Whole-Brain Single-Cell Imaging en Analyse van Intacte Neonatale Muizenhersenen Met behulp van MRI, Tissue Clearing en Light-Sheet Microscopie
Summary
Dit protocol beschrijft methoden voor het uitvoeren van magnetische resonantie beeldvorming, clearing en immunolabeling van intacte muizenhersenen met behulp van iDISCO +, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van beeldvorming met behulp van light-sheet microscopie en downstream analyses met behulp van NuMorph.
Abstract
Weefselopruiming gevolgd door light-sheet microscopie (LSFM) maakt beeldvorming met cellulaire resolutie van intacte hersenstructuur mogelijk, waardoor kwantitatieve analyse van structurele veranderingen veroorzaakt door genetische of omgevingsverstoringen mogelijk is. Beeldvorming van de hele hersenen resulteert in een nauwkeurigere kwantificering van cellen en de studie van regiospecifieke verschillen die kunnen worden gemist met veelgebruikte microscopie van fysiek gesneden weefsel. Het gebruik van light-sheet microscopie om gewiste hersenen in beeld te brengen, verhoogt de acquisitiesnelheid aanzienlijk in vergelijking met confocale microscopie. Hoewel deze beelden zeer grote hoeveelheden structurele hersengegevens produceren, zijn de meeste computationele hulpmiddelen die functiekwantificering uitvoeren in afbeeldingen van gewist weefsel beperkt tot het tellen van schaarse celpopulaties, in plaats van alle kernen.
Hier demonstreren we NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), een groep analysetools, om alle kernen en nucleaire markers te kwantificeren binnen geannoteerde gebieden van een postnatale dag 4 (P4) muizenhersen na clearing en beeldvorming op een light-sheet microscoop. We beschrijven magnetische resonantie beeldvorming (MRI) om het hersenvolume te meten voorafgaand aan krimp veroorzaakt door uitdrogingsstappen van weefsel, weefsel opruimen met behulp van de iDISCO + -methode, inclusief immunolabeling, gevolgd door light-sheet microscopie met behulp van een commercieel beschikbaar platform om muizenhersenen met cellulaire resolutie in beeld te brengen. Vervolgens demonstreren we deze pijplijn voor beeldanalyse met Behulp van NuMorph, dat wordt gebruikt om intensiteitsverschillen te corrigeren, beeldtegels te naaien, meerdere kanalen uit te lijnen, kernen te tellen en hersengebieden te annoteren door registratie op openbaar beschikbare atlassen.
We hebben deze aanpak ontworpen met behulp van openbaar beschikbare protocollen en software, waardoor elke onderzoeker met de nodige microscoop en computationele middelen deze technieken kan uitvoeren. Deze weefselopruimings-, beeldvormings- en computationele hulpmiddelen maken het mogelijk om de driedimensionale (3D) organisatie van celtypen in de cortex te meten en kwantificeren en zouden op grote schaal toepasbaar moeten zijn op elk wild-type / knock-out muisstudieontwerp.
Introduction
Beeldvorming van de hele hersenen met eencellige resolutie is een belangrijke uitdaging in de neurowetenschappen. Hersenbeelden met cellulaire resolutie maken gedetailleerde analyse en het in kaart brengen op systeemniveau van hersencircuits mogelijk en hoe die circuits worden verstoord door genetische of omgevingsrisicofactoren voor neuropsychiatrische aandoeningen, cellulair gedrag bij het ontwikkelen van embryo’s, evenals neurale circuits in de volwassen hersenen 1,2,3. Er zijn meerdere histologische methoden die beelden met hoge resolutie van het gereconstrueerde 3D-brein mogelijk maken; deze technieken vereisen echter dure, gespecialiseerde apparatuur, zijn mogelijk niet compatibel met immunolabeling en de tweedimensionale (2D) aard van sommige methoden kan leiden tot weefselbeschadiging en afschuiving tijdens sectie 4,5.
Recente ontwikkelingen hebben een alternatieve benadering geboden voor het in beeld brengen van hele hersenen waarvoor geen weefselsectie nodig is; ze omvatten het gebruik van weefselzuivering om hersenen transparant te maken. Transparantie wordt bereikt in de meeste weefselzuiveringsmethoden door zowel lipiden te verwijderen, omdat ze een belangrijke bron van lichtverstrooiing zijn, als door de brekingsindex (RI) van het object af te stemmen op de RI van de monsterdompelingsoplossing tijdens beeldvorming. Licht kan dan de grens tussen materialen passeren zonder 6,7,8,9 te worden verstrooid.
Weefselzuiveringsmethoden, zoals iDISCO+, worden vaak gecombineerd met snelle 3D-beeldvorming met behulp van single-photon excitatiemicroscopie, zoals LSFM 6,7,10. In transparante weefsels gelabeld met een fluorofoor, licht-sheet fluorescentie microscopie beelden secties door excitatie met een dun lichtvlak11. Het belangrijkste voordeel van LSFM is dat een enkele optische sectie tegelijkertijd wordt verlicht, waarbij alle fluorescentie van de moleculen in die sectie wordt geëxciteerd, wat fotobleaching minimaliseert. Bovendien maakt het in beeld brengen van een volledig optisch segment cameragebaseerde detectie van dat opgewonden segment mogelijk, waardoor de snelheid toeneemt ten opzichte van puntscanning12. LSFM produceert niet-destructief goed geregistreerde optische secties die geschikt zijn voor 3D-reconstructie.
