Summary
Denne protokol beskriver differentiel centrifugering til isolering og karakterisering af repræsentative EV'er (exosomer og mikrovesikler) fra dyrkede humane MSC'er. Yderligere anvendelser af disse elbiler forklares også i denne artikel.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV'er) er heterogene membrannanopartikler frigivet af de fleste celletyper, og de anerkendes i stigende grad som fysiologiske regulatorer af organismehomeostase og vigtige indikatorer for patologier; I mellemtiden er deres enorme potentiale for at etablere tilgængelige og kontrollerbare sygdomsbehandlinger ved at dukke op. Mesenkymale stamceller (MSC'er) kan frigive store mængder EV'er i kultur, hvilket har vist løfte om at kickstarte effektiv vævsregenerering og lette omfattende terapeutiske anvendelser med god skalerbarhed og reproducerbarhed. Der er en stigende efterspørgsel efter enkle og effektive protokoller til indsamling og anvendelse af MSC-EV'er. Her leveres en detaljeret protokol baseret på differentiel centrifugering for at isolere og karakterisere repræsentative elbiler fra dyrkede humane MSC'er, exosomer og mikrovesikler til yderligere applikationer. Tilpasningsevnen af denne metode er vist for en række downstream-tilgange, såsom mærkning, lokal transplantation og systemisk injektion. Gennemførelsen af denne procedure vil imødekomme behovet for enkel og pålidelig indsamling og anvendelse af MSC-EV'er i translationel forskning.
Introduction
Stamceller er udifferentierede pluripotente celler med evne til selvfornyelse og translationelt potentiale1. Mesenkymale stamceller (MSC'er) isoleres, dyrkes, udvides og renses let i laboratoriet, hvilket stadig er karakteristisk for stamceller efter flere passager. I de senere år har stigende dokumentation støttet det synspunkt, at MSC'er virker i en parakrin tilstand i terapeutisk brug 2,3. Især udskillelsen af ekstracellulære vesikler (EV'er) spiller en afgørende rolle i formidlingen af MSC'ernes biologiske funktioner. Som heterogene membranøse nanopartikler frigivet fra de fleste celletyper består EV'er af underkategorier kaldet exosomer (Exos), mikrovesikler (MV'er) og endnu større apoptotiske legemer 4,5. Blandt dem er Exos den mest undersøgte EV med en størrelse på 40-150 nm, som er af endosomal oprindelse og aktivt udskilles under fysiologiske forhold. MV'er dannes ved afgivelse direkte fra overfladen af celleplasmamembranen med en diameter på 100-1.000 nm, som er kendetegnet ved høj ekspression af phosphatidylserin og ekspression af overflademarkører af donorceller6. EV'er indeholder RNA, proteiner og andre bioaktive molekyler, som har lignende funktioner som modercellerne og spiller en væsentlig rolle i cellekommunikation, immunrespons og reparation af vævsskader7. MSC-EV'er er blevet bredt undersøgt som et kraftfuldt cellefrit terapeutisk værktøj i regenerativ medicin8.
Isolering og rensning af MSC-afledte elbiler er et almindeligt problem inden for forskning og anvendelse. På nuværende tidspunkt er differentiel og densitetsgradient ultracentrifugering9, ultrafiltreringsproces 10, immunomagnetisk separation11, molekylær eksklusionskromatograf 12 og mikrofluidisk chip13 almindeligt anvendte metoder til isolering og oprensning af elbiler. Med fordele og ulemper ved hver tilgang kan mængden, renheden og aktiviteten af indsamlede elbiler ikke opfyldes på samme tid14,15. I denne undersøgelse vises differentialcentrifugeringsprotokollen for isolering og karakterisering af EV'er fra dyrkede MSC'er i detaljer, hvilket har understøttet effektiv terapeutisk anvendelse 16,17,18,19,20. Tilpasningsevnen af denne metode til en række downstream-tilgange, såsom fluorescerende mærkning, lokal transplantation og systemisk injektion, er yderligere blevet eksemplet. Gennemførelsen af denne procedure vil imødekomme behovet for enkel og pålidelig indsamling og anvendelse af MSC-EV'er i translationel forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care and Use Committee of the Fourth Military Medical University og udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Otte uger gamle C57Bl/6 mus (ingen præference for hverken hunner eller hanner) blev brugt. Kryopræserverede MSC'er afledt af human navlestreng (UCMSC'er), der blev anvendt til denne undersøgelse, blev indhentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel). Anvendelsen af humane celler blev godkendt af den etiske komité for fjerde militære medicinske universitet.
