تصوير خلية واحدة للدماغ بالكامل وتحليل أدمغة الفئران حديثي الولادة السليمة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي ومسح الأنسجة والفحص المجهري للورقة الضوئية
Summary
يصف هذا البروتوكول طرق إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي ، والتطهير ، ووضع العلامات المناعية لأدمغة الفئران السليمة باستخدام iDISCO + ، متبوعا بوصف تفصيلي للتصوير باستخدام الفحص المجهري للورقة الضوئية ، والتحليلات النهائية باستخدام NuMorph.
Abstract
تتيح إزالة الأنسجة متبوعة بالفحص المجهري للصفائح الضوئية (LSFM) التصوير الخلوي الدقيق لبنية الدماغ السليمة ، مما يسمح بالتحليل الكمي للتغيرات الهيكلية الناجمة عن الاضطرابات الجينية أو البيئية. ينتج عن تصوير الدماغ بالكامل تقدير كمي أكثر دقة للخلايا ودراسة الاختلافات الخاصة بالمنطقة التي قد يتم تفويتها باستخدام الفحص المجهري الشائع الاستخدام للأنسجة المقسمة جسديا. إن استخدام الفحص المجهري للورقة الضوئية لتصوير الأدمغة التي تم تطهيرها يزيد بشكل كبير من سرعة الاكتساب مقارنة بالفحص المجهري متحد البؤر. على الرغم من أن هذه الصور تنتج كميات كبيرة جدا من البيانات الهيكلية للدماغ ، إلا أن معظم الأدوات الحسابية التي تؤدي ميزة القياس الكمي في صور الأنسجة التي تم تطهيرها تقتصر على حساب مجموعات الخلايا المتناثرة ، بدلا من جميع النوى.
هنا ، نوضح NuMorph (قياس التشكل القائم على النواة) ، وهي مجموعة من أدوات التحليل ، لتحديد جميع النوى والعلامات النووية داخل المناطق المشروحة لدماغ فأر ما بعد الولادة في اليوم الرابع (P4) بعد التطهير والتصوير على مجهر ورقة ضوئية. نحن نصف التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لقياس حجم الدماغ قبل الانكماش الناجم عن خطوات الجفاف لإزالة الأنسجة ، وتطهير الأنسجة باستخدام طريقة iDISCO + ، بما في ذلك وضع العلامات المناعية ، متبوعا بالفحص المجهري للورقة الضوئية باستخدام منصة متاحة تجاريا لتصوير أدمغة الفئران بدقة خلوية. ثم نوضح خط أنابيب تحليل الصور هذا باستخدام NuMorph ، والذي يستخدم لتصحيح اختلافات الكثافة ، ودمج مربعات الصور ، ومحاذاة قنوات متعددة ، وعد النوى ، والتعليق على مناطق الدماغ من خلال التسجيل في الأطالس المتاحة للجمهور.
لقد صممنا هذا النهج باستخدام البروتوكولات والبرامج المتاحة للجمهور ، مما يسمح لأي باحث لديه المجهر والموارد الحسابية اللازمة لأداء هذه التقنيات. تسمح أدوات إزالة الأنسجة والتصوير والحساب هذه بقياس وقياس التنظيم ثلاثي الأبعاد (3D) لأنواع الخلايا في القشرة ويجب أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع على أي تصميم لدراسة الفئران من النوع البري / بالضربة القاضية.
Introduction
يعد تصوير الدماغ بالكامل بدقة خلية واحدة تحديا مهما في علم الأعصاب. تسمح صور الدماغ ذات الدقة الخلوية بإجراء تحليل مفصل ورسم خرائط على مستوى النظام لدوائر الدماغ وكيف تتعطل هذه الدوائر بسبب عوامل الخطر الوراثية أو البيئية للاضطرابات العصبية والنفسية ، والسلوك الخلوي في الأجنة النامية ، وكذلك الدوائر العصبية في الدماغ البالغ1،2،3. هناك العديد من الأساليب النسيجية التي تسمح لصور عالية الدقة من الدماغ 3D إعادة بنائها. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنيات معدات متخصصة باهظة الثمن ، وقد لا تكون متوافقة مع وضع العلامات المناعية ، وقد تؤدي الطبيعة ثنائية الأبعاد (2D) لبعض الطرق إلى تلف الأنسجة والقص أثناء التقسيم 4,5.