Hoewel de iDISCO + -methode goedkope weefselzuivering binnen ~ 3 weken mogelijk maakt, kunnen uitdrogingsstappen binnen het protocol leiden tot weefselkrimp en mogelijke verandering van de morfologie van het monster, waardoor volumetrische metingen worden beïnvloed 6,10. Het toevoegen van een secundaire beeldvormingsmethode, zoals MRI, die voorafgaand aan de weefselopruimingsprocedure moet worden gebruikt, kan de mate van door weefselzuivering geïnduceerde krimp over het monster meten. Tijdens de dehydratiestappen kunnen verschillen in mechanische eigenschappen tussen grijze en witte stof leiden tot niet-uniforme hersenmaterievervormingen, wat resulteert in ongelijksoortige weefselzuivering-geïnduceerde volumevervormingen tussen wildtype en mutante monsters en kan interpretaties van volumetrische verschillen in deze monsters verstoren10,13 . MRI wordt uitgevoerd door het dier eerst te perfuseren met een contrastmiddel (bijv. gadolinium), gevolgd door het geëxtraheerde weefsel van belang in een onderdompelingsoplossing (bijv. fomblin) te incuberen voordat beeldvormingplaatsvindt 14. MRI is compatibel met het opruimen van weefsel en het uitvoeren van LSFM op hetzelfde monster.
LSFM wordt vaak gebruikt om grootschalige microscopiebeelden te maken voor kwalitatieve visualisatie van het hersenweefsel van belang in plaats van kwantitatieve evaluatie van de hersenstructuur (figuur 1). Zonder kwantitatieve evaluatie is het moeilijk om structurele verschillen aan te tonen die het gevolg zijn van genetische of milieubeledigingen. Naarmate weefselzuiverings- en beeldvormingstechnologieën verbeteren, samen met lagere kosten van opslag en rekenkracht, wordt het kwantificeren van celtypelokalisaties in het weefsel van belang toegankelijker, waardoor meer onderzoekers deze gegevens in hun studies kunnen opnemen.
Met meer dan 100 miljoen cellen in het muizenbrein15 en beeldvormingssessies voor de hele hersenen die terabytes aan gegevens kunnen genereren, is er een toegenomen vraag naar geavanceerde beeldanalysetools die nauwkeurige kwantificering van functies in de afbeeldingen, zoals cellen, mogelijk maken. Er bestaan een groot aantal segmentatiemethoden voor weefselgeklaarde afbeeldingen die drempels toepassen voor nucleaire kleuringsintensiteit en filterobjecten met vooraf gedefinieerde vormen, maten of dichtheden 10,16,17,18. Onnauwkeurige interpretaties van resultaten kunnen echter het gevolg zijn van variaties in parameters zoals celgrootte, beeldcontrast en labelintensiteit. Dit artikel beschrijft ons gevestigde protocol om celkernen in het muizenbrein te kwantificeren. Eerst beschrijven we stappen voor weefselverzameling van de P4-muizenhersenen, gevolgd door een weefselzuiverings- en immunolabelingprotocol dat is geoptimaliseerd met de openbaar beschikbare iDISCO + -methode10. Ten tweede beschrijven we beeldacquisitie met behulp van MRI en lichtbladmicroscopie, inclusief de parameters die worden gebruikt voor het vastleggen van beelden. Ten slotte beschrijven en demonstreren we NuMorph19, een reeks beeldanalysetools die onze groep heeft ontwikkeld en die celtypespecifieke kwantificering mogelijk maakt na weefselzuivering, immunolabeling met nucleaire markers en light-sheet beeldvorming van geannoteerde regio’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
Weefselopruimingsmethoden zijn nuttige technieken voor het meten van 3D cellulaire organisatie van de hersenen. Er zijn een groot aantal weefselzuiveringsmethoden beschreven in de literatuur, elk met zijn voordelen en beperkingen 6,7,8,9. De opties voor computationele hulpmiddelen om de celtypen in de weefsel-gewiste beelden te analyseren zijn relatief beperkt. Andere beschikbare hulpmiddelen z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NIH (R01MH121433, R01MH118349 en R01MH120125 voor JLS en R01NS110791 voor GW) en de Foundation of Hope. We bedanken Pablo Ariel van het Microscopy Services Laboratory voor zijn hulp bij het afbeelden van monsters. Het Microscopy Services Laboratory in de afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde wordt gedeeltelijk ondersteund door Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 aan het Lineberger Comprehensive Cancer Center van de University of North Carolina (UNC). De Neuroscience Microscopy Core wordt ondersteund door subsidie P30 NS045892. Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd gedeeltelijk ondersteund door de North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.
Materials
| Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
| EVO 860 4TB external SSD | |||
| Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
| gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
| gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
| GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
| Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
| ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
| ITK Snap | segmentation software | ||
| Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
| MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
| Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
| Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
| Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
| Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
| Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
| Antibody | Working concentration | ||
| Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
| Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
| Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
| Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
| To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |
References
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
- Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
- Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
- Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
- Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
- Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
- Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
- Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
- Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease – Alzheimer’s anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
- Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
- Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
- Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
- . iDISCO method Available from: https://idisco.info/ (2022)
- Ariel, P. UltraMicroscope II – A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).
- . Anaconda Distribution – Anaconda documentation Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022)
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
- Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
- Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
- Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
- Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
- Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
- Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
- Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
- Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
- Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
- Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).
