MRI, 조직 투명화 및 라이트 시트 현미경을 사용한 온전한 신생아 마우스 뇌의 전뇌 단일 세포 이미징 및 분석
Summary
이 프로토콜은 iDISCO+를 사용하여 온전한 마우스 뇌의 자기 공명 영상, 제거 및 면역 표지를 수행하는 방법을 설명한 다음, 라이트 시트 현미경을 사용한 이미징 및 NuMorph를 사용한 다운스트림 분석에 대한 자세한 설명을 설명합니다.
Abstract
조직 투명화 후 라이트 시트 현미경(LSFM)을 통해 온전한 뇌 구조의 세포 분해능 이미징이 가능하여 유전적 또는 환경적 섭동으로 인한 구조적 변화를 정량적으로 분석할 수 있습니다. 전뇌 영상은 세포의 보다 정확한 정량화와 물리적으로 절단된 조직의 일반적으로 사용되는 현미경으로는 놓칠 수 있는 영역별 차이에 대한 연구를 가능하게 합니다. 라이트 시트 현미경을 사용하여 맑은 뇌를 이미지화하면 컨포칼 현미경에 비해 획득 속도가 크게 향상됩니다. 이러한 이미지는 매우 많은 양의 뇌 구조 데이터를 생성하지만 제거 된 조직의 이미지에서 특징 정량화를 수행하는 대부분의 계산 도구는 모든 핵이 아닌 희소 세포 집단을 계산하는 것으로 제한됩니다.
여기에서는 분석 도구 그룹인 NuMorph(핵 기반 형태 측정법)를 시연하여 라이트 시트 현미경으로 투명화 및 이미징한 후 출생 후 4일차(P4) 마우스 뇌의 주석이 달린 영역 내의 모든 핵과 핵 마커를 정량화합니다. 조직 제거 탈수 단계로 인한 수축 전에 뇌 부피를 측정하는 자기 공명 영상 (MRI), 면역 표지를 포함한 iDISCO + 방법을 사용한 조직 청소, 상용 플랫폼을 사용하여 세포 해상도로 마우스 뇌를 이미지화하는 라이트 시트 현미경에 대해 설명합니다. 그런 다음 강도 차이를 수정하고, 이미지 타일을 연결하고, 여러 채널을 정렬하고, 핵을 계산하고, 공개적으로 사용 가능한 지도책에 등록을 통해 뇌 영역에 주석을 추가하는 데 사용되는 NuMorph를 사용하여 이 이미지 분석 파이프라인을 시연합니다.
우리는 공개적으로 사용 가능한 프로토콜과 소프트웨어를 사용하여 이 접근 방식을 설계하여 필요한 현미경과 계산 리소스를 가진 모든 연구원이 이러한 기술을 수행할 수 있도록 했습니다. 이러한 조직 청소, 이미징 및 계산 도구를 사용하면 피질에서 세포 유형의 3차원(3D) 조직을 측정하고 정량화할 수 있으며 모든 야생형/녹아웃 마우스 연구 설계에 널리 적용할 수 있어야 합니다.
Introduction
단일 세포 분해능의 전체 뇌 영상은 신경 과학에서 중요한 과제입니다. 세포 해상도 뇌 이미지는 뇌 회로에 대한 상세한 분석 및 시스템 수준 매핑과 신경 정신 장애에 대한 유전 적 또는 환경 적 위험 요소, 발달중인 배아의 세포 행동 및 성인 뇌의 신경 회로 1,2,3에 의해 회로가 어떻게 파괴되는지를 허용합니다. 재구성 된 3D 뇌의 고해상도 이미지를 허용하는 여러 조직 학적 방법이 있습니다. 그러나 이러한 기술은 값 비싸고 전문화 된 장비가 필요하며 면역 표지와 호환되지 않을 수 있으며 일부 방법의 2 차원 (2D) 특성으로 인해 절편 4,5 동안 조직 손상 및 전단이 발생할 수 있습니다.
최근의 발전은 조직 절편이 필요하지 않은 전체 뇌를 영상화하는 대안적인 접근 방식을 제공했습니다. 그들은 뇌를 투명하게 만들기 위해 조직 청소를 사용하는 것을 포함합니다. 대부분의 조직 투명화 방법에서 지질은 광산란의 주요 원인이기 때문에 지질을 제거하고 이미징 중에 물체의 굴절률(RI)을 샘플 액침 용액의 RI와 일치시킴으로써 달성됩니다. 빛은 산란되지 않고 물질 사이의 경계를 통과 할 수 있습니다 6,7,8,9.
iDISCO+와 같은 조직 투명화 방법은 종종 LSFM 6,7,10과 같은 단일 광자 여기 현미경을 사용하는 신속한 3D 이미징과 결합됩니다. 형광단으로 표지된 투명한 조직 내에서, 얇은 광면(11)을 사용한 여기(여기)에 의한 광시트 형광 현미경 이미지 절편. LSFM의 주요 장점은 한 번에 하나의 광학 섹션이 조명되고 해당 섹션 내의 분자에서 나오는 모든 형광이 여기되어 광퇴색을 최소화한다는 것입니다. 더욱이, 전체 광학 슬라이스를 이미징하는 것은 그 여기 슬라이스의 카메라 기반 검출을 가능하게 하여, 포인트 스캐닝(12)에 비해 속도를 증가시킨다. LSFM은 3D 재구성에 적합한 잘 등록된 광학 섹션을 비파괴적으로 생산합니다.
