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Developmental Biology

Primäre Zellkulturen zur Untersuchung des Regenerationspotenzials von murinen Müller-Glia nach MicroRNA-Behandlung

Published: March 28, 2022 doi: 10.3791/63651
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological and Vision Sciences, College of Optometry, The State University of New York

Summary

Müller-Glia-Primärkulturen, die aus Mausnetzhaut gewonnen werden, stellen ein sehr robustes und zuverlässiges Werkzeug dar, um die Umwandlung von Gliazellen in retinale Vorläuferzellen nach einer microRNA-Behandlung zu untersuchen. Einzelne Moleküle oder Kombinationen können vor der anschließenden Anwendung von In-vivo-Ansätzen getestet werden.

Abstract

Müller-Glia (MG) sind die vorherrschenden Gliazellen in der neuronalen Netzhaut und können als regenerative Quelle für retinale Neuronen fungieren. Bei niederen Wirbeltieren wie Fischen findet die MG-getriebene Regeneration auf natürliche Weise statt; Bei Säugetieren ist jedoch eine Stimulation mit bestimmten Faktoren oder eine genetische/epigenetische Manipulation erforderlich. Da MG nur 5% der retinalen Zellpopulation ausmachen, besteht ein Bedarf an Modellsystemen, die ausschließlich die Untersuchung dieser Zellpopulation ermöglichen. Eines dieser Modellsysteme sind primäre MG-Kulturen, die reproduzierbar sind und für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden können, einschließlich Molekül- / Faktor-Screening und -Identifizierung, Testen von Verbindungen oder Faktoren, Zellüberwachung und / oder Funktionstests. Dieses Modell wird verwendet, um das Potenzial von murinem MG zu untersuchen, sich nach Supplementierung oder Hemmung von microRNAs (miRNAs) durch Transfektion künstlicher miRNAs oder ihrer Inhibitoren in retinale Neuronen umzuwandeln. Die Verwendung von MG-spezifischen Reportermäusen in Kombination mit Immunfluoreszenzmarkierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bestätigte, dass 80% -90% der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG sind. Mit diesem Modell wurde entdeckt, dass miRNAs MG in retinale Vorläuferzellen (RPCs) umprogrammieren können, die sich anschließend in neuronale Zellen differenzieren. Die Vorteile dieser Technik bestehen darin, dass miRNA-Kandidaten vor ihrer Verwendung in In-vivo-Anwendungen auf ihre Effizienz und ihr Ergebnis getestet werden können.

Introduction

Die Müllerglia (MG) sind die vorherrschenden Gliazellen in der neuronalen Netzhaut. Sie haben ähnliche Funktionen im Vergleich zu anderen Gliazellen in anderen Teilen des zentralen Nervensystems, wie z.B. die Aufrechterhaltung der Wasser- und Ionenhomöostase, die Ernährung von Neuronen und den Schutz des Gewebes. MG haben eine weitere faszinierende Eigenschaft: Obwohl sie reife Gliazellen sind, exprimieren sie immer noch viele Gene, die in retinalen Vorläuferzellen (RPCs) während der späten Entwicklung exprimiertwerden 1,2. Es wird angenommen, dass diese Ähnlichkeit der Grund für die natürlich vorkommende MG-basierte neuronale Regeneration in der Netzhaut der Fische nach Netzhautschädenist 3,4. Während dieses Prozesses tritt MG wieder in den Zellzyklus ein und dedifferenziert sich in RPCs, die sich dann in alle sechs Arten von Netzhautneuronen differenzieren. Obwohl dieses Phänomen natürlich bei Fischen auftritt, wandeln sich MG von Säugetieren nicht in Neuronenum 5,6. Sie können jedoch umprogrammiert werden. Es wurde gezeigt, dass eine Vielzahl von Faktoren MG in RPCs / Neuronen umprogrammiert; Zu diesen Faktoren gehört der grundlegende Helix-Loop-Helix (bHLH)-Transkriptionsfaktor achaete-scute homolog 1 (Ascl1), der an der Fischregeneration beteiligt ist 7,8. Bei Mäusen wird Ascl1 während der Retinogenese nur in RPCs exprimiert, fehlt jedoch in reifen MG- oder retinalen Neuronen9.

Die direkte Reprogrammierung von Zellen in vivo ist nicht nur eine methodische Herausforderung, sondern erfordert auch die Genehmigung eines institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung. Um die Zulassung zu erhalten, sind vorläufige Daten über die verwendeten oder veränderten Faktoren, Konzentrationen, Off-Target-Effekte, zugrunde liegende Mechanismen, Toxizität und Effizienz erforderlich. Zellkultursysteme ermöglichen es, diese Kriterien vor der Verwendung in In-vivo-Modellen zu testen. Da MG nur etwa 5% der gesamten retinalen Zellpopulationausmachen 10, ermöglichen MG-Kulturen die Untersuchung ihrer Funktion 11 sowie ihres Verhaltens, einschließlich Migration 12,13, Proliferation 14, Stressreaktion auf Verletzungen/Schäden15,16, ihrer Interaktion mit anderen Zelltypen wie Mikroglia 17 oder retinalen Ganglienzellen (RGCs)18, oder ihr neurogenes Potential 19,20,21. Viele Forscher verwenden immortalisierte Zelllinien für ihre Studien, da sie ein unbegrenztes proliferatives Potenzial haben und leicht aufrechterhalten und transfiziert werden können. Primärzellen sind jedoch für biologisch relevante Assays besser geeignet als unsterbliche Zellen, da sie echte Zelleigenschaften (Gen- und Proteinexpression) aufweisen und, was noch wichtiger ist, ein bestimmtes Entwicklungsstadium darstellen und daher ein "Alter" haben. Das Alter eines Tieres (und folglich der von einem Tier gewonnenen Zellen) ist ein besonders entscheidender Faktor bei der zellulären Reprogrammierung, da die Zellplastizität mit fortschreitendem Entwicklungsstadium abnimmt22.

Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie primäres MG mit miRNAs als aktuelle In-vitro-Methode zur Untersuchung der Regeneration umprogrammiert werden kann. Dieses MG-Primärkulturmodell wurde 2012 etabliert, um die Zellproliferationseigenschaften von MG in P53-Knock-out-Mäusen (trp53-/- Mäuse)23 zu bewerten. Es wurde gezeigt, dass kultivierte MG ihre Gliaeigenschaften beibehalten (d. h. Expression von S100β-, Pax6- und Sox2-Proteinen, die über Immunfluoreszenzmarkierung bewertet werden) und dass sie in vivo MG (Microarray of FACS-gereinigtem MG)23 ähneln. Kurz darauf wurden gliale mRNA und Proteinexpression validiert und in einem anderen Ansatz mit viralen Vektorenbestätigt 20. Einige Jahre später wurde bestätigt, dass die überwiegende Mehrheit der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG ist, indem die MG-spezifische Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl Reportermaus24 verwendet wurde. Darüber hinaus zeigte die Quantifizierung des Satzes von miRNAs sowohl in FACS-gereinigtem MG als auch in kultiviertem primärem MG, dass die Spiegel von MG-miRNAs (mGLiomiRs) in kultiviertem MG während der Wachstumsphase nicht sehr unterschiedlich sind. Verlängerte Kulturperioden verursachen jedoch Veränderungen der miRNA-Spiegel und folglich der mRNA-Spiegel und der Proteinexpression, da miRNAs translationale Regulatorensind 25.

Im Jahr2013 wurde dieses MG-Kulturmodell verwendet, um eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren in Bezug auf ihre Fähigkeit zu testen, MG in retinale Neuronen 20 umzuprogrammieren. Ascl1 erwies sich als sehr robuster und zuverlässiger Reprogrammierungsfaktor. Die Überexpression von Ascl1 über virale Vektoren induzierte morphologische Veränderungen, die Expression neuronaler Marker und den Erwerb neuronaler elektrophysiologischer Eigenschaften. Noch wichtiger ist, dass die Erkenntnisse und Ergebnisse aus diesen ersten In-vitro-Experimenten erfolgreich auf In-vivo-Anwendungenübertragen wurden 22,26, die zeigen, dass primäre MG-Kulturen ein solides und zuverlässiges Werkzeug für anfängliche Faktor-Screenings und die Bewertung von Glia-Merkmalen vor der In-vivo-Implementierung darstellen.