1. Dyrkning af humane mesenkymale stamceller (hMSC'er)
- Forbered det tilbehør og de opløsninger, der kræves til forsøgsarbejdet, herunder pipetter, pipettespidser, 10 cm petriskål, termostatisk udstyr (vandbad), gummihandsker, 75% alkohol, dyrkningsmedium (inkuberet ved 37 °C), dødeligt bovint serum (FBS) og 100x penicillin-streptomycin (P/S) opløsning (se materialetabel).
- Forbered kommercielt tilgængeligt alfa-minimum essentielt medium (α-MEM) ved at supplere med 20% FBS og 1% P / S.
BEMÆRK: Fortynd alle opløsninger, der anvendes til isolering og analyse af elbiler i ultrarent filtreret vand fremstillet af det ultrarene filtrerede vandrensningssystem (se materialetabel). - De kryopræserverede MSC'er afledt af human navlesnor (UCMSC'er) genvindes fra det flydende nitrogen ved at smelte dem i et 37 °C vandbad.
- Den smeltede cellesuspension overføres hurtigt og forsigtigt til et 15 ml glas med 5 ml dyrkningsmedium (trin 1.2). Der centrifugeres ved 4 °C, 500 x g i 5 min.
- Supernatanten fjernes med en steril pipette og fastholder cellebundfaldet. Der tilsættes 2 ml dyrkningsmedium i centrifugeglasset, og cellerne opslæmmes forsigtigt.
- Frø cellerne i en 10 cm petriskål, og tilsæt 8 ml dyrkningsmedium til i alt 10 ml.
- Dyrkning af MSC'er ved 37 °C i 5% CO2 i celleinkubatoren.
2. Differentiel centrifugering til isolering af Exos og MV'er
- Når MSC'er vokser til >90% sammenløb, erstattes dyrkningsmediet med α-MEM suppleret med 20% EV-udtømt FBS og 1% P / S for 8 ml af hver skål.
BEMÆRK: Centrifuger FBS ved 4 °C, 1,50,000 x g natten over for at fjerne elbiler og andre urenheder. - Efter 48 timers dyrkning opsamles næringssubstratet (trin 2.1) i 50 ml centrifugeglas.
- MSC-dyrkningsmediet centrifugeres ved 4 °C, 800 x g i 10 min.
- Cellefragmenterne og celleaffaldet fjernes ved at overføre supernatanten til rene koniske rør på 1,5 ml.
BEMÆRK: Brug af 1,5 ml koniske rør er nødvendigt for at øge EV-udbyttet. - Supernatanten centrifugeres ved 4 °C, 16.000 x g i 30 min. Pellet er MV'er. MV'er fra hver skål af celler blev resuspenderet med 50 μL PBS.
- Supernatanten fremstillet ved centrifugering i trin 2.5 overføres med pipette til rene ultracentrifugeglas. Der centrifugeres ved 1,50,000 x g i 2 timer ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres, og resten, som er Exos, opsamles. Resuspender Exos fra syv skåle af celler i 50 μL PBS.
BEMÆRK: De sjette passage UCMSC'er bruges til EV-isolering. For at få nok MV'er og Exos til eksperimentel brug er der normalt brug for 7-8 retter af dyrkede celler. EV-prøverne anvendes straks til følgende karakteriseringstrin eller til terapeutisk anvendelse, som bedre ikke opbevares.
FORSIGTIG: Undgå gentagen frysning og optøning af elbiler, og det er bedst at opbevare elbiler ved 4 °C på kort sigt og ikke ved -80 °C.
3. Påvisning af partikelantal og størrelsesfordeling af elbiler fra MSC'er
BEMÆRK: Til evaluering af størrelsesfordeling udføres nanopartikelsporingsanalyse (NTA) af en kommercielt tilgængelig nanopartikelsporingsanalysator (se materialetabel).
