הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטות לביצוע הדמיית תהודה מגנטית, ניקוי ותיוג חיסוני של מוחות עכברים שלמים באמצעות iDISCO+, ולאחר מכן תיאור מפורט של הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה של יריעות אור, וניתוחים במורד הזרם באמצעות NuMorph.
Abstract
ניקוי רקמות ואחריו מיקרוסקופיה של יריעות אור (LSFM) מאפשרים הדמיה ברזולוציה תאית של מבנה מוח שלם, ומאפשרים ניתוח כמותי של שינויים מבניים הנגרמים על ידי הפרעות גנטיות או סביבתיות. הדמיה של מוח שלם מביאה לכימות מדויק יותר של תאים ולחקר הבדלים ספציפיים לאזור שעלולים להתפספס במיקרוסקופיה נפוצה של רקמות שנחתכו פיזית. שימוש במיקרוסקופיה של יריעות אור כדי לצלם מוחות מנוקים מגביר מאוד את מהירות הרכישה בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית. אף על פי שתמונות אלה מייצרות כמויות גדולות מאוד של נתונים מבניים על המוח, רוב הכלים החישוביים המבצעים כימות תכונות בתמונות של רקמות מנוקות מוגבלים לספירת אוכלוסיות תאים דלילות, ולא לכל הגרעינים.
כאן אנו מדגימים את NuMorph (מורפומטריה מבוססת גרעין), קבוצה של כלי ניתוח, כדי לכמת את כל הגרעינים והסמנים הגרעיניים באזורים מבוארים במוח עכבר ביום 4 (P4) לאחר הלידה לאחר ניקוי והדמיה במיקרוסקופ של יריעת אור. אנו מתארים דימות תהודה מגנטית (MRI) למדידת נפח המוח לפני התכווצות הנגרמת על ידי שלבי התייבשות של ניקוי רקמות, ניקוי רקמות בשיטת iDISCO+, כולל תיוג חיסוני, ולאחר מכן מיקרוסקופיה של יריעות אור באמצעות פלטפורמה זמינה מסחרית לצילום מוחות עכברים ברזולוציה תאית. לאחר מכן אנו מדגימים את צינור ניתוח התמונות הזה באמצעות NuMorph, המשמש לתיקון הבדלי עוצמה, לתפירת אריחי תמונה, יישור ערוצים מרובים, ספירת גרעינים וביאור אזורי מוח באמצעות רישום לאטלסים הזמינים לציבור.
עיצבנו גישה זו תוך שימוש בפרוטוקולים ובתוכנות הזמינים לציבור, ומאפשרים לכל חוקר בעל המיקרוסקופ והמשאבים החישוביים הדרושים לבצע טכניקות אלה. כלים אלה של ניקוי רקמות, הדמיה וחישוב מאפשרים מדידה וכימות של הארגון התלת-ממדי (3D) של סוגי תאים בקליפת המוח, והם אמורים להיות ישימים באופן נרחב לכל תכנון מחקר של עכברי בר/נוקאאוט.
Introduction
דימות מוחי שלם ברזולוציה של תא בודד הוא אתגר חשוב במדעי המוח. תמונות מוח ברזולוציה תאית מאפשרות ניתוח מפורט ומיפוי ברמת המערכת של מעגלי המוח וכיצד מעגלים אלה מופרעים על ידי גורמי סיכון גנטיים או סביבתיים להפרעות נוירופסיכיאטריות, התנהגות תאית בעוברים מתפתחים, כמו גם מעגלים עצביים במוח הבוגר 1,2,3. ישנן שיטות היסטולוגיות מרובות המאפשרות תמונות ברזולוציה גבוהה של המוח התלת-ממדי המשוחזר; עם זאת, טכניקות אלה דורשות ציוד מיוחד ויקר, ייתכן שאינן תואמות את התווית החיסונית, והאופי הדו-ממדי (2D) של שיטות מסוימות עלול להוביל לנזק לרקמות ולגזירה במהלך חתך 4,5.
ההתקדמות האחרונה סיפקה גישה חלופית להדמיית מוחות שלמים שאינה דורשת חיתוך רקמות; הם כוללים שימוש בניקוי רקמות כדי להפוך את המוחות לשקופים. שקיפות מושגת ברוב שיטות ניקוי הרקמות הן על ידי הסרת שומנים, מכיוון שהם מקור עיקרי לפיזור אור, והן על ידי התאמת מקדם השבירה (RI) של האובייקט ל- RI של תמיסת טבילת הדגימה במהלך ההדמיה. האור יכול לעבור את הגבול בין החומרים מבלי להיות מפוזר 6,7,8,9.
שיטות ניקוי רקמות, כגון iDISCO+, משולבות לעתים קרובות עם הדמיה תלת-ממדית מהירה באמצעות מיקרוסקופיית עירור של פוטון יחיד, כגון LSFM 6,7,10. בתוך רקמות שקופות המסומנות בפלואורופור, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור מצלמת מקטעים על ידי עירור עם מישור דק של אור11. היתרון העיקרי של LSFM הוא שמקטע אופטי יחיד מואר בכל פעם, כאשר כל הפלואורסצנטיות מהמולקולות בתוך אותו מקטע נרגשות, מה שממזער את הפוטו-הלבנה. יתר על כן, הדמיית פרוסה אופטית שלמה מאפשרת זיהוי מבוסס מצלמה של אותה פרוסה נרגשת, מה שמגדיל את המהירות ביחס לסריקת נקודה12. LSFM מייצרת באופן לא פולשני חלקים אופטיים רשומים היטב המתאימים לשחזור תלת-ממדי.