Vor einigen Jahren wurde gezeigt, dass die mit dem Gehirn angereicherte miRNA miR-124, die auch in retinalen Neuronen hoch exprimiert wird, die Ascl1-Expression in kultiviertem MG21 induzieren kann. Die Ascl1-Expression in lebenden Zellen wurde über eine Ascl1-Reportermaus (Ascl1 CreERT:tdTomato STOPfl/fl) visualisiert. Eine Reportermaus ist eine gentechnisch veränderte Maus, in deren DNA ein Reportergen eingefügt wurde. Dieses Reporter-Gen kodiert für ein Reporterprotein, das in dieser Studie tdTomato, ein rot fluoreszierendes Protein, ist. Dieses Reporterprotein berichtet über die Expression eines Gens von Interesse, in diesem Fall Ascl1. Mit anderen Worten, Zellen, die Ascl1 ausdrücken, werden rot. Da Ascl1 nur in RPCs9 exprimiert wird, ermöglicht diese Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl-Maus die Verfolgung der MG-Umwandlung in Ascl1-exprimierende RPCs, was bedeutet, dass die Umwandlung von Zellen rot fluoreszierendes tdTomaten-Reporterprotein exprimiert. Dies ist eine irreversible Markierung, da die DNA dieser Zellen verändert ist. Folglich wird jede nachfolgende neuronale Differenzierung visualisiert, da die tdTomato-Markierung in differenzierenden Zellen verbleibt. Wenn Ascl1-exprimierende MG-abgeleitete RPCs (mit tdTomato-Label) in Neuronen differenzieren, haben diese Neuronen immer noch ihre rote Markierung. Diese Maus ermöglicht daher nicht nur die Markierung von MG-abgeleiteten RPCs für die Live-Cell-Bildgebung, sondern ermöglicht auch die Schicksalskartierung und Abstammungsverfolgung dieser MG-abgeleiteten (roten) RPCs. In jüngerer Zeit wurde der Satz von miRNAs in RPCs identifiziert und MG-Kulturen von Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-Reporter-Mäusen wurden verwendet, um die Wirkung dieser miRNAs auf die Reprogrammierungskapazität und -effizienz zu screenen und zu testen27. Ein Kandidat, die RPC-miRNA miR-25, wurde in der Lage befunden, kultiviertes MG in Ascl1-exprimierende (Ascl1-Tomato+) Zellen umzuprogrammieren. Diese reprogrammierten Zellen nehmen im Laufe der Zeit neuronale Merkmale an, einschließlich der neuronalen Morphologie (kleine Somata und entweder kurze oder lange Feinprozesse), der Expression neuronaler Transkripte, die über scRNA-Seq gemessen werden, sowie der Expression neuronaler Proteine, die über Immunfluoreszenzmarkierung validiert wurden27.

Hier beschreibt das Protokoll, wie MG von P12-Mäusen gezüchtet und transfiziert werden kann, angepasst an die vorherige Arbeit21,24,27. Für dieses Protokoll wurde die oben erwähnte miRNA miR-25 ausgewählt, eine miRNA, die in RPCs hoch exprimiert wird, mit niedrigen Expressionsspiegeln in MG- oder Netzhautneuronen. Um miR-25 zu überexprimieren, werden murine miR-25-Moleküle verwendet, d.h. künstliche miRNA-Moleküle. Zur Kontrolle werden Nachahmungen einer miRNA aus Caenorhabditis elegans gewählt, die in Säugetierzellen keine Funktion haben. Die Visualisierung der Umwandlung von MG in RPCs erfolgte über die RPC-Reportermaus (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), eine Maus mit gemischtem Hintergrund (C57BL/6, S129 und ICR-Dehnungen). Diese Kultur kann jedoch mit allen Mausstämmen, einschließlich Wildtyp-Stämmen, durchgeführt werden. In den letzten Jahren wurde das ursprüngliche Protokoll modifiziert, um die Dauer der Wachstumsphase und die Gesamtkulturperiode zu reduzieren und einen robusteren Gliazellenstatus zu gewährleisten und den Grad der zellulären Degeneration, die in längeren Kulturperioden auftritt, zu minimieren. Auch das reguläre Transfektionszeitfenster wurde von 3 h auf 2 Tage verlängert. Obwohl das aktuelle Protokoll MG-Kulturen als Werkzeug für Regenerationsstudien beschreibt, ist die Methode nicht nur zum Testen von Reprogrammierungsfaktoren nützlich, sondern kann auch für andere Anwendungen angepasst werden, einschließlich Studien über MG-Migrations- oder Proliferationsverhalten, Verletzungs- / Zellschadensparadigmen und / oder die Identifizierung zugrunde liegender Mechanismen und Signalwege.

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Protocol

Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am SUNY College of Optometry genehmigt.

HINWEIS: Dieses Kulturprotokoll besteht aus drei Phasen: Wachstums-, Transfektions- und Konversionsphase. Eine Zusammenfassung des Gesamtprotokolls mit dem Zeitplan ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Aufbereitung von Medien und allen erforderlichen Reagenzien

HINWEIS: Alle Schritte müssen in einer A2- oder B2-Biosicherheitskabine (BSC) durchgeführt werden. Während der Wachstumsphase wird ein hochserumes Wachstumsmedium verwendet, das aus einem basalen neuronalen Medium besteht, das mit einem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ergänzt wird. Für die Konversionsphase wird ein serumarmes neurophysiologisches Basalmedium, das mit neuronalen Nahrungsergänzungsmitteln ergänzt wird, verwendet, um die neuronale Differenzierung und das Überleben zu sichern.

  1. Bereiten Sie das Wachstumsmedium (während der Wachstumsphase verwendet) vor, indem Sie 200 ml basales neuronales Medium mit 20 ml fetalem Rinderserum (FBS, 10%), 1 ml 200 mM L-Glutamin (0,5%), 2 ml Penicillin / Streptomycin (1%) und 2 ml N2-Ergänzung (1%) ergänzen. Sterilfiltration (Filtereinheiten mit 0,22 μm Porengröße). Das Medium vor Gebrauch im 37 °C großen Metallperlenbad vorwärmen.
  2. Vorbereiten des neuronalen Mediums (während der Umstellungsphase verwendet) gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) durch Ergänzung von 100 ml serumfreiem neurophysiologischem Basalmedium mit 2 ml neuronalem B27-Supplement (2%), 1 ml N2-Ergänzung (1%), 20 μL 100 ng/ml hirnabgeleitetem neurotrophem Faktor (BDNF, rekonstituieren in 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Endkonzentration 20 ng/ml), 20 μL 100 ng/ml Gliazell-abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF, rekonstituiert in steriler Hanks' Balanced Salt Solution [HBSS], Endkonzentration 20 ng/ml), 500 μL 100 mg/ml Dibutyryl-cAMP (rekonstituiert in DMSO), 70 μL 50 ng/ml Ascorbinsäure (rekonstituiert in sterilem PBS) und 1,5 ml Penicillin/Streptomycin. Sterilfiltration (Filtereinheiten mit 0,22 μm Porengröße). Vorgewärmtes Medium im 37 °C Metallperlenbad vor Gebrauch.
    HINWEIS: Diese Medien können 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
  3. Rekonstituieren Sie Papain-, DNase I- und Ovomucoid-Reagenzien, die für die retinale Dissoziation gemäß dem Protokoll des Herstellers erforderlich sind. Aliquot 750 μL Papain in sterilen 1,5-ml-Röhrchen, 75 μL DNase I in sterilen 0,6-ml-Röhrchen und 750 μL Ovomucoid-Proteasehemmer in 2-ml-Röhrchen. Papain und DNase I Aliquots bei -20 °C einfrieren und Ovomucoid-Aliquots bei 4 °C aufbewahren, um einen Abbau der Reagenzien zu vermeiden. Bei Raumtemperatur kurz vor Gebrauch auftauen.
    HINWEIS: Papain, DNase I und Ovomucoid sind in einem Kit namens Papain-Dissoziationssystem enthalten (siehe Materialtabelle).
  4. Rekonstituieren Sie Poly-L-Ornithin (Poly-O) und Laminin für die Deckglasbeschichtung, wenn die Immunfluoreszenzmarkierung gemäß den Anweisungen des Datenblatts durchgeführt wird (Poly-O: 0,1 mg/ml in sterilem Wasser; Laminin: 1,2 mg/ml bei 1:50 in DMEM verdünnen). Aliquot Poly-O und Laminin (2,5 ml) und aliquot bei -20 °C einfrieren. Bei Raumtemperatur kurz vor Gebrauch auftauen.
    HINWEIS: Schritt 1.4. ist nur erforderlich, wenn eine Immunfluoreszenzmarkierung und Laser-Scanning-Mikroskopie durchgeführt wird.

2. Mäuse und Gewebeextraktion

HINWEIS: Für diese Reprogrammierungsstudien wurde die Ascl1 CreERT:tdTomato STOPfl/fl-Maus durch Kreuzung einer Ascl1 CreERT-Maus (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) mit einer tdTomatoSTOPfl/fl-Maus (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914) erstellt. Diese Maus hat einen gemischten Hintergrund (C57BL/6, S129 und ICR-Dehnung). Der Genotyp dieser Maus ist in Abbildung 1A dargestellt. Alle Stämme können für dieses Protokoll verwendet werden.

