Summary
난자 전기천공을 사용하여 닭 배아의 청각 내이와 달팽이관 핵을 선택적으로 형질감염시켜 회로 조립의 개별 기간 동안 깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질의 세포 그룹 특이적 녹다운을 달성하는 방법을 고안했습니다.
Abstract
깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질 (FMRP)은 국소 단백질 번역을 조절하는 mRNA 결합 단백질입니다. FMRP 손실 또는 기능 장애는 지적 장애, 감각 이상 및 사회적 의사 소통 문제를 특징으로 하는 취약 X 증후군(FXS)에서 비정상적인 신경 및 시냅스 활동을 유발합니다. FMRP 기능 및 FXS 발병 기전에 대한 연구는 주로 형질 전환 동물에서 Fmr1 (FMRP를 코딩하는 유전자) 녹아웃으로 수행되었습니다. 여기에서 우리는 닭 배아를 사용하여 회로 조립 및 시냅스 형성 기간 동안 FMRP의 세포 자율 기능을 결정하는 생체 내 방법을 보고합니다. 이 방법은 Fmr1 소형 헤어핀 RNA(shRNA) 및 EGFP 리포터를 포함하는 약물 유도성 벡터 시스템의 단계, 부위 및 방향 특이적 전기천공을 사용합니다. 이 방법을 통해 우리는 청각 신경절 (AG)과 뇌간 표적 중 하나 인 핵 목장 세포 (NM)에서 선택적 FMRP 녹다운을 달성하여 AG-NM 회로 내에서 구성 요소 별 조작을 제공했습니다. 또한 형질주입의 모자이크 패턴은 동물 내 대조군과 이웃 뉴런/섬유 비교를 가능하게 하여 데이터 분석의 신뢰성과 민감도를 향상시킵니다. 유도성 벡터 시스템은 축적된 발달 효과를 최소화하기 위해 유전자 편집 발병의 시간적 제어를 제공합니다. 이러한 전략의 조합은 시냅스 및 회로 개발에서 FMRP의 세포 자율 기능을 해부하는 혁신적인 도구를 제공합니다.
Introduction
취약 X 증후군(FXS)은 지적 장애, 감각 이상 및 자폐 행동을 특징으로 하는 신경 발달 장애입니다. 대부분의 경우 FXS는 초기 배아 단계1에서 시작하여 취약한 X 정신 지체 단백질 (FMRP, Fmr1 유전자에 의해 암호화 됨)의 전반적인 손실로 인해 발생합니다. FMRP는 일반적으로 뇌의 대부분의 뉴런과 신경교 세포와 감각 기관 2,3,4에서 발현되는 RNA 결합 단백질입니다. 포유류의 뇌에서 FMRP는 다양한 신경 활동에 중요한 단백질을 암호화하는 수백 개의 mRNA와 관련이있을 수 있습니다5. 기존의 Fmr1 녹아웃 동물에 대한 연구는 FMRP 발현이 시냅스 신경 전달의 조립 및 가소성에 특히 중요하다는 것을 보여주었습니다6. 여러 조건부 및 모자이크 녹아웃 모델은 축삭 투영, 수지상 패턴 및 시냅스 가소성을 포함한 여러 발달 이벤트 동안 FMRP 작용 및 신호가 뇌 영역, 세포 유형 및 시냅스 부위에 따라 다양하다는 것을 추가로 입증했습니다. 7,8,9,10,11,12,13,14 . 시냅스 전달을 조절하는 FMRP의 급성 기능은 뇌 슬라이스 또는 배양 된 뉴런에서 억제 성 FMRP 항체 또는 FMRP 자체의 세포 내 전달에 의해 연구되었다 15,16,17,18. 그러나 이러한 방법은 개발 중 FMRP 오발현으로 인한 결과를 추적하는 기능을 제공하지 않습니다. 따라서, FMRP의 세포 자율 기능을 조사하기 위한 생체내 방법의 개발이 절실히 필요하며, FXS 환자에서 보고된 이상이 관련 뉴런 및 회로에서의 FMRP 손실의 직접적인 결과인지, 또는 발달 중 네트워크 전반의 변화로부터 유도된 이차적 결과인지를 결정하는 데 도움이 될 것으로 기대된다(19).