- Fortynd 1 μL elbiler (fra trin 2.5 og trin 2.7) i 1.499 μL PBS og bland nok i et 15 ml rør.
- Betjen sporingsanalysatoren ved at følge producentens anvisninger. Start først den kompatible software (se materialetabellen).
- Fyld prøvecellen med destilleret vand, og lad derefter instrumentet starte cellekontrollen.
- Kalibrer instrumentet med en forberedt standardopløsning. Sørg for, at partikelantallet, der vises på softwaredetekteringsgrænsefladen, er mellem 50-400 (helst omkring 200). Klik på OK.
BEMÆRK: Forbered standardopløsningen ved at rekonstituere 1 μL kalibreringsopløsning (se materialetabel) i 1 ml destilleret vand for at generere en primæropløsning, og tag derefter 100 μL af den primære opløsning og tilsæt 25 ml destilleret vand for at forberede en standardopløsning (1:250.000). Dette fungerende reagens opbevares ved 4 °C i en uge. - Prøvecellen skylles med 5 ml destilleret vand.
- Før prøveanalyse skylles kanalen med 1 ml destilleret vand. Sørg for, at partikelnummeret, der vises på softwaredetekteringsgrænsefladen, er mindre end 10.
- Der injiceres 1 ml af EV-prøven fremstillet i trin 3.1. Udfør vesikeltest i henhold til instrumentets betjeningsvejledning.
FORSIGTIG: Prøven og destilleret vand injiceres med en 1 ml sprøjte med en konstant hastighed på 0,5 ml / s under omhyggelig manuel kontrol.
4. Karakterisering af EV-morfologi ved transmissionselektronmikroskop (TEM)
- Fortynd 1 μL elbiler fra trin 2.7 i 199 μL PBS og bland nok. Tilsæt 20 μL EV-affjedringsdråber til formvar/carbon-coated kvadratisk mesh (se materialetabel), og lad det forblive i 3 min.
- Fjern overskydende væske med et lille filterpapir, og lad det forblive i 15 s for at tørre overfladen lidt.
- Negativt plet EV-prøver med 1.5% phosphotungssyredråber i 40 s.
- Fjern overskydende phosphowolframsyre og lad den stå i 15 s for at tørre overfladen lidt.
- Prøven indeholdende formvar/kulstofbelagt kvadratisk maske anbringes i en ren skål dækket med filtrerpapir. Observer og tag billeder med et transmissionselektronmikroskop.
BEMÆRK: I denne proces tages Exos som et eksempel.
5. Mærkning af MSC-afledte elbiler
- Efter ekstraktion af elbiler (trin 2.5) resuspenderes med 250 μL PBS i et 1,5 ml konisk rør.
- Brug et andet 1,5 ml konisk rør til fremstilling af arbejdsløsningen af PKH26-farvestoffet; brug 1 μL PKH26-mærkningsreagens fortyndet med 250 μL fortyndingsmiddel C (en komponent i det kommercielt tilgængelige EV-mærkningssæt, der anvendes til denne undersøgelse, se materialetabel).
BEMÆRK: Forbered arbejdsløsningen umiddelbart før brug.
FORSIGTIG: Overdreven PKH26-farvestof eller mærkning uden forfortynding risikerer at beskadige elbilerne. - Bland de ophængte elbiler med arbejdsløsningen. Lad det stå ved stuetemperatur i 5 minutter, og tilsæt derefter 500 μL EV-udarmet FBS for at stoppe reaktionen.
- For MV'er centrifugeres ved 4 °C, 16.000 x g i 30 min, og supernatanten kasseres med en pipette. Tilsæt 1 ml PBS for at skylle resten.
- Der centrifugeres ved 4 °C, 16.000 x g i 30 min., og supernatanten kasseres for at fjerne det ubundne farvestof.
- Rejsulfart resuspenderes med 200 μl PBS. Drop 20 μL suspension på diaset og observer det under et fluorescensmikroskop.
BEMÆRK: I denne proces tages MV'er som et eksempel.