  1. Tragen Sie Handschuhe und desinfizieren Sie den Arbeitsbereich, einschließlich des Seziermikroskops und aller feinen Werkzeuge (Dumont # 5 feine und Dumont # 7 gebogene Pinzette, feine Schere und Vannas-Schere) mit 70% Ethanol. Desinfizieren Sie eine 10 cm mit Silikon beschichtete schwarze Sezierschüssel, indem Sie sie 20 Minuten lang UV-Licht aussetzen.
  2. Zubereitung von Geschirr und Tellern für die Gewebeextraktion
    1. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte für die Augenentnahme und Probentrennung vor (zwei Augen pro Maus in einem Well, gekennzeichnet mit Maus-IDs) mit ~ 1 ml kaltem HBSS (4 ° C) pro Well. Legen Sie die 24-Well-Platte auf Eis.
    2. Füllen Sie eine sterile 10 cm Petrischale (zum Waschen) und die desinfizierte silikonbeschichtete Sezierschale mit mehreren ml kaltem HBSS (4 °C), um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig mit HBSS bedeckt ist.
    3. Bereiten Sie ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml 70% Ethanol vor.
    4. Bereiten Sie eine 12-Well-Kulturplatte vor, indem Sie die Platte mit Kulturnummer, Datum, Stamm und allen erforderlichen Informationen beschriften.
  3. Euthanasie P12-Mäuse mit einer zugelassenen Methode.
  4. Augenentfernung
    1. Halten Sie den Mauskopf vorsichtig mit Daumen und Zeigefinger um das Auge.
    2. Gehen Sie mit einer gebogenen Pinzette von Dumont #7 vorsichtig hinter den Augapfel und befestigen Sie den Sehnerv. Nehmen Sie vorsichtig das Auge heraus.
      HINWEIS: Wenn erwachsene Mäuse verwendet werden, verwenden Sie keine gebogene Pinzette und ziehen Sie nicht am Auge. Schneiden Sie stattdessen sorgfältig um den Augenglobus mit einer feinen Schere; Schneiden Sie den Sehnerv ab, aber schneiden Sie nicht das Auge selbst. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Augapfel vorsichtig zu entfernen.
  5. Augapfelreinigung
    1. Tauchen Sie den Augapfel kurz in ein ethanolhaltiges Röhrchen, um eine Verschleppung von Bakterien vom Tier zu vermeiden.
    2. Waschen Sie den Augapfel kurz in der 10 cm Petrischale, bevor Sie ihn in die 24-fache Platte auf Eis legen.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5 für die anderen Augen. Halten Sie die Brunnenplatte während des Vorgangs auf dem Eis. Legen Sie zwei Augen von einem Tier in die Sezierschüssel, die unter einem Seziermikroskop mit einer Lichtquelle platziert ist.
  7. Netzhaut-Extraktion
    1. Fixieren Sie einen Augapfel, indem Sie den Sehnerv und das umgebende Bindegewebe um die Sklera mit Dumont #5 feiner Pinzette greifen und vorsichtig gegen die Sezierschale drücken (Hornhaut nach oben).
    2. Machen Sie ein Loch in der Mitte der Hornhaut mit einer 30-G-Nadel, um den Zugang für die Vannas-Schere zu erleichtern.
    3. Sezieren Sie die Hornhaut um den Ziliarkörper mit einer Vannas-Schere und entfernen Sie Hornhaut, Linse, Iris und Glaskörper vorsichtig mit Dumont #5 feinen Pinzetten. Abbildung 2A zeigt eine Augenmuschel mit der Netzhaut im Inneren.
    4. Sezieren Sie die Sklera mit einer Vannas-Schere, bis der Sehnerv erreicht ist. Befestigen Sie den Sehnerv und extrahieren Sie die Netzhaut vorsichtig mit Dumont # 5 feiner Pinzette.
    5. Verwenden Sie ein zweites Paar Dumont # 5 feine Pinzetten, um gegen die Netzhaut zu drücken und die vollständige Entfernung des Glaskörpers zu ermöglichen. Abbildung 2B zeigt zwei extrahierte Netzhäute.
  8. Transfer und Waschen
    1. Schneiden Sie etwa 2,5 cm der Spitze einer sterilen Transferpipette ab, um den Durchmesser zu vergrößern. Nehmen Sie mit diesem Tipp die gesamte Netzhaut auf (saugen Sie sie ein), ohne das Gewebe zu beschädigen.
    2. Die Netzhaut in eine neue sterile Petrischale mit kaltem HBSS (4 °C) geben und die Schale (hin und her, links und rechts) schaukeln.
    3. Schieben Sie die Netzhaut mit der Transferpipettenspitze vorsichtig herum, um retinale Pigmentepithelzellen (RPE) abzuwaschen.
      HINWEIS: Alternativ kann die gesamte Netzhaut mit Linse und Glaskörper aus der Augenmuschel entfernt werden. Dann können die Linse und der Glaskörper von der extrahierten Netzhaut entfernt werden. Wenn die Netzhaut gerissen ist, stellen Sie sicher, dass Sie alle Stücke zur Dissoziation sammeln. Andernfalls werden nicht genügend Gewebemengen vorhanden sein, um konfluierende Zellschichten zu züchten.
  9. Legen Sie die isolierte Netzhaut sofort in eine neue, saubere Vertiefung der 24-Well-Platte, die mit 1 ml HBSS gefüllt ist. Halten Sie die 24-Well-Platte während des Seziervorgangs auf dem Eis.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 2.7-2.9, um die zweite Netzhaut zu isolieren.

3. Netzhautdissoziation

HINWEIS: Alle folgenden Schritte (bis zur Zellernte) müssen in einer A2- oder B2-Biosicherheitskabine (BSC) durchgeführt werden.

  1. Stellen Sie das Papain/DNase I-Dissoziationsgemisch wie folgt her.
    1. Für sechs Netzhäute werden 75 μL DNase I in die Tube mit 750 μL Papain (ab Schritt 1.3) gegeben und vorsichtig gemischt (Dissoziationsmischung).
    2. Für die individuelle Probenvorbereitung, die für dieses Protokoll erforderlich ist, teilen Sie das Gesamtvolumen von 825 μL in drei Aliquots auf: 275 μL der Mischung in einem 1,5 ml Röhrchen pro Maus (zwei Netzhäute). Berechnen Sie die erforderlichen Mengen an DNase I und Papain entsprechend.
      HINWEIS: Bis zu sechs Netzhäute können in einer Tube Papain/DNase I-Mischung dissoziiert werden. Die individuelle Probenvorbereitung führt jedoch zu weniger Klumpen und einem besseren Zellwachstum als bei kombinierten Proben.
  2. Übertragen Sie zwei Netzhäute auf die Dissoziationsmischung Papain/DNase I. Verwenden Sie eine Transferpipette mit einem vergrößerten Spitzendurchmesser (Schritt 2.8.1), nehmen Sie die Netzhaut auf, warten Sie, bis sich die Netzhaut am unteren Rand der Spitze absetzt, und geben Sie dann die Netzhaut ohne übermäßige HBSS in den Schlauch frei, der das Papain/DNase I-Gemisch enthält.
  3. Auf einen Nutator legen und 10 min in einem Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5% CO2) inkubieren.
  4. Dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette (ca. 20-30 mal) auf und ab pipettieren. Nachdem die Zellen dissoziiert wurden (d.h. was zu einer homogenen Lösung ohne Brocken führt), fügen Sie 275 μL Ovomucoid-Proteasehemmer aus dem Papain-Dissoziationskit hinzu, um das Papain zu neutralisieren. Vorsichtig durch Pipettieren auf und ab mischen.
    HINWEIS: Wenn sechs Netzhäute in 825 μL Papain/DNase I-Mischung dissoziiert wurden, sind 825 μL Ovomucoid erforderlich.
  5. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 300 x g für 10 min bei 4 °C.
  6. Fügen Sie dem berechneten Volumen des bei 37 °C vorerwärmten Wachstumsmediums (1 ml pro 1 ml des Wachstumsmediums, rekonstituiert bei 200 μg/ml in PBS) den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF, 1 μl pro 1 ml des Wachstumsmediums, rekonstituiert bei 200 μg/ml in PBS) hinzu.
    HINWEIS: Je nach experimentellem Design können zu Beginn der Kulturperiode der Proliferationsmarker 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU) sowie 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) oder andere erforderliche Faktoren hinzugefügt werden.
  7. Entfernen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge. Berühren Sie nicht das Pellet am Boden des Rohres.
  8. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und vollständig. Resuspendiert das Zellpellet mit 500 μL EGF-ergänztem Wachstumsmedium.
  9. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine Vertiefung der markierten 12-Well-Platte (Abbildung 2C). Spülen Sie das Röhrchen mit weiteren 500 μL des EGF-ergänzten Wachstumsmediums aus und geben Sie es dem Bohrloch hinzu (Gesamtvolumen von 1 ml pro Well).
  10. Wiederholen Sie die Schritte 3.8 und 3.9 mit allen anderen Beispielen.
  11. Schaukeln Sie die Bohrlochplatte dreimal vorsichtig (hin und her; links und rechts). Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, CO2).
    HINWEIS: Wenn transgene Mäuse verwendet werden, führen Sie eine Genotypisierung für jedes Tier durch (Abbildung 2D). Identifizieren Sie positive und negative Mäuse der Cre-Rekombinase und kennzeichnen Sie die Platte entsprechend. Für dieses Protokoll wurden nur Zellen von Cre-Rekombinase-positiven Reportermäusen für die nächsten Schritte verwendet. Zellen von Cre-negativen Proben werden eingefroren und für andere Anwendungen verwendet.

4. Wachstumsphase

HINWEIS: Die Wachstumsphase hat eine Dauer von ca. 4-5 Tagen (Abbildung 1B). Für die Zugabe von Flüssigkeiten zu Vertiefungen, die Zellen enthalten, muss die Pipette auf die Wand des Brunnens zeigen und die Flüssigkeit muss langsam freigesetzt werden, um eine Zellablösung zu vermeiden. Pipetten Sie nicht direkt auf die Zellen.

  1. Entfernen Sie einen Tag nach der Dissoziation das Medium und fügen Sie 1 ml frisches EGF-ergänztes Wachstumsmedium hinzu.
  2. Entfernen Sie am Tag 3 das Medium und fügen Sie 1 ml HBSS (Raumtemperatur) hinzu, um Zelltrümmer zu entfernen. Felsen Sie sanft von links nach rechts hin und her. Entfernen Sie HBSS, wiederholen Sie den Waschschritt und fügen Sie 1 ml vorgewärmtes EGF-ergänztes Wachstumsmedium hinzu.
  3. Überwachen Sie die Zellen jeden Tag und bewerten Sie ihren Wachstumsstatus, bis die Zellen eine 90% -100% ige Konfluenz erreichen. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für ein gutes MG-Wachstum im Laufe der Zeit. Überprüfen Sie auf mögliche Kontamination oder Zelltod (Ergänzende Abbildung 1). Entsorgen Sie kontaminierte Kulturen.
    HINWEIS: Um den Zellzustand zu überwachen und aufzuzeichnen, nehmen Sie Bilder mit verschiedenen Vergrößerungen mit einem Lichtmikroskop mit angeschlossener Kamera und 4x-, 10x- oder 20x-Objektiven auf. In dieser Studie wird ein Fluoreszenzmikroskop verwendet.

