Одноклеточная визуализация всего мозга и анализ интактного мозга новорожденных мышей с использованием МРТ, очистки тканей и микроскопии световых листов

Felix A. Kyere; Ian Curtin; Oleh Krupa; Carolyn M. McCormick; Mustafa Dere; Sarah Khan; Minjeong Kim; Tzu-Wen Winnie Wang; Qiuhong He; Guorong Wu; Yen-Yu Ian Shih; Jason L. Stein

doi:10.3791/64096

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Одноклеточная визуализация всего мозга и анализ интактного мозга новорожденных мышей с использованием МРТ, очистки тканей и микроскопии световых листов

3.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64096

⸱

1 августа 2022 г.

Felix A. Kyere^*¹^,² , Ian Curtin^*¹^,² , Oleh Krupa¹^,² , Carolyn M. McCormick¹^,² , Mustafa Dere³ , Sarah Khan³^,⁷ , Minjeong Kim⁷ , Tzu-Wen Winnie Wang⁴^,⁵^,⁶ , Qiuhong He⁴^,⁵^,⁶ , Guorong Wu³ , Yen-Yu Ian Shih⁴^,⁵^,⁶ , Jason L. Stein¹^,²

¹UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, ²Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, ³Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, ⁴Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁵Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁶Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁷Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает методы проведения магнитно-резонансной томографии, очистки и иммуномаркировки интактного мозга мыши с использованием iDISCO+, за которым следует подробное описание визуализации с использованием микроскопии светового листа и последующих анализов с использованием NuMorph.

Аннотация

Очистка тканей с последующей микроскопией светового листа (LSFM) позволяет визуализировать неповрежденную структуру мозга с клеточным разрешением, что позволяет проводить количественный анализ структурных изменений, вызванных генетическими или экологическими возмущениями. Визуализация всего мозга приводит к более точной количественной оценке клеток и изучению региональных различий, которые могут быть пропущены при обычно используемой микроскопии физически разделенной ткани. Использование световой листовой микроскопии для изображения очищенного мозга значительно увеличивает скорость получения по сравнению с конфокальной микроскопией. Хотя эти изображения производят очень большие объемы структурных данных мозга, большинство вычислительных инструментов, которые выполняют количественную оценку признаков на изображениях очищенной ткани, ограничены подсчетом разреженных клеточных популяций, а не всех ядер.

Здесь мы демонстрируем NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), группу инструментов анализа, для количественной оценки всех ядер и ядерных маркеров в аннотированных областях мозга мыши послеродового дня 4 (P4) после очистки и визуализации на световом микроскопе. Мы описываем магнитно-резонансную томографию (МРТ) для измерения объема мозга до усадки, вызванной этапами обезвоживания тканей, очистки тканей с использованием метода iDISCO+, включая иммуномаркировку, с последующей микроскопией светового листа с использованием коммерчески доступной платформы для изображения мозга мыши с клеточным разрешением. Затем мы демонстрируем этот конвейер анализа изображений с помощью NuMorph, который используется для коррекции различий в интенсивности, сшивания плиток изображений, выравнивания нескольких каналов, подсчета ядер и аннотирования областей мозга путем регистрации в общедоступных атласах.

Мы разработали этот подход с использованием общедоступных протоколов и программного обеспечения, позволяя любому исследователю с необходимым микроскопом и вычислительными ресурсами выполнять эти методы. Эти инструменты очистки тканей, визуализации и вычислений позволяют измерять и количественно определять трехмерную (3D) организацию типов клеток в коре головного мозга и должны быть широко применимы к любому дизайну исследования дикого типа / нокаутированных мышей.

Введение

Визуализация всего мозга с разрешением одной клетки является важной проблемой в нейробиологии. Изображения мозга с клеточным разрешением позволяют проводить подробный анализ и картирование на системном уровне схем головного мозга и того, как эта схема нарушается генетическими или экологическими факторами риска нервно-психических расстройств, клеточного поведения у развивающихся эмбрионов, а также нейронных цепей во взрослом мозге ^1,2,3. Существует несколько гистологических методов, которые позволяют получать изображения с высоким разрешением реконструированного 3D-мозга; одна....