikationer såsom transfektion eller transduktion er sammenløbende cellelag imidlertid et krav.
Udover nedsat vækst kan celledød forekomme. Hvis celledød forekommer uden tydelige tegn, bør mycoplasma-kontaminering overvejes (mycoplasmastørrelse 0,1-0,3 μm), og der skal anvendes et mycoplasma-detektionssæt. At holde hver prøve adskilt (ikke samle prøver) kan også reducere risikoen for krydskontaminering. Større bakterier kan dog også overføres fra dyret og kan forårsage forurening, selvom alt arbejde udføres i et rent, sterilt miljø. Det anbefales at dyppe øjeæblet kortvarigt i 70% ethanol og en grundig vask i en yderligere 10 cm petriskål, før du dissekerer øjet. For at opnå en vellykket kultur er det bydende nødvendigt at arbejde under sterile forhold, da forurening kan ske hurtigt. Når bakterier, gær eller skimmel / svamp er fundet i en plade, selvom ikke alle brønde er påvirket, går kulturen tabt. Forureninger vil forårsage celledød (supplerende figur 1) og vil påvirke cellerne, hvilket resulterer i ikke-repræsentative data.
Celledød kan også være forårsaget af reagenser, der kræves til downstream-applikationer såsom Poly-O (eller Poly-D-Lysin), der bruges til at belægge dækslips. Disse stoffer er giftige, og grundig vask er påkrævet, før Laminin anvendes. Dækslips skal holde sig til bunden af brønden, ikke flyde inde i en brønd. Luftbobler skal undgås. Desuden er komplet belægning med Laminin afgørende for at sikre celleadhæsion til dækslippen. Mangel på Laminin vil også føre til mindre celletæthed og / eller celledød.
Til identifikation af ægte omprogrammeret glia bør reportermus og celleproliferationsmarkører, der tillader cellesporing, såsom EdU eller BrdU, anvendes. Da hele nethinder er belagt, er neuronale overlevende til stede i alle kulturer. De er dog næsten helt fjernet efter passage i de fleste tilfælde. Ikke desto mindre bør EdU (eller BrdU) mærkning udføres for at validere, at neuroner stammer fra prolifererende MG / RPC'er og ikke er neuronale overlevende (post-mitotiske). Det lille antal neuroner, der findes i de kontroller, der anvendes her, er neuronale overlevende.
Interessant nok er et par Ascl1-Tom+ celler også til stede i kontrolbehandlingen med lidt stigende antal over tid. Disse celler kunne være nogle temmelig umodne MG express Ascl1, når isoleret og dyrket. Andelen af denne Ascl1-Tom+ cellepopulation er dog lille. Desuden udtrykker de fleste af disse Ascl1-Tom+ celler, der findes i kontrolbehandlingen, ikke Otx2 og/eller Map2 og holder en ret flad celleform. Ingen neuronal differentiering synes at forekomme under kontrolforhold. Meget sarte neuronale-lignende celler, der ser ud til at danne netværk, findes kun efter miR-25-behandling.
Protokollen beskrevet her blev brugt i tidligere undersøgelser til at teste miRNA'er til MG-omprogrammering21,27 og er blevet ændret lidt i de seneste år med hensyn til brøndpladerne til at dyrke glia. De dyrkes nu i 12-brøndplader i stedet for 6-brøndplader. Sammenflydende monolag kan opnås i 12-brønds plader efter 4/5 dage (versus 6/8 dage med 6-brøndplader), og derfor reduceres den samlede kulturperiode, der fører til celleændring / degeneration. Transfektions tidsvinduet er også langstrakt. Regelmæssige transfektionsprotokoller har en transfektionsvarighed på 3 timer, hvorefter der skal udføres en komplet mediumændring for at sikre celleoverlevelse. Alle molekyler fjernes efter denne mediumændring. I den nuværende protokol blev tidsvinduet forlænget, og længere eksponering for miRNA'erne blev tilladt ved at tilføje 50% neuronalt medium (suppleret med de faktorer, der kræves til Cre-induktion og celleproliferationssporing) til transfektionsreagensmediet. Cellerne var sunde, og der opstod ingen problemer med denne ændring. Det ser ud til, at transfektionsresultaterne er bedre med den aflange transfektionstid, men der kræves flere data for at bekræfte denne observation.