5. Herstellung von Deckgläsern mit Poly-L-Ornithin (Poly-O) und Laminin-Beschichtung

HINWEIS: Dieser Schritt ist nur notwendig, wenn eine Immunfluoreszenzmarkierung und eine konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie durchgeführt werden. Für die ordnungsgemäße Bildgebung sind runde Glasabdeckungen (12 mm Durchmesser) erforderlich. Das Beschichtungsprotokoll finden Sie auch im Datenblatt des neuronalen Mediums (siehe Materialtabelle).

  1. Platzieren Sie sterile Deckgläser vorsichtig in der Mitte jedes Brunnens einer 24-Well-Platte mit sterilen Dumont-#2AP Pinzetten.
    HINWEIS: Legen Sie Deckgläser in die Mitte des Brunnens. Das Anbringen von Deckgläsern in der Nähe der Wand eines Brunnens verursacht bei den folgenden Schritten Probleme mit der Oberflächenspannung.
  2. Tauen Sie ein 2,5 mL Poly-O Aliquot bei Raumtemperatur auf und legen Sie 100 μL davon in die Mitte jedes Deckglases.
  3. Inkubieren Sie die Bohrlochplatte für 30 min in einem 37 °C Inkubator.
  4. Entfernen Sie Poly-O und waschen Sie den Brunnen dreimal mit dem Deckglas mit ~ 1 ml sterilem Wasser.
  5. Lassen Sie die Brunnenplatte über Nacht im BSC trocknen. Tauen Sie 2,5 ml Laminin bei 4 °C über Nacht auf.
  6. Am nächsten Morgen 100 μL Laminin in die Mitte jedes Deckglases geben und 4 h in einem 37 °C Inkubator inkubieren.
  7. Entfernen Sie das Laminin vorsichtig und vollständig.
  8. Halten Sie die Platte bei 4 °C, wenn das Passieren nicht sofort durchgeführt werden kann.
    HINWEIS: Die beschichteten Deckgläser in vorbereiteten Platten können einige Tage bei 4 °C aufbewahrt werden.

6. Zellpassage zur Entfernung neuronaler Überlebender

HINWEIS: Die Zellpassage ist erforderlich, um neuronale Zellen zu entfernen, nicht um die Zellpopulation zu erhöhen. Glia teilen sich nur ein paar Mal und werden nach der Passage nicht weiter wachsen. Zellsuspensionen nicht verdünnen. Die Zellen einer konfluierenden Vertiefung einer 12-Well-Platte können auf eine Vertiefung einer 12-Well-Platte oder zwei Wells einer 24-Well-Platte verteilt werden. Bei der Verwendung von beschichteten Deckgläsern wird nur etwa ein Drittel des Deckglases beschichtet. Daher können sechs Deckgläser, die in einer 24-Well-Platte mit konfluierenden Zellen (~ 80% -90%) sitzen, aus einer Vertiefung von konfluierenden Zellen einer 12-Well-Platte erhalten werden. Andere Verhältnisse können ebenfalls gewählt werden, um die Zelldichte zu erhöhen oder zu verringern. Für dieses Protokoll wird eine Cre+ Reportermaus verwendet [ein Experiment, zwei Behandlungen: miR-25 oder control-miR; technische Replikate n = 3 (drei Deckgläser pro Behandlung), biologisches Replikat n = 1]. Die Anzahl der technischen und biologischen Replikate kann je nach Versuchsplan unterschiedlich definiert werden.

  1. Überprüfen Sie, ob die Zellen zu 90% -100% konfluent sind (auch am Rand des Bohrlochs; Abbildung 3E,F).
  2. Entfernen Sie das Medium und geben Sie 1 ml HBSS (Raumtemperatur) zum Waschen. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig (hin und her, links und rechts). Entfernen Sie HBSS vollständig.
  3. Fügen Sie 500 μL einer vorgewärmten trypsinhaltigen Lösung hinzu (vorgewärmt bei 37 °C in einem Metallperlenbad), um die Zellen aus dem Brunnen zu lösen. Sanft schaukeln (hin und her, von links nach rechts) und 2 min in einem 37 °C Inkubator inkubieren.
  4. Verschieben Sie die Platte vom Inkubator nach BSC. Saugen Sie beim Kippen die trypsinhaltige Lösung ab und verteilen Sie sie mehrmals vorsichtig und langsam über den Brunnen, bis sich die Zellen vollständig lösen. Halten Sie die Platte gegen das Licht und stellen Sie sicher, dass unten keine Zellen mehr vorhanden sind.
  5. Übertragen Sie diese Zellsuspension in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 300 x g für 8 min bei 4 °C.
  6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig, indem Sie 600 μL (100 μL pro Vertiefung für 6 Vertiefungen/Deckgläser) vorgewärmtes Wachstumsmedium (ergänzt mit EGF; 1:1000) hinzufügen. und Pipettieren auf und ab ~30-40 mal.
    HINWEIS: Die Zellen können zu diesem Zeitpunkt bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und nach Standardprotokollen zum Auftauen von Zelllinien aufgetaut werden. Wenn Zellen eingefroren werden, werden sie nicht in EGF-ergänztem Medium (Wachstumsmedium) resuspendiert. Sie werden in Basismedium (ohne EGF) und Gefrierlösung (Verhältnis 1/1) resuspendiert. In den Schritten 6.1.1 bis 6.6.2 werden die Schritte zum Einfrieren der Zellen beschrieben. Wenn keine Zellen eingefroren sind, fahren Sie mit Schritt 6.7 fort.
    1. Bereiten Sie die Gefrierlösung vor, indem Sie 100 μL DMSO und 400 μL FBS (Gesamtvolumen von 500 μL pro Well/Probe) mischen.
    2. Resuspendiert das Zellpellet in 500 μL vorerwärmtem Wachstumsmedium. Fügen Sie die Zellsuspension zu 500 μL DMSO/FBS-Gefrierlösung (Gesamtvolumen von 1 ml) hinzu. Halten Sie die Röhrchen auf Eis, bis alle Proben verarbeitet sind. Zellen bei -20 °C für 1 h einfrieren und dann bei -80 °C lagern.
  7. Samenzellen durch Platzieren von 100 μL der 600 μL Zell-/Mediensuspension (Schritt 6.6) in der Mitte von sechs beschichteten Deckgläsern (siehe Schritt 5) der 24-Well-Platte. Legen Sie die Platte vorsichtig in den Inkubator und lassen Sie die Zellen absetzen.
    HINWEIS: 100 μL der 600 μL Zellsuspension (geerntet aus einer Vertiefung einer 12-Well-Platte) führen zu einer Zellkonfluenz von 90% -100%, die für die Transfektion erforderlich ist.
  8. Überprüfen Sie die Zellen nach 3 h, um zu sehen, ob sie sich auf dem Deckglas abgesetzt haben. Fügen Sie 400 μL Wachstumsmedium hinzu, das mit EGF ergänzt wird.
    HINWEIS: Die Zellen sind in der Regel am nächsten Tag für die Transfektion bereit (Abbildung 3G). Wenn nicht konfluent (90%-100%), lassen Sie sie für einen anderen Tag. Wenn immer noch nicht konfluent, verwenden Sie sie nicht für die Transfektion. Wenn andere nachgelagerte Anwendungen wie miRNA-Profiling, RNA-Seq, RT-qPCR oder Western Blot durchgeführt werden, müssen Zellen in 12-Well-Platten (Verhältnis 1: 1; keine Plattenbehandlung erforderlich) geleitet und für die RNA / Protein-Extraktion geerntet werden.

7. Transfektion

HINWEIS: Die Transfektionsphase besteht aus einer 3-stündigen Phase nur im Transfektionsmedium (Transfektionsverfahren sind im Transfektionshandbuch beschrieben, das mit dem Transfektionsreagenz geliefert wird) und einer länglichen Phase, in der Transfektionsreagenz und miRNAs noch vorhanden sind, aber neuronales Medium mit erforderlichen Ergänzungen hinzugefügt wird (Gesamtdauer beträgt 2 Tage; Abbildung 1B). In diesem Protokoll werden sechs Wells transfiziert: Drei Wells erhalten die reprogrammierende miRNA miR-25 und drei Wells erhalten die Kontroll-miRNA.