닭 배아의 청각 뇌간은 회로 및 시냅스 발달에서 FMRP 조절에 대한 심층 기능 분석에 매우 유리한 모델을 제공합니다. 배아 닭의 뇌에 쉽게 접근 할 수 있고 유전자 조작을위한 난자 전기 천공 기술에 잘 정립 된 기술은 초기 배아 단계의 뇌 발달에 대한 우리의 이해에 크게 기여했습니다. 최근에 발표 된 연구에서이 기술은 FMRP 오발현20,21의 시간적 제어를 허용하는 고급 분자 도구와 결합되었습니다. 여기서, 방법론은 시냅스 전 뉴런과 시냅스 후 뉴런의 선택적 조작을 개별적으로 유도하기 위해 발전됩니다. 이 방법은 청각 뇌간 회로에서 개발되었습니다. 음향 신호는 청각 내이의 유모 세포에 의해 감지 된 다음 청각 신경절 (AG, 포유류에서는 나선형 신경절이라고도 함)으로 전달됩니다. AG의 양극성 뉴런은 말초 과정으로 유모 세포를 자극하고 차례로 중앙 투영 (청각 신경)을 뇌간으로 보내 두 개의 주요 달팽이관 핵 인 마그노 셀룰라 핵 (NM)과 각진 핵 (NA)에서 끝납니다. NM의 뉴런은 구조적으로나 기능적으로 포유류 전방 복부 달팽이관 핵의 구형 덤불 세포와 비슷합니다. NM 내에서 청각 신경 섬유(ANF) 시냅스는 헬드 말단22의 큰 말단을 통해 NM 뉴런의 체세포에 있습니다. 발달 동안, NM 뉴런은 후뇌23의 능형 5 및 6 (r5/6)에서 발생하는 반면, AG 뉴런은 이낭24에 존재하는 신경 모세포로부터 유래된다. 여기에서는 시냅스 전 AG 뉴런과 시냅스 후 NM 뉴런에서 FMRP 발현을 선택적으로 녹다운하는 절차를 별도로 설명합니다.
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Protocol
계란과 닭 배아는 지난 대학 동물 관리 및 사용위원회에서 승인 한 동물 프로토콜에 따라주의와 존중으로 처리되었습니다.
1. 계란 및 플라스미드 제제
- 계란 준비
- 화남농업대학교에서 신선한 닭고기 수정란(갈루스 갈루스)을 구해 배양 전 16°C에서 보관한다. 최적의 생존력을 위해 도착 후 일주일 이내에 배양을 위해 모든 알을 설정하십시오.
- 알을 수평으로 놓고 햄버거와 해밀턴(HH) 단계 12신경 관 형질감염이 될 때까지 46-48시간 동안 또는 이낭 형질감염에 대해 HH13까지 54-56시간 동안 38°C에서 배양합니다. 난자의 동물 극은 식물 기둥보다 가볍기 때문에 수평 배치는 쉽게 조작할 수 있도록 배아를 난자 상단에 배치합니다. 이 단계와 다음 모든 단계에서 계란을 수평으로 유지하도록주의하십시오.
- 배아의 위치는 손전등을 사용하여 난자 바닥에서 빛을 비출 때 달걀 껍질의 어두운 영역으로 나타납니다. 원하는 HH 단계에서이 손전등 방법을 사용하여 달걀 껍질에 배아의 위치를 연필로 표시하십시오.
- 75 % 에탄올이 함유 된 거즈로 계란을 닦으십시오. 가위 끝으로 계란의 뾰족한 끝에 구멍을 뚫고 18G 바늘 주사기로 알부민 2mL를 제거합니다. 구멍이 바늘 삽입이 가능할 만큼만 큰지 확인하십시오. 새는 알부민을 거즈로 닦아내고 투명 테이프로 구멍을 막으십시오.