6. Lokal transplantation og systemisk injektion af MSC-EV'er
BEMÆRK: Ved følgende procedurer skal elbilerne lægges på is før injektion.
- Udfør lokal transplantation ved at følge nedenstående trin.
- Bedøv musene med 4% (vol/vol) isofluran. Oprethold anæstesi ved 1% -3% isofluran under proceduren.
- Før operationen skal du administrere 5 mg/kg carprofen (IP) til analgesi for at minimere postproceduresmerter.
- Før sårudskæring barberes dorsalhåret og steriliseres dorsaloverfladen ved at anvende 3 skiftende runder med 10% povidon-jod og 75% ethanol.
- Brug en biopsistans (se materialetabel) til at skabe et sår i fuld tykkelse på 1 cm i diameter på ryghuden.
- De MSC-afledte elbiler resuspenderes fra to skåle i 100 μL PBS, og injektionen administreres i sårbundens subkutane lag omkring hvert sår med fire steder.
BEMÆRK: Der injiceres i gennemsnit 100 μg elbiler pr. mus (elbiler fra to 10 cm skåle med celler). Ti 10 cm skåle MSC'er er nødvendige for at give nok elbiler til at oprette et eksperiment på n = 5 i en murinmodel. - Efter behandling pakkes musene med sterilt gasbind og placeres på varmeisoleringspuder (se materialetabellen), indtil de vågner op.
- Sørg for, at musene ikke efterlades uden opsyn, før de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed. Returner ikke musene til selskab med andre dyr, før de er kommet sig helt.
- Administrer yderligere doser af analgesi på dag 2 og dag 3 efter operationen efter behov.
- Udfør systemisk injektion.
- Resuspender MSC-afledte elbiler i 200 μL PBS, og bland derefter med heparinopløsning i et volumenforhold på 10:1.
- Placer musene i det kaudale venebilleddannelsessystem (se materialetabel). Tryk på kontakten for at løfte håndtaget.
- Desinficer halevenen med en alkoholpude før IV-injektionen. Derefter injiceres musene systematisk med suspension fremstillet i trin 6.2.1 gennem halevenen. Proceduren er hjulpet af en halevene illustrator.
BEMÆRK: Injicer EV-suspension umiddelbart efter blanding med heparin. Der injiceres i gennemsnit 100 μg EV'er pr. mus (EV'er fra to 10 cm skåle med celler). Ti 10 cm skåle MSC'er er nødvendige for at give nok elbiler til at oprette et eksperiment på n = 5 i en murinmodel.
FORSIGTIG: Infusion af musehalevene er normalt begrænset til 200 μl volumen. Injektionen skal gå langsomt og stoppe, hvis du ser en bump eller modstand, hvilket tyder på, at nålen er ude af venen. Hvis musene viser negative kliniske tegn som krøllen og rysten, kan dette være et chokrespons på højvolumeninjektion, hurtig injektion eller toksicitet / anafylaksi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MV'er og Exos fra dyrkede humane UCMSC'er isoleres efter den eksperimentelle arbejdsgang (figur 1). NTA-resultaterne viser, at størrelsen af Exos fra humane MSC'er varierer fra 40 nm til 335 nm med en topstørrelse på ca. 100 nm, og størrelsen af MV'er varierer fra 50 nm til 445 nm med en topstørrelse på 150 nm (figur 2). Morfologisk karakterisering af MSC-afledte Exos udviser en typisk kopform (figur 3). Elbiler mærkes effektivt af PKH26, hvilket observeres både ved bruttovisningen som mærkede pellets og ved fluorescerende mikroskopi (figur 4). Lokale og systemiske injektioner af MSC-afledte EV'er udføres omkring hudsåret eller gennem den kaudale vene (figur 5). Således isoleres Exos og MV'erne med succes og anvendes til efterfølgende eksperimenter.