  1. Überprüfen Sie, ob die Zellen eine Konfluenz von 90% erreicht haben und zeichnen Sie die Zellen vor der Transfektion auf.
  2. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und fügen Sie 500 μL HBSS (Raumtemperatur) hinzu, um die Zellen zu waschen.
  3. Entfernen Sie HBSS und fügen Sie 400 μL reduziertes Serummedium hinzu, das für Transfektionen verwendet wird. Legen Sie die Platte wieder in einen 37 °C Inkubator.
  4. Bereiten Sie das Transfektionsgemisch vor, indem Sie die Anweisungen des Transfektionsreagenzprotokolls des Herstellers befolgen. Machen Sie zwei Mischungen: Transfektionsreagenzienmischung und miRNA-Mischung (siehe Abbildung 1B zur Veranschaulichung).
    1. Bereiten Sie das Transfektionsreagenzgemisch vor: Für eine 24-Well-Platte sind 49 μL reduziertes Serummedium und 1 μL Transfektionsreagenz für eine Vertiefung (insgesamt 50 μL) erforderlich. Für sechs Vertiefungen werden 294 μL reduziertes Serummedium und 6 μL Transfektionsreagenz kombiniert und gut gemischt, indem vorsichtig auf und ab pipettiert wird.
    2. Vorbereiten der miRNA-Mimikmischung: Für eine 24-Well-Platte ist ein Gesamtvolumen von 50 μL der mimischen Mischung für eine Vertiefung erforderlich. Drei Bohrlöcher erhalten die Kontroll-miRNA und die anderen drei Bohrlöcher werden mit miR-25 behandelt. Für dieses Protokoll wird eine Endkonzentration von 200 nM verwendet.
      1. Für die miR-25-Behandlung (drei Vertiefungen) werden 150 μL reduziertes Serummedium und 3 μL miR-25-Mimics (100 μM Stammlösung) kombiniert und durch sanftes Pipettieren auf und ab gut gemischt. 5 min inkubieren
        Für die Behandlung von Kontrollmimiken (drei Vertiefungen) werden 150 μL reduziertes Serummedium und 3 μL Kontroll-miRNA-Mimics (100 μM Stammlösung) kombiniert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gut gemischt. 5 min inkubieren
        HINWEIS: Das Volumen der miRNA-Nachahmungen hängt vom Verdünnungsfaktor und der erforderlichen Konzentration ab (20-500 nM). miRNA-Inhibitoren (AntagomiRs) oder andere Moleküle einschließlich Plasmide können ebenfalls verwendet werden. Auch Kombinationen von Molekülen können transfiziert werden.
  5. Kombinieren Sie miRNA-Mimikmischung und Transfektionsreagenzmischung. Vorsichtig mischen, indem Sie langsam und gründlich pipettieren, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren (nach Herstellerangaben).
  6. Fügen Sie die obige Transfektionsmischung tropfenweise und langsam auf die Zellen hinzu, nahe der Medienoberfläche in der Vertiefung mit einer 20-μL-Pipette. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig (hin und her, von links nach rechts).
  7. Inkubieren Sie in einem 37 °C Inkubator für 3 h.
  8. Nach 3 h fügen Sie den Vertiefungen (500 μL pro Well) neuronales Medium hinzu, ergänzt mit 4-Hydroxytamoxifen (5 mM Stamm, rekonstituiert mit 2,58 ml Ethanol, 250 nM Endkonzentration), um die Cre-Rekombinase und 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU, 10 mM Stammlösung, rekonstituiert mit 2 ml DMSO, 1 μM Endkonzentration) zu aktivieren, um die Zellproliferation zu verfolgen.
    ACHTUNG: 4-Hydroxytamoxifen und EdU sind als menschliche Karzinogene, Teratogene und Mutagene bekannt. Lesen Sie vor dem Gebrauch das Sicherheitsdatenblatt und tragen Sie Handschuhe, Schutzbrillen und Laborkittel. Rekonstituieren Sie beide Reagenzien gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Inhalieren Sie den Stoff/das Gemisch nicht. Nach Gebrauch fest verschlossen. Abfallstoffe müssen gemäß den nationalen und lokalen Vorschriften entsorgt werden. Waschen Sie Hände und Gesicht nach der Arbeit mit der Substanz.
  9. Inkubieren Sie 2 Tage lang in einem Inkubator mit einer Temperatur von 37 °C (Abbildung 1B).

8. Zellumwandlung

HINWEIS: Die Zellumwandlungsphase hat eine Dauer von ca. 5-6 Tagen (Abbildung 1B), längere Zeiträume sind jedoch möglich.

  1. Überprüfen Sie die Zellen täglich auf eine erfolgreiche Induktion der tdTomatenexpression, einen möglichen Zelltod und / oder eine Kontamination. Die Zelldichte ändert sich nicht (Abbildung 4). Die ersten schwachen roten, fluoreszierend markierten Zellen können 1 Tag nach der 4-Hydroxytamoxifen-Behandlung beobachtet werden. Ein Fluoreszenzmikroskop ist erforderlich, um die Zellen zu überwachen und abzubilden.
    HINWEIS: In dieser Studie wird ein Fluoreszenzmikroskop für die Live-Bildgebung verwendet. Die Bilder werden mit 4x-, 10x- oder 20x-Objektiven aufgenommen.
  2. Entfernen Sie zwei Tage nach der Transfektion das Medium und fügen Sie 500 μL vorerwärmtes neuronales Medium, ergänzt mit 4-Hydroxytamoxifen und EdU, in jede Vertiefung hinzu.
  3. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch ein frisches Medium, bis die Zellen geerntet sind.
  4. Nehmen Sie Live-Bilder auf, um die Anzahl der rot fluoreszierenden (Ascl1-exprimierenden) Zellen und ihre morphologischen Veränderungen zu bewerten und zu bewerten (Abbildung 4 und Abbildung 5A-C).

9. Zellernte: Fixierung zur Immunfluoreszenzmarkierung

HINWEIS: Zellen können für andere nachgelagerte Anwendungen geerntet werden, einschließlich Bulk oder scRNA-Seq, RT-qPCR oder Western Blot.

  1. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 500 μL kaltes HBSS (4 °C) pro Vertiefung hinzu und schwingen Sie die Platte vorsichtig (hin und her, von links nach rechts). Entfernen Sie HBSS.
  2. Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 500 μL 2% Paraformaldehyd (PFA) und inkubieren Sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
  3. Führen Sie eine Immunfluoreszenzmarkierung gemäß den festgelegten Protokollen durch.

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Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt, wie man MG aus P12-Maus-Netzhäuten züchtet und wie man diese Zellen mit miR-25 mit der Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-Reportermaus in Netzhautneuronen umprogrammiert. Diese Methode wurde in früheren Arbeiten verwendet, in denen detailliert über andere geeignete miRNAs (Mimics oder Inhibitoren, als Einzelmoleküle oder in Kombination) berichtet wurde, um MG in RPC umzuprogrammieren, die dann neuronale Zelleigenschaften annehmen27. Diese Methode wurde modifiziert, um Kulturen schneller zu züchten und somit die durch die künstliche Umgebung verursachten zellulären Veränderungen im Laufe der Zeitzu minimieren 24,28,29.

Netzhautdissoziation und Wachstumsphase primärer MG-Kulturen
Das erste MG kann bereits am ersten Tag in vitro mit einem Lichtmikroskop gesichtet werden. MG haben eine röhrenförmige, längliche Form und hellgraue Zellkörper (Abbildung 3A-D, rote Pfeilspitzen). Die meisten von ihnen sind jedoch in diesen frühen Stadien von Zelltrümmern bedeckt. MG aus zwei Netzhäuten einer Maus, die in einem Brunnen einer 12-Well-Platte gezüchtet werden, erreichen innerhalb von 4-5 Tagen eine 90%-95%ige Konfluenz (Abbildung 3E,F). Im Laufe der Zeit werden alle neuronalen Trümmer beseitigt und eine dichte Zellschicht wird vorhanden sein. Zellen sind nicht bereit für die Passage, wenn der Boden des Brunnens nicht vollständig zusammenfließt. Die Passage sollte jedoch nicht später als 6 Tage in vitro erfolgen, da die Glia im Laufe der Zeit ihre Gliamerkmale in Kultur verlieren. Vor der Transfektion oder einer anderen Behandlung müssen die Zellen auf Dichte und Vitalität überprüft werden. Die Transfektion sollte nur an 90%-95% konfluierenden Zellen durchgeführt werden (Abbildung 3G). Für die Immunfluoreszenzmarkierung und konfokale Mikroskopieanalyse müssen Zellen auf beschichteten Deckgläsern ausgesät werden.

Frühe und späte Phase der Zellumwandlungsperiode
Bereits 15 h nach der Transfektion und 4-Hydroxytamoxifen-Behandlung beginnen die ersten Zellen, schwache rote Fluoreszenz zu exprimieren, d.h. tdTomato rot fluoreszierendes Reporterprotein, das unter dem (aktivierten) Ascl1-Promotor angetrieben wird. Ascl1-exprimierende Zellen werden jetzt weiter als Ascl1-Tom+-Zellen bezeichnet. Eine robustere Ascl1-Tom-Expression kann 2 Tage nach der Transfektion mit zunehmender Rotfluoreszenz im Laufe der Zeit beobachtet werden (Abbildung 4). Der Reprogrammierungseffekt wird etwa 2 Tage in Kultur mit vielen Ascl1-Tom+ Zellen pro Feld sichtbar, die in der reprogrammierenden miRNA-Behandlung gefunden wurden: hier für control-miR und miR-25 gezeigt (Abbildung 4B-B''' bzw. Abbildung 4C-C'''). In beiden Behandlungen sind Ascl1-Tom+ Zellen immer noch ziemlich rund und relativ groß, mit einer eher glia/vorfahrenden zellähnlichen Morphologie. Darüber hinaus hat die Induktion des rotfluoreszierenden Reporters keinen Einfluss auf die Zelldichte der Kultur (immer noch 90% -95% Konfluent).

Drei bis fünf Tage nach der Transfektion (Abbildung 4A und Abbildung 5A) wird die Zunahme der Anzahl der Ascl1-Tom+-Zellen in den mit miR-25 behandelten Vertiefungen deutlicher (Abbildung 5B-D), die nach miR-25-Behandlungen im Vergleich zu Kontrollen eine vierfache Zunahme der Anzahl zeigen. Darüber hinaus werden die ersten morphologischen Veränderungen sichtbar. Zu diesen Veränderungen gehören die Verringerung der Zellsomagröße und die Entwicklung von Feinprozessen. Während unter Kontrollbedingungen die überwiegende Mehrheit der Zellen groß und flach ist (Glia- / Vorläufer-ähnlich, Abbildung - 5B-B''), erscheinen viele Zellen mit kleinen Kernen und mehreren kleinen Prozessen, die Netzhautneuronen ähneln, in der miR-25-Behandlung (Abbildung - 5C-C''). Diese neuronalen Zellen machen etwa 70% der gesamten Ascl1-Tom-Population aus (15% in der Kontrollbehandlung; Abbildung 5E). Zellen sind aufgrund der Zellumwandlung weniger dicht (kleinere Zellen benötigen weniger Platz). Interessanterweise scheinen diese neuronalen Zellen sogar winzige Netzwerke zu bilden (Abbildung 5C''). Zu diesem Zeitpunkt können Zellen für die Immunfluoreszenzmarkierung geerntet werden, um die neuronale Identität zu bestätigen.