- 균열을 최소화하고 창 작업 중에 떨어지는 껍질 파편을 방지하려면 연필로 표시된 어두운 부분을 중심으로 투명 테이프로 계란 상단을 덮으십시오.
- 플라스미드 DNA 추출
- 앞서 설명한 바와 같이 트랜스포존계 Tet-on 시스템을 사용하여 닭 Fmr1 shRNA를 클론화한다(20). 이 시스템은 pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 및 pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA의 세 가지 플라스미드를 포함하며, 형질감염 후 Fmr1 shRNA 및 EGFP의 발현이 침묵되고 독시사이클린(Dox) 유도에 의해 켜질 수 있는 약물 유도성 벡터 시스템을 제공합니다.
참고: 이러한 플라스미드는 현재 저장소에서 사용할 수 없습니다. 저자는 합리적인 요청에 따라 플라스미드를 제공하는 데 동의합니다. - 제조업체의 지침에 따라 내독소가 없는 준비 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하고 1/15 부피의 7.5M 아세트산나트륨과 1부피의 100% 이소프로판올을 추가하여 침전시킵니다.
- 플라스미드를 -20°C에서 밤새 침전시키고 13,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 키트에 제공된 Tris-EDTA 버퍼로 펠릿을 최종 농도 4-5μg/μL로 용해합니다. 플라스미드는 형질주입 효율 감소 없이 -20°C에서 12개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 전기천공 당일, 피펫 팁을 사용하여 멸균 원심분리 튜브에 각 플라스미드 2μL를 완전히 혼합합니다. 생성 된 6 μL 부피의 플라스미드 혼합물은 3 개의 알을 전기 천공하기에 충분합니다. 전기천공 중에 플라스미드를 시각화하는 데 도움이 되도록 DNA 혼합물26의 6μL마다 0.1% 고속 녹색(멸균 ddH2O에서 준비)의 1μL를 추가하여 플라스미드 혼합물을 파란색으로 바꿉니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 트랜스포존계 Tet-on 시스템을 사용하여 닭 Fmr1 shRNA를 클론화한다(20). 이 시스템은 pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 및 pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA의 세 가지 플라스미드를 포함하며, 형질감염 후 Fmr1 shRNA 및 EGFP의 발현이 침묵되고 독시사이클린(Dox) 유도에 의해 켜질 수 있는 약물 유도성 벡터 시스템을 제공합니다.
2. 오보 전기 천공에서
- 계란 창 및 배아 식별
- 전기 천공 당일에 인큐베이터에서 알을 한 번에 12 개의 알을 제거하십시오. 알을 인큐베이터에서 1시간 이상 방치하면 발달 변화가 발생하고 생존력이 감소합니다.
- 75 % 에탄올이 함유 된 거즈로 모든 수술 도구를 닦으십시오.
- 각 계란을 맞춤형 폼 홀더에 넣으십시오. 테이프로 덮인 부분을 75 % 에탄올로 닦고 작은 가위를 사용하여 연필 자국 둘레의 창 (1-2cm2)을 자릅니다 (그림 1A). 절단 할 때 아래의 배아가 손상되지 않도록 가위를 평평하게 잡으십시오.
- 창문이 있는 난자를 10배 접안렌즈와 2배 줌이 있는 실체 현미경 아래에 놓고 배아를 식별합니다. 더 나은 시각화를 위해 광원의 각도와 밝기를 조정합니다.
참고: 이 단계에서 배아를 시각화하고 신경관을 식별하려면 연습과 경험이 필요합니다.- 초보자의 경우 배아 식별을 용이하게 하기 위해 다음 선택적 잉크 주입을 사용하십시오. 0.01M 인산염 완충 식염수(PBS)와 오토클레이브에 10% 인도 잉크 용액을 미리 준비합니다. 1mL 주사기에 잉크 용액을 채운 다음 27G 바늘을 맞춥니다. 집게로 바늘을 45° 각도로 구부립니다.