قدمت التطورات الحديثة نهجا بديلا لتصوير أدمغة كاملة لا تتطلب تقسيم الأنسجة. أنها تنطوي على استخدام إزالة الأنسجة لجعل الأدمغة شفافة. يتم تحقيق الشفافية في معظم طرق إزالة الأنسجة عن طريق إزالة الدهون ، لأنها مصدر رئيسي لتشتت الضوء ، ومطابقة معامل الانكسار (RI) للكائن مع RI لمحلول غمر العينة أثناء التصوير. يمكن للضوء بعد ذلك المرور عبر الحدود بين المواد دون أن يتشتت6،7،8،9.
غالبا ما يتم دمج طرق إزالة الأنسجة ، مثل iDISCO + ، مع التصوير السريع ثلاثي الأبعاد باستخدام الفحص المجهري لإثارة الفوتون الواحد ، مثل LSFM6،7،10. داخل الأنسجة الشفافة الموسومة بفلوروفور ، يقوم المجهر الفلوري ذو الورقة الضوئية بأقسام الإثارة بمستوى رفيع من الضوء11. الميزة الرئيسية ل LSFM هي أن قسما بصريا واحدا يضيء في كل مرة ، مع إثارة كل التألق من الجزيئات داخل هذا القسم ، مما يقلل من التبييض الضوئي. علاوة على ذلك ، يتيح تصوير شريحة بصرية كاملة الكشف المستند إلى الكاميرا عن تلك الشريحة المثيرة ، مما يزيد من السرعة بالنسبة لمسح النقاط12. تنتج LSFM بشكل غير مدمر أقساما بصرية مسجلة جيدا ومناسبة لإعادة بناء 3D.
بينما تسمح طريقة iDISCO + بإزالة الأنسجة غير المكلفة في غضون ~ 3 أسابيع ، قد تؤدي خطوات الجفاف داخل البروتوكول إلى انكماش الأنسجة والتغيير المحتمل في مورفولوجيا العينة ، مما يؤثر على القياسات الحجمية6،10. يمكن أن تؤدي إضافة طريقة تصوير ثانوية ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي ، لاستخدامها قبل إجراء إزالة الأنسجة إلى قياس درجة الانكماش الناجم عن إزالة الأنسجة عبر العينة. أثناء خطوات الجفاف ، قد تؤدي الاختلافات في الخواص الميكانيكية بين المادة الرمادية والبيضاء إلى تشوهات غير منتظمة في مادة الدماغ ، مما يؤدي إلى تشوهات حجم غير متشابهة ناتجة عن إزالة الأنسجة بين العينات البرية والمتحولة وقد تربك تفسيرات الاختلافات الحجمية في هذه العينات10,13 . يتم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي عن طريق أولا بتزويد الحيوان بعامل تباين (على سبيل المثال ، الجادولينيوم) ، يليه احتضان الأنسجة المستخرجة ذات الأهمية في محلول غمر (على سبيل المثال ، فومبلين) قبل التصوير14. التصوير بالرنين المغناطيسي متوافق مع إزالة الأنسجة وإجراء LSFM على نفس العينة.
غالبا ما يستخدم LSFM لإنشاء صور مجهرية واسعة النطاق للتصور النوعي لأنسجة المخ محل الاهتمام بدلا من التقييم الكمي لبنية الدماغ (الشكل 1). بدون التقييم الكمي ، من الصعب إثبات الاختلافات الهيكلية الناتجة عن الإهانات الجينية أو البيئية. مع تحسن تقنيات إزالة الأنسجة والتصوير ، إلى جانب انخفاض تكاليف التخزين وقوة الحوسبة ، أصبح تحديد توطين نوع الخلية داخل الأنسجة ذات الاهتمام أكثر سهولة ، مما يسمح لمزيد من الباحثين بتضمين هذه البيانات في دراساتهم.