Bestätigung der neuronalen Identität
Die Zellen werden mit Antikörpern gegen das Mikrotubuli-assoziierte Protein 2 (Map2), einen Marker für neuronenspezifische Zytoskelettproteine 30,31, und gegen die orthodentikle homöobox 2 (Otx2) markiert, um die neuronale Identität 32,33 zu validieren. Beide Marker wurden auch in früheren Reprogrammierungsstudienverwendet 21,27. Otx2 ist ein Transkriptionsfaktor, der in RPCs 34,35,36, reifen bipolaren Zellen 34,35,37,38,39 und Photorezeptoren 35,36,37,38,40 vorkommt . Die nukleare Kennzeichnung von DAPI wird verwendet, um den Kulturen entgegenzuwirken. Die Immunfluoreszenzmarkierung zeigt unter Kontrollbedingungen wenig bis gar keine Map2- oder Otx2-Expression (Abbildung 6A-A''',C). miR-25-behandelte Proben weisen jedoch viele Map2+- und Otx2+-Zellen auf (Abbildung 6B-B'''). Die Quantifizierung konfokaler Bilder zeigt, dass nach der Überexpression von miR-25 etwa 40 neuronale Zellen pro Feld vorhanden sind, verglichen mit fünf neuronalen Zellen pro Feld in Kontrollen (Abbildung 6C, Feldgröße: 630 μm x 630 μm). Die Bilder wurden mit 20-fachem Objektiv aufgenommen. Diese neuronalen Zellen machen etwa 70% der gesamten Ascl1-Tom+-Zellpopulation der miR-25-behandelten Proben aus (Kontrolle ~20%, Abbildung 6D). Alle neuronalen Ascl1-Tom+-Zellen waren Map2+ und Otx2+, was die neuronale Identität bestätigt. Darüber hinaus war die absolute Anzahl der Otx2+- und Map2+-Zellen nach miR-25-Behandlungen höher als bei der control-miRNA-Behandlung (miR-25: 60 Zellen pro Feld; control-miR: 10 Zellen pro Feld; Abbildung 6E).

Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass MG-Kulturen mit miRNAs gezüchtet und umprogrammiert werden können. miR-25-Supplementierung induziert Ascl1-Tom-Expression in primärem MG. Viele MG wandeln sich in RPCs um, die eine neuronale Morphologie annehmen und nach einigen Tagen die neuronalen Marker Map2 und Otx2 exprimieren.

Figure 1
Abbildung 1: Versuchsaufbau und zeitlicher Verlauf einer primären Müller-Gliakultur. (A) Schematische Darstellung der Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl-Maus, einer retinalen Vorläufer-Reportermaus, die zur Verfolgung der Umwandlung von Müller-Glia (MG) in retinale Vorläuferzellen (RPCs) verwendet wird. (B) Zeitlicher Verlauf der Kulturperioden, bestehend aus Wachstumsphase (blau, 0-4/5 Tage in vitro, div), Transfektionsphase (violett, 5/6-7/8 div) und MG-Konversionsphase (gelb, beginnt 7/8 div). Wachstumsphase: Disoziierte Netzhäute (zwei Netzhäute einer Maus) werden in einem Brunnen einer 12-Well-Platte in einem Wachstumsmedium gezüchtet. Um den 6. Tag herum werden die Zellen in eine 24-Well-Platte geleitet, die beschichtete Deckgläser enthält. Transfektionsphase: 5-7 div (1 Tag nach der Passage) Zellen werden mit miRNAs für 2 Tage in Transfektionsmedium transfiziert. Die Cre-Rekombinase wird mit 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) aktiviert. Die Zellproliferation wird mit EdU verfolgt. Die MG-Umstellungsphase beginnt 1 Tag nach der Transfektion. Zellen werden nun im neuronalen Medium bis zur Ernte gezüchtet (6-7 Tage nach Transfektionen, dpTF). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Netzhautdissoziation und Genotypisierung . (A) Augenmuschel mit entfernter Hornhaut, Linse, Iris und Glaskörper. b) isolierte Netzhaut; retinale Pigmentepithelzellen (RPE) werden nach einer gründlichen Wäsche entfernt. (C) 12-Well-Platte mit dissoziierten Netzhäuten (zwei Netzhäute pro Well). (D) Ausschnitt eines Genotypisierungsgel-Bildbeispiels. Genotypisierung ist erforderlich, um die Mäuse mit Ascl1-gesteuerter Cre-Rekombinase-Expression zu identifizieren und wird zur Verfolgung der Zellkonvertierung verwendet. Maßstabsstäbe: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Primäre Müllerglia während der Wachstumsphase. (A) Zeitlicher Verlauf der Kulturperioden während der Wachstumsphase (0-4/5 Tage in vitro (div)) blau hervorgehoben. (B-G) Livebilder (Phase) der Müller-Glia (MG) während der Wachstumsphase nach 1 div (B), 2 div nach dem Mediumswechsel (C), 3 div (D), 4 div vor der Passage (E,F) und 5 div, 1 Tag nach der Passage und vor der Transfektion (G). MG-Zellkörper sind durch rote Pfeilspitzen gekennzeichnet. Nach 3 div sind die Kulturen zu 60% -80% konfluent (D), nach 4-5 div sind die Kulturen zu 90% -100% konfluent und bereit für die Passage (E-F). Nach der Passage auf Deckgläsern müssen Zellkulturen für die anschließende Transfektion zu 80% -90% konfluent sein (G). Maßstabsstäbe: 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Frühe Stadien in der Müller-Glia-Umstellungsphase. (A) Zeitverlauf der Kulturperioden während der Umstellungsphase gelb hervorgehoben (beginnt 7/8 Tage in vitro (div)). Der in dieser Abbildung dargestellte Zeitpunkt der Analyse wird durch den roten Stern angezeigt: 7 div, 2 Tage nach der Transfektion (dpTF). (B-C''') Live-Bilder von Müller-Glia-Kulturen (MG) in Phase und roter Fluoreszenz, kombinierter oder einzelner roter Fluoreszenz. Die rote Fluoreszenz visualisiert Ascl1-exprimierenden MG (tdTomato+, abgekürzt Ascl1-Tom), 2 Tage nach der Transfektion mit entweder Kontroll-miRNA-Mimics (control-miR, B-B''') oder miR-25-Mimics (C-C'''). Die Bereiche in B/B' und C/C' sind in höherer Vergrößerung in B''/B''', C''/C'''' dargestellt. Maßstabsstäbe 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Endstufen in der Müller-Glia-Umstellungsphase. (A) Zeitverlauf der Kulturperioden während der Umstellungsphase gelb hervorgehoben (beginnt 7/8 Tage in vitro (div)). Der in dieser Abbildung dargestellte Zeitpunkt der Analyse wird durch den roten Stern angezeigt: 10 div, 5 Tage nach der Transfektion (dpTF). (B-C'') Live-Bilder von Müller-Glia-Kulturen (MG) in Phase und roter Fluoreszenz, kombinierter oder einzelner roter Fluoreszenz. Die rote Fluoreszenz visualisiert Ascl1-exprimierenden MG (tdTomato+, abgekürzt Ascl1-Tom), 5 Tage nach der Transfektion (pTF) mit entweder Kontroll-miRNA-Mimics (control-miR, B-B'') oder miR-25-Mimics (C-C''). Einsätze in B'/C' werden in höherer Vergrößerung in B''/C''' angezeigt. (D) Die absolute Anzahl der Ascl1-Tomato+-Zellen pro Feld (10x; 1440 μm x 1080 μm) nach Kontroll-miRNA- oder miR-25-Behandlung, 2- und 5-Tage nach Transfektion (dpTF; n =1, fünf Bilder pro Well werden gezählt; Mittelwert ± S.D.). (E) Prozentsatz der neuronal-ähnlichen Ascl1-Tomato+-Zellen der gesamten Ascl1-Tomato+-Zellen pro Feld (10x; 1440 μm x 1080 μm) nach Kontroll-miRNA- oder miR-25-Behandlung, 5 Tage nach der Transfektion (5dpTF, n = 1, Mittelwert ± S.D.). Maßstabsstäbe: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Bestätigung der neuronalen Identität reprogrammierter Zellen. (A-A'''; B-B''') Immunfluoreszenzmarkierung von primären Maus-Müller-Glia-Kulturen (MG) 5 Tage nach Transfektion, behandelt mit Kontroll-miRNA-Mimics (control-miR, A-A''') oder miR-25-Mimics (B-B'''). Die Zellen wurden mit 2% Paraformaldehyd (PFA) fixiert und mit Antikörpern gegen RFP inkubiert, um tdTomato, Map2 und Otx2 zu markieren, um Neuronen zu markieren. Die DAPI-Kernmarkierung (blau) wurde verwendet, um alle Zellkerne zu färben. (C-E) Quantifizierung (n = 1; fünf Bilder pro Deckglas werden gezählt; Mittelwert ± S.D.) der absoluten Anzahl von Ascl1-Tom+Otx2+ Map2+ Zellen pro Feld (C), Prozentsatz der Ascl1-Tom+Otx2+Map2+ Zellen der gesamten Ascl1-Tom+ Zellen (D) und der absoluten Anzahl der Otx2+Map2+ Zellen pro Feld (E). Die Ergebnisse zeigen eine höhere Anzahl von Neuronen in der miR-25-Behandlung im Vergleich zu Kontrollen. Feldgröße: 630 μm x 630 μm. Maßstabsstäbe: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Zelltod und bakterielle Kontamination. (A-A'') Live-Bilder von Müller Glia (MG) Kulturen 3 div mit Bakterien kontaminiert. Der Einschub 1 in A wird in höherer Vergrößerung in A' angezeigt und zeigt atrophische, tote Glia. Der Einschub 2 in A wird in A'' mit lebendiger Glia-Glia angezeigt. Maßstabsstäbe:100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie MG aus dissoziierten Mausnetzhäuten für Reprogrammierungsstudien mit miRNAs gezüchtet werden kann. Wie in einer Vielzahl früherer Studien gezeigt und bestätigt wurde, ist die überwiegende Mehrheit (80% -90%) der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG20,23,24. Diese Methode ist eine sehr robuste und zuverlässige Technik und die Ergebnisse können leicht reproduziert werden, wenn das Protokoll korrekt befolgtwird 21,27. Das erfolgreiche Wachstum und die Reprogrammierungseffizienz der Kultur hängen jedoch von einer Vielzahl von Faktoren ab.