בעוד ששיטת iDISCO+ מאפשרת ניקוי רקמות זול תוך ~3 שבועות, שלבי התייבשות בתוך הפרוטוקול עלולים להוביל להתכווצות רקמות ולשינוי פוטנציאלי במורפולוגיה של הדגימה, ובכך להשפיע על מדידות נפחיות 6,10. הוספת שיטת הדמיה משנית, כגון MRI, לשימוש לפני הליך ניקוי הרקמות יכולה למדוד את מידת ההתכווצות הנגרמת על ידי ניקוי רקמות על פני הדגימה. במהלך שלבי ההתייבשות, הבדלים בתכונות המכניות בין החומר האפור והלבן עלולים להוביל לעיוותים לא אחידים של חומר מוחי, וכתוצאה מכך לעיוותי נפח שונים הנגרמים על ידי ניקוי רקמות בין דגימות מסוג בר לדגימות מוטנטיות, ועלולים לבלבל פרשנויות של הבדלים נפחיים בדגימות אלה10,13 . MRI מבוצע על ידי החדרת החיה תחילה עם חומר ניגוד (למשל, גדוליניום), ולאחר מכן דגירה של הרקמה המופקת המעניינת בתמיסת טבילה (למשל, פומבלין) לפני הדמיה14. MRI תואם לניקוי רקמות וביצוע LSFM על אותה דגימה.
LSFM משמש לעתים קרובות ליצירת תמונות מיקרוסקופיה בקנה מידה גדול להדמיה איכותית של רקמת המוח המעניינת, במקום להערכה כמותית של מבנה המוח (איור 1). ללא הערכה כמותית, קשה להדגים הבדלים מבניים הנובעים מעלבונות גנטיים או סביבתיים. ככל שטכנולוגיות ניקוי הרקמות וההדמיה משתפרות, יחד עם ירידה בעלויות האחסון וכוח המחשוב, כימות לוקליזציות של סוגי תאים בתוך הרקמה המעניינת הופך לנגיש יותר, ומאפשר ליותר חוקרים לכלול נתונים אלה במחקריהם.
עם למעלה מ-100 מיליון תאים במוח העכבר15 ומפגשי הדמיה של מוח שלם שיכולים לייצר טרה-בייטים של נתונים, יש ביקוש מוגבר לכלי ניתוח תמונה מתקדמים המאפשרים כימות מדויק של תכונות בתוך התמונות, כגון תאים. קיימות שורה של שיטות סגמנטציה לתמונות מנוקות רקמות המיישמות סף לעוצמת צביעה גרעינית ומסננות עצמים עם צורות, גדלים או צפיפויותמוגדרים מראש 10,16,17,18. עם זאת, פרשנויות לא מדויקות של תוצאות יכולות לנבוע מווריאציות בפרמטרים כגון גודל התא, ניגודיות התמונה ועוצמת התיוג. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול המבוסס שלנו לכימות גרעיני תאים במוח העכבר. ראשית, אנו מפרטים שלבים לאיסוף רקמות של מוח עכבר P4, ולאחר מכן פרוטוקול ניקוי רקמות ותיוג חיסוני המותאם לשיטת iDISCO+10 הזמינה לציבור. שנית, אנו מתארים רכישת תמונות באמצעות MRI ומיקרוסקופיה של יריעות אור, כולל הפרמטרים המשמשים ללכידת תמונות. לבסוף, אנו מתארים ומדגימים את NuMorph19, סט של כלי ניתוח תמונה שהקבוצה שלנו פיתחה המאפשר כימות ספציפי של סוג התא לאחר ניקוי רקמות, תיוג חיסוני עם סמנים גרעיניים והדמיית יריעות אור של אזורים מבוארים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות ניקוי רקמות הן טכניקות שימושיות למדידת ארגון תאי תלת-ממדי של המוח. ישנן שורה של שיטות ניקוי רקמות המתוארות בספרות, כל אחת עם היתרונות והמגבלות שלה 6,7,8,9. האפשרויות לכלים חישוביים לניתוח סוגי התאים בתמונות המנוקות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ה-NIH (R01MH121433, R01MH118349 ו-R01MH120125 ל-JLS ו-R01NS110791 ל-GW) וקרן התקווה. אנו מודים לפבלו אריאל מהמעבדה לשירותי מיקרוסקופיה על הסיוע בהדמיית דגימות. המעבדה לשירותי מיקרוסקופיה במחלקה לפתולוגיה ורפואה מעבדתית נתמכת בחלקה על ידי מענק התמיכה המרכזי של מרכז הסרטן P30 CA016086 למרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת צפון קרוליינה (UNC) ליינברגר. ליבת המיקרוסקופיה של מדעי המוח נתמכת על ידי מענק P30 NS045892. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך בחלקו על ידי מענק התמיכה המוסדית של מרכז הביוטק של צפון קרוליינה 2016-IDG-1016.
Materials
| Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
| EVO 860 4TB external SSD | |||
| Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
| gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
| gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
| GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
| Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
| ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
| ITK Snap | segmentation software | ||
| Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
| MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
| Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
| Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
| Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
| Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
| Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
| Antibody | Working concentration | ||
| Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
| Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
| Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
| Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
| To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |
References
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
- Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
- Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
- Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
- Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
- Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
- Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
- Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
- Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease – Alzheimer’s anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
- Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
- Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
- Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
- . iDISCO method Available from: https://idisco.info/ (2022)
- Ariel, P. UltraMicroscope II – A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).
- . Anaconda Distribution – Anaconda documentation Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022)
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
- Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
- Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
- Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
- Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
- Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
- Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
- Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
- Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
- Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
- Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).