iDISCO+ 방법은 ~3주 이내에 저렴한 조직 청소를 가능하게 하지만, 프로토콜 내의 탈수 단계는 조직 수축 및 샘플 형태의 잠재적 변화로 이어질 수 있으므로 체적 측정에 영향을 미칠 수 있습니다6,10. 조직 투명화 절차 전에 사용되는 MRI와 같은 2차 이미징 방법을 추가하면 샘플 전체에 걸쳐 조직 투명화 유도 수축 정도를 측정할 수 있습니다. 탈수 단계에서 회백질과 백질 사이의 기계적 특성의 차이는 불균일한 뇌 물질 변형을 유발할 수 있으며, 이로 인해 야생형 샘플과 돌연변이 샘플 간에 서로 다른 조직 투명으로 인한 부피 변형이 발생할 수 있으며 이러한 샘플의 체적 차이에 대한 해석이 혼란스러울 수 있습니다.10,13 . MRI는 먼저 동물을 조영제(예를 들어, 가돌리늄)로 관류시킨 다음, 추출된 관심 조직을 이미징 전에 침지 용액(예를 들어, 폼블린)에서 인큐베이션함으로써 수행된다(14). MRI는 조직 투명화 및 동일한 샘플에서 LSFM 수행과 호환됩니다.
LSFM은 뇌 구조의 정량적 평가보다는 관심 있는 뇌 조직의 정성적 시각화를 위한 대규모 현미경 이미지를 생성하는 데 자주 사용됩니다(그림 1). 정량적 평가 없이는 유전 적 또는 환경 적 모욕으로 인한 구조적 차이를 입증하기가 어렵습니다. 조직 청소 및 이미징 기술이 향상되고 스토리지 및 컴퓨팅 성능 비용이 감소함에 따라 관심 조직 내에서 세포 유형 위치를 정량화하는 것이 더 쉬워지고 더 많은 연구자들이 이러한 데이터를 연구에 포함할 수 있게 되었습니다.
마우스 뇌(15) 내의 1억 개 이상의 세포와 테라바이트의 데이터를 생성할 수 있는 전뇌 이미징 세션으로 인해, 세포와 같은 이미지 내의 특징을 정확하게 정량화할 수 있는 고급 이미지 분석 도구에 대한 수요가 증가하고 있다. 핵 염색 강도에 대한 임계값을 적용하고 미리 정의된 모양, 크기 또는 밀도가10,16,17,18인 물체를 필터링하는 조직 투명 이미지에 대한 다양한 분할 방법이 있습니다. 그러나 결과의 부정확한 해석은 세포 크기, 이미지 대비 및 라벨링 강도와 같은 매개변수의 변화로 인해 발생할 수 있습니다. 이 논문은 마우스 뇌의 세포핵을 정량화하기 위해 확립 된 프로토콜을 설명합니다. 먼저, P4 마우스 뇌의 조직 수집을 위한 단계를 자세히 설명한 다음, 공개적으로 이용 가능한 iDISCO+ 방법(10)으로부터 최적화된 조직 투명화 및 면역표지 프로토콜이 뒤따른다. 둘째, 이미지 캡처에 사용되는 매개 변수를 포함하여 MRI 및 라이트 시트 현미경을 사용한 이미지 획득에 대해 설명합니다. 마지막으로, 조직 제거 후 세포 유형 특이적 정량화, 핵 마커를 사용한 면역 표지 및 주석이 달린 영역의 라이트 시트 이미징을 가능하게 하는 우리 그룹이 개발한 이미지 분석 도구 세트인 NuMorph19를 설명하고 시연합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
조직 제거 방법은 뇌의 3D 세포 조직을 측정하는 데 유용한 기술입니다. 문헌에 기술된 다수의 조직 투명화 방법이 있으며, 각각의 장점과 한계가 있다 6,7,8,9. 조직 투명 이미지에서 세포 유형을 분석하기 위한 계산 도구에 대한 옵션은 상대적으로 제한적입니다. 다른 이용가능한 도구들은 분할이 덜 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH (R01MH121433, R01MH118349 및 R01MH120125에서 JLS로, R01NS110791에서 GW로)와 희망의 재단에 의해 지원되었습니다. 샘플 이미징을 지원해 주신 현미경 서비스 연구소의 Pablo Ariel에게 감사드립니다. 병리학 및 실험실 의학과의 현미경 서비스 실험실은 노스 캐롤라이나 대학교 (UNC) Lineberger 종합 암 센터에 대한 암 센터 핵심 지원 보조금 P30 CA016086에 의해 부분적으로 지원됩니다. 신경 과학 현미경 코어는 보조금 P30 NS045892에 의해 지원됩니다. 이 간행물에보고 된 연구는 노스 캐롤라이나 생명 공학 센터 기관 지원 보조금 2016-IDG-1016에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
| EVO 860 4TB external SSD | |||
| Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
| gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
| gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
| GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
| Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
| ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
| ITK Snap | segmentation software | ||
| Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
| MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
| Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
| Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
| Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
| Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
| Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
| Antibody | Working concentration | ||
| Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
| Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
| Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
| Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
| To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |
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