Desuden er alle trin, der kræves for immunfluorescerende mærkning for at udføre konfokal laserscanningsmikroskopi, beskrevet her. Derfor skal MG'en passeres på glasovertræk. Da dækslerne er mindre end arealet af en 24 brøndplade, passer kun ca. en tredjedel af cellerne, der ville dække en hel brønd af en 24-brøndplade, på den belagte dækslip. Til andre applikationer såsom qPCR, RNA-Seq eller western blots passeres celler i et 1: 1-forhold, behandles og høstes på det ønskede tidspunkt.
Som tidligere nævnt kan dette kultursystem også bruges til andre applikationer, for eksempel til at studere gliaadfærd, herunder neurobeskyttende mekanismer, gliose og / eller til at profilere mRNA, miRNA eller proteiner af dyrket glia svarende til de undersøgelser, der brugte lidt forskellige kulturparadigmer eller arter 11,28,29,54 . Disse applikationer ville hverken kræve neuronalt medium for at sikre neuronal overlevelse efter omprogrammering eller tilsætning af EdU for at visualisere celleproliferation. Et lav-serum medium uden neuronale kosttilskud bør anvendes i stedet.
Selvom denne metode er robust og pålidelig, har den i lighed med alle primære kultursystemer begrænsninger; Disse er cellernes begrænsede levetid, progressiv celledegeneration over tid28, og det faktum, at det er et 2-dimensionelt, kunstigt kultursystem, der ikke kan efterligne den fysiologiske kontekst med hensyn til både andre retinale celletyper og ekstracellulær matrix. Derfor, efter at have identificeret topkandidater og deres mest effektive koncentrationer i MG primære kulturer, bør retinale explant kulturer, et 3-dimensionelt kultursystem, der ligner retinalvævet, udføres. Explant kulturer har også begrænsede kulturperioder, og celler i explants degenererer også over tid. De tillader dog undersøgelsen af MG i deres naturlige 3-dimensionelle miljø og kan udføres i forskellige aldre, der afspejler dyrets udviklingsstadium 23,32,55,56.
Samlet set rapporterer denne undersøgelse om MG-kulturer, der bruges til at overvåge potentialet i RPC miRNA miR-25 til at omprogrammere MG til neuronallignende celler, valideret ved immunofluorescerende mærkning. Denne protokol blev brugt i de tidligere værker 21,24,27 og er en nuværende in vitro-metode til at studere MG's regenerative potentiale. Selvom miRNA-overekspression til MG-omprogrammering udelukkende er beskrevet her, kan andre faktorer såsom små molekyler, DNA (enten plasmider eller pakket i virale vektorer), antistoffer til proteinhæmning32 eller specifikke forbindelser anvendes / testes i MG primære kulturer. Der er også et bredt spektrum af downstream-applikationer, herunder miRNA-profilering24, scRNA-seq27, RT-qPCR20,21 eller western blots20. Desuden tillader MG primære kulturer daglig observation og overvågning af cellerne. Dette kan være en væsentlig fordel til bestemmelse af tidspunkter, for eksempel for begyndelsen, varigheden og / eller slutningen af en bestemt reaktion eller cellerespons. Migrerende eller proliferativ adfærd samt skades-/celleskaderelaterede paradigmer (for eksempel global miRNA-deletion i MG-kulturer)32 kan studeres og analyseres i MG primære kulturer for at identificere underliggende mekanismer og veje. Derfor er MG-kulturer et meget kraftfuldt værktøj til at studere MG på molekylært og cellulært niveau før implementering i in vivo-systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Et patent, der indeholder nogle af resultaterne i denne rapport, er blevet indgivet af University of Washington med opfinderne Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl og Thomas A. Reh. Patentet har titlen '' Metoder og sammensætninger til at stimulere retinal regenerering.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Ann Beaton og alle laboratoriemedlemmer for deres input til manuskriptet. Særlig tak går til Dr. Tom Reh, Julia Pollak og Russ Taylor for at introducere MG primære kulturer som et screeningsværktøj til S.G.W. under postdoktoruddannelse ved University of Washington i Seattle. Undersøgelsen blev finansieret af Empire Innovation Program (EIP) Grant til S.G.W. og opstartsmidler fra SUNY Optometry til S.G.W. samt R01EY032532-prisen fra National Eye Institute (NEI) til S.G.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 | frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
- Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
- Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
- Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
- Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
- Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
- Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
- Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
- Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
- Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
- Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
- Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
- Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
- Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
- Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
- Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
- Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
- Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
- Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
- Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
- Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
- Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
- Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
- Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
- Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
- Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
- Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
- Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
- Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
- Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
- Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
- Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
- Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
- VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
- Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
- Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
- Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
- Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
- Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
- Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
- Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
- Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
- Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).
