Одноклеточная визуализация всего мозга и анализ интактного мозга новорожденных мышей с использованием МРТ, очистки тканей и микроскопии световых листов
Summary
Этот протокол описывает методы проведения магнитно-резонансной томографии, очистки и иммуномаркировки интактного мозга мыши с использованием iDISCO+, за которым следует подробное описание визуализации с использованием микроскопии светового листа и последующих анализов с использованием NuMorph.
Abstract
Очистка тканей с последующей микроскопией светового листа (LSFM) позволяет визуализировать неповрежденную структуру мозга с клеточным разрешением, что позволяет проводить количественный анализ структурных изменений, вызванных генетическими или экологическими возмущениями. Визуализация всего мозга приводит к более точной количественной оценке клеток и изучению региональных различий, которые могут быть пропущены при обычно используемой микроскопии физически разделенной ткани. Использование световой листовой микроскопии для изображения очищенного мозга значительно увеличивает скорость получения по сравнению с конфокальной микроскопией. Хотя эти изображения производят очень большие объемы структурных данных мозга, большинство вычислительных инструментов, которые выполняют количественную оценку признаков на изображениях очищенной ткани, ограничены подсчетом разреженных клеточных популяций, а не всех ядер.
Здесь мы демонстрируем NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), группу инструментов анализа, для количественной оценки всех ядер и ядерных маркеров в аннотированных областях мозга мыши послеродового дня 4 (P4) после очистки и визуализации на световом микроскопе. Мы описываем магнитно-резонансную томографию (МРТ) для измерения объема мозга до усадки, вызванной этапами обезвоживания тканей, очистки тканей с использованием метода iDISCO+, включая иммуномаркировку, с последующей микроскопией светового листа с использованием коммерчески доступной платформы для изображения мозга мыши с клеточным разрешением. Затем мы демонстрируем этот конвейер анализа изображений с помощью NuMorph, который используется для коррекции различий в интенсивности, сшивания плиток изображений, выравнивания нескольких каналов, подсчета ядер и аннотирования областей мозга путем регистрации в общедоступных атласах.
Мы разработали этот подход с использованием общедоступных протоколов и программного обеспечения, позволяя любому исследователю с необходимым микроскопом и вычислительными ресурсами выполнять эти методы. Эти инструменты очистки тканей, визуализации и вычислений позволяют измерять и количественно определять трехмерную (3D) организацию типов клеток в коре головного мозга и должны быть широко применимы к любому дизайну исследования дикого типа / нокаутированных мышей.
Introduction
Визуализация всего мозга с разрешением одной клетки является важной проблемой в нейробиологии. Изображения мозга с клеточным разрешением позволяют проводить подробный анализ и картирование на системном уровне схем головного мозга и того, как эта схема нарушается генетическими или экологическими факторами риска нервно-психических расстройств, клеточного поведения у развивающихся эмбрионов, а также нейронных цепей во взрослом мозге 1,2,3. Существует несколько гистологических методов, которые позволяют получать изображения с высоким разрешением реконструированного 3D-мозга; однако эти методы требуют дорогостоящего специализированного оборудования, могут быть несовместимы с иммуномаркировкой, а двумерный (2D) характер некоторых методов может привести к повреждению тканей и сдвигу во время сечения 4,5.
Последние достижения обеспечили альтернативный подход к визуализации всего мозга, который не требует разрезания тканей; они включают в себя использование очистки тканей, чтобы сделать мозг прозрачным. Прозрачность достигается в большинстве методов очистки тканей как путем удаления липидов, поскольку они являются основным источником рассеяния света, так и путем сопоставления показателя преломления (RI) объекта с RI раствора погружения образца во время визуализации. Затем свет может проходить через границу между материалами, не рассеиваясь 6,7,8,9.
Методы очистки тканей, такие как iDISCO+, часто сочетаются с быстрой 3D-визуализацией с использованием однофотонной микроскопии возбуждения, такой как LSFM 6,7,10. Внутри прозрачных тканей, меченных флуорофором, светоплотная флуоресцентная микроскопия рисует участки путем возбуждения тонкой плоскостью света11. Основным преимуществом LSFM является то, что одна оптическая секция освещается за один раз, при этом вся флуоресценция от молекул в этой секции возбуждается, что сводит к минимуму фотоотбеливание. Кроме того, визуализация всего оптического среза позволяет обнаруживать этот возбужденный срез на основе камеры, увеличивая скорость по сравнению с точечным сканированием12. LSFM неразрушающе производит хорошо зарегистрированные оптические секции, которые подходят для 3D-реконструкции.