- 현미경으로 오파카 영역의 가장자리에서 조심스럽게 찌르고 배아 아래에 바늘을 삽입하십시오. ~50μL의 잉크를 주입하면 배아 시각화를 위해 펠루시다 영역 아래로 확산됩니다. 잉크는 배아의 명확한 시각화를 위해 어두운 배경을 형성합니다.
알림: 삽입 및 주입하기 전에 주사기에서 공기를 배출하십시오. 시각화에 능숙한 경우 잉크 주입 단계는 생존율을 감소시키므로 피하십시오.
- 신경관 주입 및 전기 천공
참고: 이 절차는 뇌간의 NM 뉴런을 형질주입하기 위해 HH12에서 수행됩니다.- 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관(직경 ~1mm, 길이 100mm)을 피펫으로 당깁니다. 해부 현미경으로 모세관 바늘의 끝을 집게로 직경 10-20 μm로 조심스럽게 엽니 다. 사용할 때까지 피펫 (보통 한 번에 5-10 개)을 보관 상자에 보관하십시오.
- 피펫 끝에 있는 고무 튜브를 통해 음압을 가하여 0.5-1μL의 플라스미드 혼합물로 모세관 피펫을 채웁니다. 이것은 주사기 또는 공기 펌프로 달성 할 수 있습니다.
- 배아가 꼬리를 가까이에 두고 수직으로 향하도록 (또는 3축 조작기를 사용하여 모세관 피펫을 주입하기 위해 수평으로) 계란을 현미경 아래에 놓습니다. 한 손 또는 3축 매니퓰레이터로 모세관 피펫을 잡고 피펫 끝을 꼬리에서 머리 방향으로 r5/6으로 움직입니다.
참고: 가장 앞쪽 뒷뇌 영역은 r1이고 신경관을 따라 각각의 후속 돌출부는 개별 마름모꼴입니다. R5/6은 쉽게 알아볼 수 있는 컵과 같은 구조인 이낭과 동일한 전후 수준에 있습니다(그림 1B-C). - 팁을 유리막 막을 통해 등쪽 신경관으로 부드럽게 찌른 다음 피펫을 약간 빼서 팁이 신경관의 내강에 오도록 합니다. 착색된 플라스미드가 r5/6으로 완전히 확산되고 r3 및 r4로 확장될 때까지 공기 압력을 가하여 플라스미드 혼합물을 주입합니다.
알림: 주입을 위해 vitelline 멤브레인에 슬롯을 만들 필요는 없습니다. - 파란색 플라스미드 용액이 누출 없이 신경관 아래로 빠르게 확산될 때 성공적인 주입이 이루어지는지 확인합니다(그림 1B-C). 누출이 발생하면 파란색이 빠르게 사라집니다.
- 주입 직후 백금 양극성 전극을 신경관의 양쪽에 놓습니다(그림 1D). 전기 천공기로 12V 및 50ms 지속 시간의 두 가지 펄스를 제공합니다. 양극성 전극의 끝에서 기포를 관찰하고 음극에 더 많은 것을 관찰하십시오.
- 착색 된 플라스미드 혼합물이 전극의 양극 근처의 신경관 조직으로 들어갈 때 달성되는 성공적인 전기 천공을 확인하십시오. 전기 천공 후 바이폴라 전극을 조심스럽게 제거하십시오.
- 달걀 껍질의 창을 사각형으로 2 개로 미리 자르고 75 % 에탄올로 뿌린 투명 필름 조각으로 덮으십시오. 계란을 인큐베이터에 다시 넣으십시오.
- 다음 계란으로 진행하기 전에 식염수에서 12V 및 50ms 지속 시간의 10-20펄스를 전달하여 양극성 전극을 청소하십시오.