Figur 1: Isolering af MV'er og Exos fra dyrkede humane MSC'er. Kulturmedier opsamles, og differentiel centrifugering udføres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: NTA-analyse af Exo'er og MV'er fra MSC'er. Partikelstørrelsesfordeling med repræsentative billeder er afbildet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Morfologisk karakterisering af Exos fra MSC'er af TEM. Kopformede Exos vises. Skalastænger: 200 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Mærkning af MSC-afledte MV'er af PKH26. PKH26-mærkede MV-pellets observeres groft og ses under et fluorescerende mikroskop. Skalabjælke: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Administration af MSC-afledte elbiler. (A) Lokal transplantation omkring hudsåret og (B) Systemisk injektion via kaudalvenen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV'er dukker op til at spille en vigtig rolle i forskellige biologiske aktiviteter, herunder antigenpræsentation, transport af genetisk materiale, cellemikromiljømodifikation og andre. Desuden medfører deres brede anvendelse nye tilgange og muligheder for diagnosticering og behandling af sygdomme21. Implementering af terapeutiske anvendelser af EV'er er baseret på vellykket isolering og karakterisering. På grund af manglen på standardiserede isolerings- og rensningsmetoder og den lave ekstraktionseffektivitet er EV-forskning imidlertid blevet hæmmet. Denne artikel introducerer hovedsageligt en let gennemførlig ekstraktions- og karakteriseringsprotokol for elbiler fra dyrkede humane MSC'er og yderligere applikationer, som kan mærkes og bruges til at fremme vævsreparation via lokal injektion og behandle systemiske sygdomme ved intravenøs injektion. Reproducerbarheden af MSC'er til EV-isolering bevares ved hjælp af UCMSC'ers neonatale oprindelse, standardkultur af celler og ingen sene passager. Selvom udtrykket Exos og MV'er bruges i dette manuskript til at henvise til EV'er indsamlet fra differentielle centrifugeringshastigheder, vil der være behov for flere assays i de fremtidige undersøgelser for at skelne deres oprindelse, som anbefalet af retningslinjen Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles (MISEV2018)22 , såsom ved levende cellebilleddannelse til observation af produktionsprocessen og ved immunoelektronmikroskop til påvisning af de specifikke markører. Samlet set er metoden enkel og dermed let skalerbar og reproducerbar, hvilket vil være nyttigt for feltet.
I denne undersøgelse adskilles fysiologiske elbiler fra MSC'er gradvist i MV'er og Exos ved differentiel centrifugering og ultracentrifugering. Her understreges betydningen af at erstatte α-MEM suppleret med 20% EV-udtømt FBS til indsamling af kulturmediet. Dette trin sikrer, at de ekstraherede elbiler kun stammer fra MSC'er, hvilket udelukker muligheden for, at elbiler kan være fra andre forstyrrende stoffer. Det er også vigtigt at blande 10% heparinopløsning i EV-opløsningen før systemisk injektion. I de senere år har flere undersøgelser vist, at elbiler har en prokoagulerende virkning, så det er nødvendigt at tilføje heparin under systemisk injektion for at undgå dannelse af trombose efter injektion, hvilket ellers fører til akut dødelighed hos mus23. Der kan være nogle problemer under denne protokolimplementering, der kræver fejlfinding. For et fremtrædende eksempel, hvis ekstraktionsmængden af EV'er ikke er nok, bør forskere spore den tilbage til cellesupernatantindsamlingstrinnet. Under opsamlingen af supernatanter skal cellerne blæses jævnt for fuldt ud at opsamle de frigivne elbiler, der er tilbageholdt i MSC'ernes ekstracellulære matrix. En anden potentiel fejl opstår, når mus dør kort efter injektion af elbiler. Ud over tilsætning af heparin før injektion skal koncentrationen af injicerede EV'er (i gennemsnit 100 μg EV'er pr. Mus) justeres. For at verificere injektionens succes kan der udføres in vivo-billeddannelse af biodistribution af fluorescensmærkede EV'er eller frosne sektioner af specifikke vævssteder for engraftment (leveren, milten osv.), Som tidligere blev rapporteret24. Det anbefales også, at elbiler anvendes så hurtigt som muligt efter isolering, og frysning af lagre vil medføre partikeltab, renhedsreduktion og fusionsfænomener, der fører til artefaktuelle partikler25. Desuden vil den almindeligt vedtagne PKH26-mærkning øge EV-størrelsen26, og andre mærkningsmetoder kan bruges til sammenligning.