مع وجود أكثر من 100 مليون خلية في دماغ الفأر15 وجلسات تصوير الدماغ بالكامل التي يمكن أن تولد تيرابايت من البيانات ، هناك طلب متزايد على أدوات تحليل الصور المتقدمة التي تسمح بالقياس الكمي الدقيق للميزات داخل الصور ، مثل الخلايا. توجد مجموعة من طرق التجزئة للصور التي تم تطهيرها من الأنسجة والتي تطبق عتبة لكثافة التلوين النووي وتصفية الكائنات ذات الأشكال أو الأحجام أو الكثافات المحددة مسبقا10،16،17،18. ومع ذلك ، يمكن أن تنشأ التفسيرات غير الدقيقة للنتائج من الاختلافات في المعلمات مثل حجم الخلية وتباين الصورة وكثافة وضع العلامات. تصف هذه الورقة بروتوكولنا المعمول به لتحديد نوى الخلية في دماغ الفأر. أولا ، نقوم بتفصيل خطوات جمع الأنسجة لدماغ الفأر P4 ، متبوعا ببروتوكول إزالة الأنسجة ووضع العلامات المناعية المحسن من طريقة iDISCO +المتاحة للجمهور 10. ثانيا ، نصف الحصول على الصور باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي والفحص المجهري للورقة الضوئية ، بما في ذلك المعلمات المستخدمة لالتقاط الصور. أخيرا ، وصفنا وأوضحنا NuMorph19 ، وهي مجموعة من أدوات تحليل الصور التي طورتها مجموعتنا والتي تسمح بالقياس الكمي المحدد لنوع الخلية بعد إزالة الأنسجة ، ووضع العلامات المناعية باستخدام العلامات النووية ، وتصوير الورقة الضوئية للمناطق المشروحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
طرق إزالة الأنسجة هي تقنيات مفيدة لقياس التنظيم الخلوي 3D للدماغ. هناك مجموعة من طرق إزالة الأنسجة الموصوفة في الأدبيات ، ولكل منها مزاياها وقيودها6،7،8،9. خيارات الأدوات الحسابية لتحليل أنواع الخلايا في الصور التي تم تط…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01MH121433 و R01MH118349 و R01MH120125 إلى JLS و R01NS110791 إلى GW) ومؤسسة الأمل. نشكر بابلو أرييل من مختبر خدمات الفحص المجهري لمساعدته في تصوير العينات. يتم دعم مختبر خدمات الفحص المجهري في قسم علم الأمراض والطب المخبري جزئيا من خلال منحة الدعم الأساسية لمركز السرطان P30 CA016086 إلى مركز Lineberger الشامل للسرطان بجامعة نورث كارولينا (UNC). يتم دعم نواة الفحص المجهري لعلم الأعصاب من خلال منحة P30 NS045892. تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور جزئيا من قبل منحة الدعم المؤسسي لمركز نورث كارولينا للتكنولوجيا الحيوية 2016-IDG-1016.
Materials
| Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
| EVO 860 4TB external SSD | |||
| Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
| gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
| gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
| GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
| Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
| ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
| ITK Snap | segmentation software | ||
| Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
| MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
| Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
| Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
| Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
| Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
| Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
| Antibody | Working concentration | ||
| Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
| Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
| Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
| Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
| To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |
References
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
- Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
- Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
- Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
- Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
- Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
- Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
- Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
- Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease – Alzheimer’s anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
- Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
- Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
- Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
- . iDISCO method Available from: https://idisco.info/ (2022)
- Ariel, P. UltraMicroscope II – A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).
- . Anaconda Distribution – Anaconda documentation Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022)
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
- Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
- Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
- Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
- Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
- Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
- Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
- Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
- Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
- Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
- Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).