- 이주머니 주사 및 전기천공
알림: 이 절차는 내이의 유모 세포와 AG 뉴런을 형질주입하기 위해 HH13에서 수행됩니다.- HH13(~배아 2.5일)에 배아가 회전하여 머리의 오른쪽이 위를 향하게 합니다. 현미경으로 배아가 수직이되고 꼬리가 가까이에 있도록 알을 놓습니다. 모세관 피펫을 잡고 오른쪽 이낭을 등쪽 방향으로 부드럽게 찔러줍니다(그림 2A).
알림: 이 단계에서 이낭은 r5/6과 동일한 전후 수준에서 신체 상단에 작은 원형 구조로 나타납니다. - 이주머니가 청색 용액27로 채워질 때까지 플라스미드 혼합물을 공기 압력으로 주입한다. 파란색 플라스미드 혼합물이 이낭 내에 갇혀 누출되지 않을 때 달성되는 성공적인 주사를 확인하십시오.
- 주사 직후, 도 2B에 묘사된 바와 같이 이주머니에 양극성 전극을 놓는다. 양측과 음측을 각각 이염의 앞쪽과 뒤쪽에 위치시킵니다. 전기천공기로 12V 및 50ms 지속 시간의 두 가지 펄스를 제공합니다.
- 파란색 플라스미드 혼합물이 전극의 양극 근처의 이낭 조직에 들어갈 때 달성되는 성공적인 전기 천공을 확인하십시오. 전기 천공 후 바이폴라 전극을 조심스럽게 제거하십시오. 달걀 껍질의 창을 투명 필름으로 덮고 달걀을 인큐베이터로 되돌립니다.
- HH13(~배아 2.5일)에 배아가 회전하여 머리의 오른쪽이 위를 향하게 합니다. 현미경으로 배아가 수직이되고 꼬리가 가까이에 있도록 알을 놓습니다. 모세관 피펫을 잡고 오른쪽 이낭을 등쪽 방향으로 부드럽게 찔러줍니다(그림 2A).
3. 플라스미드 전사를 개시하고 유지하기 위한 Dox 투여
- Dox 용액의 제조
- 화학 후드 아래에서 Dox 분말 100mg을 측정하고 멸균 PBS 100mL에 용해시켜 1mg/mL의 작업 용액을 만듭니다. 0.22μm 필터로 용액을 여과하고 -20°C에서 1mL 분취량을 보관합니다. 빛으로부터 보호하십시오20,28.
- 독스 관리
- 완전한 강도의 유전자 편집을 위해, 원하는 나이 24시간 전에 얼음에서 Dox 분취액을 해동합니다. 투명 필름을 관통하는 주사기를 사용하여 50μL의 Dox를 계란의 융모막 막에 직접 떨어 뜨립니다. 주입 후 투명 필름이나 테이프로 바늘 구멍을 밀봉하십시오.
- 녹다운 효과를 유지하려면 원하는 발달 단계에서 조직이 수확될 때까지 격일로 Dox를 투여하십시오.
4. 조직 해부 및 절편
- 뇌간
- 배아 단계 3 (E3) 및 E6의 배아의 경우 달걀 껍질을 열고 가위로 관련 막을 자릅니다. 배아를 숟가락으로 떠서 0.1M 인산염 완충액의 4% 파라포름알데히드(PFA)에 담그십시오.
- E9 배아의 경우 달걀 껍질을 열고 가위로 배아를 참수하고 머리를 PBS로 채워진 실리콘 바닥 판으로 옮깁니다. 궤도를 통해 머리를 고정하고 두개골의 상단을 잘라냅니다. 집게를 양쪽에서 뇌 아래에 조심스럽게 놓고 집게의 어깨로 두개골에서 전체 뇌를 들어 올립니다. 뇌를 4 % PFA에 담그십시오.
- E15 및 E19 배아의 경우 달걀 껍질을 열고 가위로 배아를 참수하고 PBS로 채워진 실리콘 바닥 판에 머리를 놓습니다. 두개골을 노출시키기 위해 머리 위의 피부를 자릅니다.