Erstens spielt das Alter der Maus eine wichtige Rolle für ein erfolgreiches Zellwachstum. Wenn MG-Kulturen aus Wildtyp-Mäusen oder transgenen Mäusen gezüchtet werden, die Wildtypen wie Reportermäusen ähneln, ist das neueste Alter, um konfluente MG-Monoschichten zu züchten, P12. Bei P12 werden alle retinalen Neuronen und das MG unterschieden, und es sind keine RPCs mehr in der Netzhaut vorhanden. MG exprimieren reife MG-Marker wie Glutaminsynthetase oder Glutamataspartattransporter (GLAST)20,23,41,42. Kultiviertes P12 MG kann immer noch wieder in den Zellzyklus eintreten, wenn es EGF ausgesetzt wird, aber die Anzahl der Zyklen ist begrenzt, wenn auch ausreichend, um in vitro konfluente Zellschichten zu bilden. Dennoch kann es vorkommen, dass selbst P12 MG nicht gut wachsen, weil EGF oder Komponenten im Medium abgebaut werden können. Eine unvollständige Dissoziation (Chunks) kann auch zu einem geringeren oder verzögerten MG-Wachstum führen. Eine Hauptursache für eine unvollständige Dissoziation ist die Inaktivierung der DNase, die ich für die retinale Dissoziation durch harte Handhabung des Enzyms (schnelles Pipettieren, Vortexen usw.) verwendet habe. Selbst wenn die Zellen bis zur Passage gut wachsen, können Zellen nach der Passage weniger konfluent sein. Gründe dafür können ein harter Umgang während des Passageprozesses sein, der zu einem erhöhten Zelltod führt oder weil die Zellen zu spärlich ausgesät wurden. Da die Glia nicht viel wachsen, sollten Zellen im gleichen Verhältnis wie gezüchtet und nicht verdünnt werden (im Gegensatz zu Passaging-Verfahren von immortalisierten Zelllinien). Da MG-Kulturen vom Zentrum bis zur Peripherie eines Brunnens wachsen, werden im Zentrum immer höhere Zelldichten zu finden sein. Es ist daher unerlässlich, die Ränder jedes Brunnens vor der Passage zu überprüfen, um sicherzustellen, dass der gesamte Brunnen von Zellen bedeckt ist. Zellkonzentrationsmessungen sollten durchgeführt werden, um die Verarbeitung ausreichender Zellmengen sicherzustellen.

Darüber hinaus enthalten Primärkulturen, die von Mäusen bei P6 oder jünger gewonnen werden, kein MG, da MG zu diesem Zeitpunkt kurz vor der Reifung steht. Dies wurde mittels Einzelzell-RNA-seq-Analyse43 gezeigt. Die Immunfluoreszenzmarkierung mit reifen MG-Markern in diesem Alter wird dies ebenfalls bestätigen. Der Anteil der RPCs ist jedoch bei P6 beträchtlich. Die Ergebnisse sollten daher sorgfältig interpretiert werden. Darüber hinaus sind Marker wie die intermediären Filamentmarker Vimentin und Nestin nicht geeignet, primäres MG zu identifizieren, da diese Marker auch in den Astrozyten 44,45,46, Mikroglia 47,48, Endothelzellen und Perizyten 49,50,51,52 exprimiert werden. und sind nicht MG-spezifisch. GFAP, ausgedrückt in retinalen Astrozyten, aber nicht in MG von unbeschädigten Netzhäuten, ist kein guter Marker für kultiviertes MG. Obwohl es in dissoziiertem MG aufgrund der mechanischen Beschädigung während der Dissoziation hochreguliert ist, wird es in Kultur28 nach 3 Tagen herunterreguliert.

Da MG viele RPC-Marker teilen, ist das sicherste Verfahren, um eine robuste MG-Kultur zu gewährleisten, die Verwendung von Mäusen bei P12 oder älteren Mäusen. Obwohl dieses Protokoll Kulturen beschreibt, die aus P12 Maus MG gewonnen werden, kann erwachsene Maus MG kultiviert und neu programmiertwerden 27. Allerdings muss mehr Gewebe pro Well plattiert werden (vier bis sechs Netzhäute). Dies liegt daran, dass sich erwachsene Glia nicht viel teilen, selbst wenn sie EGF und 10% Serum ausgesetzt sind. Reduzierte Zellkontakte führen zum Zelltod und zur Zelldegeneration (gestreckte Zellen, vergrößerte Zellen). Erwachsene Glia sind ein großartiges Werkzeug für Co-Kultur-Paradigmen18 und die Zelldichte spielt in diesen Anwendungen möglicherweise keine so große Rolle. Für nachgelagerte Anwendungen wie Transfektion oder Transduktion sind jedoch konfluente Zellschichten eine Voraussetzung.

Neben Wachstumsstörungen kann auch der Zelltod auftreten. Wenn der Zelltod ohne offensichtliche Anzeichen auftritt, sollte eine Mykoplasmenkontamination in Betracht gezogen werden (Mykoplasmengröße 0,1-0,3 μm) und ein Mykoplasmen-Detektionskit sollte verwendet werden. Wenn Sie jede Probe getrennt halten (nicht Proben sammeln), kann dies auch das Risiko einer Kreuzkontamination verringern. Größere Bakterien können jedoch auch vom Tier übernommen werden und eine Kontamination verursachen, obwohl alle Arbeiten in einer sauberen, sterilen Umgebung durchgeführt werden. Vor dem Sezieren des Auges wird empfohlen, den Augapfel kurz in 70% Ethanol zu tauchen und eine gründliche Wäsche in einer zusätzlichen 10 cm Petrischale durchzuführen. Um eine erfolgreiche Kultur zu erreichen, ist es unerlässlich, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten, da eine Kontamination schnell auftreten kann. Sobald Bakterien, Hefe oder Schimmelpilze / Pilze in einer Platte gefunden werden, auch wenn nicht alle Brunnen betroffen sind, geht die Kultur verloren. Kontaminationen führen zum Zelltod (Ergänzende Abbildung 1) und betreffen die Zellen, was zu nicht repräsentativen Daten führt.

Der Zelltod kann auch durch Reagenzien verursacht werden, die für nachgelagerte Anwendungen benötigt werden, wie Poly-O (oder Poly-D-Lysin), das zum Beschichten von Deckgläsern verwendet wird. Diese Substanzen sind giftig und gründliche Wäschen sind erforderlich, bevor Laminin verwendet wird. Deckgläser sollten am Boden des Brunnens kleben und nicht in einem Brunnen schwimmen. Luftblasen müssen vermieden werden. Darüber hinaus ist eine vollständige Beschichtung mit Laminin entscheidend, um die Zellhaftung auf dem Deckglas zu gewährleisten. Ein Mangel an Laminin führt auch zu einer geringeren Zelldichte und/oder zum Zelltod.

Zur Identifizierung echter umprogrammierter Gliazellen sollten Reportermäuse und Zellproliferationsmarker, die eine Zellverfolgung ermöglichen, wie EdU oder BrdU, verwendet werden. Da ganze Netzhäute plattiert sind, sind neuronale Überlebende in allen Kulturen vorhanden. Sie werden jedoch in den meisten Fällen nach der Passage fast vollständig entfernt. Dennoch sollte eine EdU- (oder BrdU-) Kennzeichnung durchgeführt werden, um zu validieren, dass Neuronen von proliferierenden MG / RPCs stammen und keine neuronalen Überlebenden (post-mitotisch) sind. Die kleine Anzahl von Neuronen, die in den hier verwendeten Kontrollen gefunden werden, sind neuronale Überlebende.

Interessanterweise sind auch einige Ascl1-Tom + -Zellen in der Kontrollbehandlung vorhanden, wobei die Anzahl im Laufe der Zeit leicht zunimmt. Diese Zellen könnten einige ziemlich unreife MG-Express-Ascl1 sein, wenn sie isoliert und kultiviert werden. Der Anteil dieser Ascl1-Tom+-Zellpopulation ist jedoch gering. Darüber hinaus exprimieren die meisten dieser Ascl1-Tom+-Zellen, die in der Kontrollbehandlung gefunden werden, Otx2 und/oder Map2 nicht und behalten eine eher flache Zellform. Unter Kontrollbedingungen scheint keine neuronale Differenzierung stattzufinden. Sehr empfindliche neuronale Zellen, die Netzwerke zu bilden scheinen, werden nur nach einer miR-25-Behandlung gefunden.