De eksisterende protokoller til isolering af elbiler rapporteres hovedsageligt som følger: differentiel og densitetsgradient ultracentrifugering9, ultrafiltreringsproces 10, immunomagnetisk separation11, molekylær udelukkelseskromatograf 12, mikrofluidisk chip 13 og polymerbaseret udfældningsteknologi27. Sammenlignet med ultracentrifugering er ultrafiltreringsprocessen en bekvem ekstraktionsmetode og befordrende for berigelse af elbiler i prøver med større volumen 9,10, mens ulempen er, at der er membranforurening, hvilket er let at forårsage prøvetab. Immunomagnetisk adskillelse er egnet til adskillelse af forskellige undertyper af EV'er, og de opnåede EV'er har høj renhed. Ulempen ved denne metode er den høje pris med lavt udbytte11. EV'erne adskilt af molekylær udelukkelseskromatograf har høj renhed og højt udbytte. Ulempen er, at der kræves specielt udstyr, og at det ikke kan bruges til flere prøver på samme tid12. Mikrofluidiske chips har høje krav til materialer og teknologi med høje omkostninger, og det er vanskeligt at behandle store prøver13. De elbiler, der adskilles af polymerbaseret nedbørsteknologi, indeholder ikke-EV-forurenende stoffer, der vil påvirke EV-aktiviteten14. Blandt dem er differentiel centrifugering og ultracentrifugering stadig den mest anvendte metode til separation og oprensning af elbiler og betragtes som guldstandarden for MSC-EV-ekstraktion. Adskillelse og berigelse af elbiler fra MSC-kulturmedier opnås trin for trin gennem kombinationen af forskellig centrifugeringstid og -hastighed, hvilket repræsenterer en optimeret metode. Det er bemærkelsesværdigt, at Exos og MV'er isoleret i dette manuskript har lignende størrelsesfordelinger, selvom MV'er har tendens til at være større, hvilket kan skyldes differentiel centrifugering, der har tendens til at inducere aggregering af nanopartikler. Selv om modificerede metoder kan fungere bedre i størrelsesvedligeholdelse af elbiler, er differentiel centrifugering fordelagtig i høj effektivitet til EV-separation28. Selvom denne metode til storskalaproduktion af elbiler og GMP-produktion er begrænset af mængden af medier, der kan behandles i en isolationskørsel, er det tekniske system let at konfigurere og er blevet anvendt af translationelle projekter på store dyr29,30. Under alle omstændigheder har ovennævnte separationsmetoder deres fordele og ulemper, og forskere kan vælge den passende metode i henhold til de forskellige kilder til elbiler og forskningsmålet.
I de senere år har elbiler vist stort potentiale i kliniske applikationer, såsom sygdomsdiagnose31, behandling og som bærere af lægemiddelafgivelse32,33. Baseret på deres fordelagtige egenskaber har forskellige lande bredt studeret elbiler som terapeutiske midler. I denne henseende er der foretaget undersøgelser af EV'er i sygdomsbehandling og den mekanisme, der ligger til grund for EV'ers rolle i patogenesen af sygdommen. Den nuværende protokol for isolering, karakterisering og terapeutisk anvendelse af EV'er fra dyrkede MSC'er er blevet anvendt godt. For eksempel fremmer lokal levering af MSC-Exos i hudsår heling ved inflammatorisk modulering, og haleveneinjektion af MSC-afledte EV'er kan forbedre leverinsulinresistens og steatose i type 2-diabetes mellitus24. Desuden er terapeutiske anvendelser, der involverer øget udbytte og renhed af MSC-EV'er, i horisonten for at tilvejebringe gennemførlige translationelle strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (32000974, 81930025 og 82170988) og China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 og BX20190380). Vi er taknemmelige for hjælpen fra National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) og Analytical and Testing Central Laboratory of Military Medical Innovation Center of Air Force Medical University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
References
- Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).
- Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
- Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
- Lei, L. M., et al.
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
- Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
- Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).
- Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).
- He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).
- Cheng, L., Hill, A. F.
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
- Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
- Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
- Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).
- Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).