- 면도기로 두개골을 수직으로 절개하여 전뇌와 꼬리 뇌를 분리합니다. 꼬리 블록을 PBS에 담그고 두개골의 상단을 제거한 다음 두개골에서 뇌를 제거합니다.
- 시엽을 통해 뇌를 고정하고 소뇌와 뇌간을 분리합니다. 소뇌 바로 아래에있는 청각 뇌간이 손상되지 않도록주의하십시오. 뇌간에서 가능한 한 많은 경막을 제거한 다음 4 % PFA에 담그십시오.
- 배아와 뇌 조직을 4 ° C에서 밤새 4 % PFA에 보관하고 E19 뇌간을 제외하고 24 시간 동안 동일한 조건으로 유지해야합니다.
- 고정 후 30 % 자당을 함유 한 PBS에서 조직을 침전 될 때까지 탈수하며, 일반적으로 연령에 따라 1-3 일이 걸립니다.
- 뇌간(E15 및 E19)을 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 코로나 평면에서 30 μm로 절편화하였다. PBS에서 절편을 수집하고 면역 염색 전에 4 ° C에서 보관하십시오.
- E3 및 E6 배아와 E9 뇌간의 경우 가로 방향으로 50μm로 절단됩니다. PBS에서 섹션을 수집하고 4 ° C에서 보관하십시오. 면역 염색 전에 젤라틴 코팅 현미경 슬라이드에 섹션을 장착하십시오. 이 연령대에 대해 더 두꺼운 부분을 수집하면 조직 처리가 용이합니다.
- 청각 덕트
- E9, E15 및 E19 배아에서 뇌간을 제거한 후 측두골에 박힌 청각 덕트는 두개골 아래에 쉽게 식별 할 수 있으며 측두골은 주변 두개골에서 쉽게 분리 할 수 있습니다. E9 배아의 경우 전체 측두골을 4 % PFA로 고정하십시오. 오래된 배아의 경우 측두골의 뼈 구조를 제거하여 청각 덕트를 분리하고 청각 덕트를 4 % PFA로 고정하십시오.
- 모든 측두골과 청각 덕트를 조직 삽입 전에 밤새 4 ° C에서 4 % PFA에 보관하십시오.
- 설명 된대로 조직 삽입을 수행하십시오. 다음과 같이 임베딩 용액을 준비하십시오 : 젤라틴 과립이 팽창하고 침전 될 때까지 찬물에 10 % 젤라틴 (소 피부에서)을 담그십시오 (약 30 분). 혼합물을 ~ 50 ° C로 가열하여 젤라틴을 용해시키고 젤라틴 용액에 20 % 자당을 첨가하고 저어 녹입니다. 젤라틴-자당 용액을 4°C에서 최대 한 달 동안 보관하십시오.
- 사용을 위해 젤라틴-자당 용액을 37°C에서 따뜻하게 합니다. 측두골/청각 덕트를 96웰 플레이트의 따뜻한 젤라틴-자당 용액에 37°C에서 가라앉을 때까지 보통 30-60분 동안 담그십시오.
- 12 웰 플레이트의 웰 바닥에 투명 필름 스트립을 깔아 놓습니다. 따뜻한 젤라틴 - 자당 용액 층을 추가하고 응고 될 때까지 기다리십시오. 측두골/청이관을 각 우물로 옮깁니다.
- 따뜻한 젤라틴 - 자당 용액의 두 번째 층으로 조직을 이식하십시오. 조직의 위치가 젤의 중앙에 있고 청각 덕트가 수평으로 향하도록 조정하십시오. 플레이트를 4°C 냉장고로 조심스럽게 옮기고 젤이 단단해질 때까지 기다립니다.