Das hier beschriebene Protokoll wurde in früheren Studien verwendet, um miRNAs für die MG-Reprogrammierung21,27 zu testen, und wurde in den letzten Jahren in Bezug auf die Well-Plates zum Wachstum der Glia leicht modifiziert. Sie werden jetzt in 12-Well-Platten anstelle von 6-Well-Platten gezüchtet. Konfluente Monoschichten können in 12-Well-Platten nach 4/5 Tagen (gegenüber 6/8 Tagen mit 6-Well-Platten) erhalten werden, und daher wird die Gesamtkulturperiode, die zu Zellveränderungen / -degeneration führt, reduziert. Das Zeitfenster für die Transfektion ist ebenfalls verlängert. Reguläre Transfektionsprotokolle haben eine Transfektionsdauer von 3 h, nach der ein vollständiger Mediumswechsel durchgeführt werden muss, um das Überleben der Zellen zu sichern. Nach diesem Mediumswechsel werden alle Moleküle entfernt. Im aktuellen Protokoll wurde das Zeitfenster verlängert und eine längere Exposition gegenüber den miRNAs ermöglicht, indem 50% neuronales Medium (ergänzt um die Faktoren, die für die Cre-Induktion und das Zellproliferations-Tracking erforderlich sind) in das Transfektionsreagenzmedium gegeben wurden. Die Zellen waren gesund und mit dieser Modifikation traten keine Probleme auf. Es scheint, dass die Transfektionsergebnisse mit der verlängerten Transfektionszeit besser sind, aber es sind mehr Daten erforderlich, um diese Beobachtung zu bestätigen.

Darüber hinaus werden hier alle Schritte beschrieben, die für die Immunfluoreszenzmarkierung zur Durchführung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie erforderlich sind. Daher muss der MG auf Glasabdeckungen durchgestrichen werden. Da die Deckgläser kleiner sind als die Fläche einer 24-Well-Platte, passt nur etwa ein Drittel der Zellen, die eine volle Vertiefung einer 24-Well-Platte abdecken würden, auf das beschichtete Deckglas. Für andere Anwendungen wie qPCR, RNA-Seq oder Western Blots werden Zellen im Verhältnis 1:1 durchgelassen, behandelt und zum gewünschten Zeitpunkt geerntet.

Wie bereits erwähnt, kann dieses Kultursystem auch für andere Anwendungen verwendet werden, z. B. zur Untersuchung des Gliaverhaltens, einschließlich neuroprotektiver Mechanismen, Gliose und / oder zur Profilierung von mRNA, miRNA oder Proteinen kultivierter Glia, ähnlich den Studien, die leicht unterschiedliche Kulturparadigmen oder Spezies 11,28,29,54 verwendeten. . Diese Anwendungen würden weder neuronales Medium erfordern, um das neuronale Überleben nach der Reprogrammierung zu sichern, noch die Zugabe von EdU, um die Zellproliferation zu visualisieren. Stattdessen sollte ein serumarmes Medium ohne neuronale Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden.

Obwohl diese Methode robust und zuverlässig ist, hat sie, ähnlich wie alle Primärkultursysteme, Einschränkungen; Dies sind die begrenzte Lebensdauer der Zellen, die fortschreitende Zelldegeneration im Laufe der Zeit28 und die Tatsache, dass es sich um ein 2-dimensionales, künstliches Kultursystem handelt, das den physiologischen Kontext sowohl in Bezug auf andere retinale Zelltypen als auch auf die extrazelluläre Matrix nicht nachahmen kann. Daher sollten nach der Identifizierung der Top-Kandidaten und ihrer effizientesten Konzentrationen in MG-Primärkulturen retinale Explantationskulturen, ein 3-dimensionales Kultursystem, das dem Netzhautgewebe ähnelt, durchgeführt werden. Explantationskulturen haben auch begrenzte Kulturperioden und Zellen in Explantaten degenerieren ebenfalls im Laufe der Zeit. Sie ermöglichen jedoch die Untersuchung von MG in ihrer natürlichen 3-dimensionalen Umgebung und können in verschiedenen Altersstufen durchgeführt werden, die das Entwicklungsstadium des Tieres widerspiegeln 23,32,55,56.

Zusammengenommen berichtet diese Studie über MG-Kulturen, die verwendet werden, um das Potenzial der RPC miRNA miR-25 zu überwachen, MG in neuronale Zellen umzuprogrammieren, validiert durch Immunfluoreszenzmarkierung. Dieses Protokoll wurde in den vorherigen Arbeiten 21,24,27 verwendet und ist eine aktuelle In-vitro-Methode zur Untersuchung des regenerativen Potenzials von MG. Insgesamt sind MG-Primärkulturen eine robuste Technik und ermöglichen reproduzierbare Ergebnisse 20,21. Obwohl die miRNA-Überexpression für die MG-Reprogrammierung hier ausschließlich beschrieben wird, können andere Faktoren wie kleine Moleküle, DNA (entweder Plasmide oder in virale Vektoren gepackt), Antikörper für die Proteinhemmung32 oder spezifische Verbindungen in MG-Primärkulturen verwendet / getestet werden. Es gibt auch ein breites Spektrum von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich miRNA-Profiling 24, scRNA-seq27, RT-qPCR 20,21 oder Western Blots 20. Darüber hinaus ermöglichen MG-Primärkulturen die tägliche Beobachtung und Überwachung der Zellen. Dies kann ein wesentlicher Vorteil für die Bestimmung von Zeitpunkten sein, z. B. für den Beginn, die Dauer und/oder das Ende einer bestimmten Reaktion oder Zellantwort. Migrations- oder proliferatives Verhalten sowie verletzungs-/zellschadensbezogene Paradigmen (z. B. globale miRNA-Deletion in MG-Kulturen)32 können in MG-Primärkulturen untersucht und analysiert werden, um zugrunde liegende Mechanismen und Signalwege zu identifizieren. Daher sind MG-Kulturen ein sehr leistungsfähiges Werkzeug, um MG auf molekularer und zellulärer Ebene vor der Implementierung in In-vivo-Systemen zu untersuchen.

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Disclosures

Ein Patent, das einige der Ergebnisse dieses Berichts enthält, wurde von der University of Washington bei den Erfindern Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl und Thomas A. Reh angemeldet. Das Patent trägt den Titel "Methoden und Zusammensetzungen zur Stimulierung der Netzhautregeneration.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Ann Beaton und allen Labormitgliedern für ihren Beitrag zum Manuskript. Besonderer Dank geht an Dr. Tom Reh, Dr. Julia Pollak und Dr. Russ Taylor für die Einführung von MG-Primärkulturen als Screening-Tool für S.G.W. während der Postdoc-Ausbildung an der University of Washington in Seattle. Die Studie wurde durch den Empire Innovation Program (EIP) Grant an S.G.W. und Start-up-Mittel von SUNY Optometry an S.G.W. sowie den R01EY032532 Award des National Eye Institute (NEI) an S.G.W. finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J Jax laboratories #012882 Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J Jax laboratories #007914 Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer Sigma-Aldrich H7904-5MG reconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution VWR 100504-782 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-546-152 dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 705-606-147 dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems Fisher Scientific AF1979 dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibody Sigma-Aldrich M9942-200UL dilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody Antibodies-Online ABIN334653 dilution 1:500
Ascorbic Acid STEMCELL Technologies 72132 reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 Supplement Fisher Scientific 17-504-044 frozen aliquots
Brain Phys Neuronal Medium STEMCELL Technologies 05790 used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
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231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Fisher Scientific C10340 reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMP STEMCELL Technologies 73886 reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific MT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific MT35010CV frozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement Fisher Scientific 51-985-034 store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Fisher Scientific 12-605-028 used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSS Fisher Scientific 14-025-134 store at 4 °C
Laminin mouse protein, natural Fisher Scientific 23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
L-Glutamine Fisher Scientific 25-030-081 frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control Horizon CN-001000-01-50 reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic Horizon C-310564-05-0050 reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 Supplement Fisher Scientific 17-502-048 frozen aliquots
Neurobasal Medium Fisher Scientific 21-103-049 used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation System Worthington Biochemical LK003153 reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122 frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific 20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich P4538-50MG reconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF Protein R&D Systems 248-BDB-050/CF reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF Protein Fisher Scientific 2028EG200 reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF Protein Fisher Scientific 512GF010 reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 712-296-150 dilution 1:1,000
Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) Fisher Scientific L3000015 store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) Eppendorf 2231300008
Disposable Transfer Pipets Fisher Scientific 13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 Fisher Scientific 08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 Fisher Scientific 08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam Gloves Fisher Scientific 19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) Fisher Scientific 22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm Fisher Scientific 09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinet Thermo Scientific 1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 Keyence 9011800000
Binocular Zoom Stereo Microscope Vision Scientific VS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) VWR 25384-088
Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium Fine Science Tools 11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11255-20
Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium Fine Science Tools 11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 R Eppendorf 2231000508
Fine Scissors-sharp Fine Science Tools 14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cm World Precision Instruments 14124
Metal bead bath Lab Armor 74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm VWR 82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) Living Systems Instrumentation DD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5 World Precision Instruments 501979
Water Jacketed CO2 Incubator VWR 10810-744

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Entwicklungsbiologie Heft 181
Primäre Zellkulturen zur Untersuchung des Regenerationspotenzials von murinen Müller-Glia nach MicroRNA-Behandlung
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Kang, S., Wohl, S. G. Primary Cell… More

Kang, S., Wohl, S. G. Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine Müller Glia after MicroRNA Treatment. J. Vis. Exp. (181), e63651, doi:10.3791/63651 (2022).

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