В то время как метод iDISCO+ позволяет провести недорогую очистку тканей в течение ~ 3 недель, этапы обезвоживания в рамках протокола могут привести к усадке ткани и потенциальному изменению морфологии образца, что влияет на объемные измерения 6,10. Добавление вторичного метода визуализации, такого как МРТ, который будет использоваться до процедуры очистки тканей, может измерить степень усадки, вызванной очисткой тканей, по всему образцу. На этапах обезвоживания различия в механических свойствах между серым и белым веществом могут привести к неоднородным деформациям мозгового вещества, что приводит к неоднородным объемным деформациям, вызванным очисткой тканей, между образцами дикого типа и мутантами и может сбивать с толку интерпретации объемных различий в этих образцах10,13 . МРТ выполняют путем сначала перфузии животного контрастным веществом (например, гадолинием), а затем инкубированием интересующей ткани в иммерсионном растворе (например, фомблине) перед визуализацией14. МРТ совместима с очисткой тканей и выполнением LSFM на одном образце.
LSFM часто используется для создания крупномасштабных микроскопических изображений для качественной визуализации интересующей ткани мозга, а не количественной оценки структуры мозга (рисунок 1). Без количественной оценки трудно продемонстрировать структурные различия, возникающие в результате генетических или экологических нарушений. По мере совершенствования технологий очистки тканей и визуализации, наряду с уменьшением затрат на хранение и вычислительную мощность, количественная оценка локализаций клеточного типа в интересующей ткани становится все более доступной, что позволяет большему количеству исследователей включать эти данные в свои исследования.
С более чем 100 миллионами клеток в мозге мыши15 и сеансами визуализации всего мозга, которые могут генерировать терабайты данных, существует повышенный спрос на передовые инструменты анализа изображений, которые позволяют точно количественно оценивать особенности в изображениях, такие как клетки. Существует множество методов сегментации для изображений, очищенных тканью, которые применяют пороговое значение для интенсивности ядерного окрашивания и фильтруют объекты с предопределенными формами, размерами или плотностями 10,16,17,18. Однако неточные интерпретации результатов могут возникать из-за различий в таких параметрах, как размер ячейки, контрастность изображения и интенсивность маркировки. В этой статье описывается наш установленный протокол для количественной оценки клеточных ядер в мозге мыши. Во-первых, мы подробно описываем шаги по сбору тканей мозга мыши P4, за которыми следует протокол очистки и иммуномаркировки тканей, оптимизированный из общедоступного метода iDISCO+10. Во-вторых, мы описываем получение изображений с помощью МРТ и световой микроскопии, включая параметры, используемые для захвата изображений. Наконец, мы описываем и демонстрируем NuMorph19, набор инструментов анализа изображений, разработанных нашей группой, которые позволяют количественно определять специфический клеточный тип после очистки тканей, иммуномаркировку ядерными маркерами и визуализацию аннотированных областей на световых листах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы очистки тканей являются полезными методами измерения 3D-клеточной организации мозга. Существует множество методов очистки тканей, описанных в литературе, каждый со своими преимуществами и ограничениями 6,7,8,9.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH (R01MH121433, R01MH118349 и R01MH120125 для JLS и R01NS110791 для GW) и Фондом надежды. Мы благодарим Пабло Ариэля из Лаборатории микроскопических услуг за помощь в визуализации образцов. Лаборатория услуг микроскопии в отделении патологии и лабораторной медицины частично поддерживается грантом первичной поддержки Онкологического центра P30 CA016086 Университету Северной Каролины (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Ядро нейробиологической микроскопии поддерживается грантом P30 NS045892. Исследование, о котором сообщается в этой публикации, было частично поддержано грантом институциональной поддержки Биотехнологического центра Северной Каролины 2016-IDG-1016.
Materials
| Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
| EVO 860 4TB external SSD | |||
| Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
| gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
| gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
| GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
| Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
| ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
| ITK Snap | segmentation software | ||
| Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
| MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
| Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
| Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
| Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
| Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
| Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
| Antibody | Working concentration | ||
| Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
| Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
| Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
| Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
| To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |
References
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
- Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
- Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
- Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
- Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
- Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
- Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
- Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
- Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease – Alzheimer’s anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
- Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
- Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
- Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
- . iDISCO method Available from: https://idisco.info/ (2022)
- Ariel, P. UltraMicroscope II – A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).
- . Anaconda Distribution – Anaconda documentation Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022)
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
- Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
- Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
- Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
- Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
- Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
- Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
- Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
- Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
- Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
- Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).