- 투명 필름 스트립을 당겨 젤 조직 블록을 웰 밖으로 옮깁니다. 여분의 젤을 정사각형 블록으로 자르고 블록의 모서리를 잘라 방향을 식별합니다. 젤라틴 블록을 호일 조각으로 감싸고 드라이 아이스에 얼린 다음 절편 될 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
- 저온 유지 장치로 청각 덕트의 경도를 따라 20μm에서 블록을 단면화합니다. 젤라틴 코팅 현미경 슬라이드에 직접 섹션을 장착합니다. 면역염색 전에 슬라이드를 -80°C에서 보관한다.
- 면역염색 전에 슬라이드를 예열된 PBS(45°C)에 5분 동안 담가 젤라틴을 용해시킨 다음 슬라이드를 실온 PBS로 3배 세척하여 잔류 젤라틴을 제거합니다.
5. 면역 염색 및 현미경 이미징
참고: 섹션이 슬라이드에 장착되는지 또는 PBS에 자유 부동되는지에 따라 두 가지 유형의 면역 염색이 수행됩니다.
- 슬라이드의 면역 염색
- PBS로 슬라이드를 각각 3분 동안 10번 세척합니다. 염색 중에 액체가 새는 것을 방지하기 위해 오일 펜으로 섹션이 포함 된 영역에 동그라미를 그립니다. PBS에 5 % 정상 염소 혈청을 함유 한 블로킹 용액으로 섹션을 덮고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 1차 항체(사용된 최종 농도는 재료 표 참조)를 0.3% TritonX-100 및 5% 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS에 희석합니다. 블로킹 용액을 제거한 다음 1차 항체 용액으로 섹션을 덮습니다. 슬라이드를 바닥에 증류수 층을 함유하는 상자에서 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.
- PBS로 슬라이드를 3분 동안 10번 헹굽니다. 0.3% TritonX-100을 함유하는 PBS에 1:500으로 희석된 형광 2차 항체를 슬라이드에 도포합니다. 슬라이드를 실온에서 4시간 동안 배양하고 빛으로부터 보호합니다.
- PBS로 슬라이드를 3 번 씻으십시오. 슬라이드에 장착 매체 두 방울을 부드럽게 떨어뜨리고 커버 슬립으로 섹션을 덮습니다. 커버슬립과 슬라이드 사이에 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.
- 전체 마운트 배아 및 자유 부유 절편에 대한 면역 염색
- 배아/절편을 PBS 3x로 웰 플레이트에서 각각 10분 동안 세척합니다. 원심 튜브에서 0.3 % TritonX-100 및 5 % 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS의 1 차 항체를 희석합니다. 각 배아/절편을 유리 후크가 있는 튜브에 옮기고 4°C에서 밤새 60rpm으로 셰이커에서 배양합니다.
- 배아/절편을 PBS로 3회 세척하여 웰 플레이트에서 각각 10분 동안 세척합니다. 각 배아/절편을 형광 2차 항체 용액으로 채워진 어두운 원심 튜브로 옮기고 셰이커에서 실온에서 4시간 동안 배양합니다.
- 배아/절편을 웰 플레이트에서 PBS로 3배 세척합니다. 브러시를 사용하여 PBS가 포함된 15cm 접시에 젤라틴 코팅 현미경 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 슬라이드가 약간 건조된 후(~5분) 장착 매체를 두 방울 떨어뜨리고 커버슬립을 놓습니다. 커버슬립과 슬라이드 사이에 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오. 이미징을 위해 전체 마운트 조직을 PBS에 보관하십시오.
- 이미징
- 검은색 배경을 제공하는 탄소 분말이 포함된 실리콘 바닥이 있는 접시에 PBS의 전체 마운트 조직을 이미지화합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 상용 이미지 프로세싱 Olympus 소프트웨어 패키지를 사용하여 이미지를 캡처하고 처리한다29.
- 앞서 설명한 대로 컨포칼 현미경으로 슬라이드의 섹션을 이미지화합니다20. 10x, 20x 및 63x 대물렌즈가 있는 단일 초점면에서 단면을 이미지화합니다. 동일한 매개 변수를 사용하여 동일한 동물의 모든 이미지를 캡처합니다. 신호 포화를 피하기 위해 레이저 레벨과 이미징 획득 설정을 조정하도록 주의하십시오.
- 피지 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리를 수행합니다. 설명을 위해 전문 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 이미지 밝기, 대비 및 감마를 조정하십시오.
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Representative Results
다른 부위와 다른 발달 단계에서 난자 전기 천공을 수행함으로써 우리는 청각 주변부 또는 청각 뇌간에서 선택적 FMRP 녹다운을 달성했습니다.
NM의 FMRP 녹다운
닭 Fmr1에 대한 작은 헤어핀 RNA (shRNA)를 앞서 기술된 바와 같이 Tet-On 벡터 시스템 내로 설계하고 클로닝하였다20. in ovo 전기천공을 위한 설정은 그림 1A에 나와 있습니다. 빠른 녹색으로 착색 된 플라스미드 DNA를 HH12에서 r5 / r6 수준으로 신경관에 주입했습니다 (그림 1B-C). 백금 양극성 전극을 r5/6 수준에서 신경관의 양쪽에 배치했습니다(그림 1D). 12V에서 두 개의 펄스가 전달되어 플라스미드를 전극의 양극 근처의 조직으로 구동했습니다. Dox는 Fmr1 shRNA 및 EGFP의 발현을 유발하기 위해 융모막 막에 적용되었습니다. Dox 처리 24시간 후, EGFP는 형광 실체현미경으로 명백하게 나타났다. 그림 1E-F는 Dox가 E2에 적용된 경우 E3에서의 예를 보여줍니다. 횡단면은 후뇌의 한쪽에서 EGFP 발현(EGFP+) 세포의 위치를 확인했습니다(그림 1G-H). 또한, 형질 감염된 세포 그룹이 이경화 포낭 앞쪽에서 발견되었습니다. 이들은 신경관에서 복측으로 이동하는 두개골 신경 볏 세포였습니다(그림 1F). 전기 천공 된 배아는 또한 후기 단계에서 회로 형성을 연구하기 위해 더 오래 배양 될 수 있습니다. E15에서 EGFP는 뇌간에서 관찰되었지만 형질 감염된 쪽에서만 관찰되었습니다 (그림 1I-J). 등쪽 뇌간 수준의 단면은 전기 천공 측면의 NM에 흩어져있는 소수의 EGFP + 뉴런을 보여주었습니다 (그림 1L). EGFP+ 섬유는 NM 뉴런의 표적, 즉 동측(그림 1L)의 등쪽 층류(NL)와 반대측의 복부 NL(그림 1K)에 돌출된 것으로 나타났습니다. Fmr1 shRNA의 녹다운 효과는 인접한 형질주입되지 않은 뉴런과 비교하여 형질감염된 NM 뉴런에서 FMRP 면역 반응성의 현저한 감소에 의해 검증되었습니다(그림 1M-N). 청각 신경절 (AG)에서 뉴런은 형질감염되지 않았지만(EGFP-), AG 뉴런을 둘러싼 일부 신경교 세포는 EGFP+ (그림 1O-P), 아마도 EGFP+ 두개골 신경 볏 세포에서 파생된 것으로 추정됩니다(그림 1F 참조). 따라서, 이 전기천공 전략은 AG-NM 회로에서 시냅스 후 뉴런의 선택적 형질감염을 제공한다.
청각 덕트의 FMRP 녹다운
플라스미드 혼합물을 HH13에서 이주머니에 주입하고(그림 2A), 이어서 전극의 양극을 이낭 앞쪽에 배치하고 음극을 이낭 뒤쪽에 배치하여 전기천공을 실시했습니다(그림 2B). E6의 머리 전체 섹션은 오른쪽 이낭에서 강한 EGFP 형광을 나타냈지만 뇌간에서는 그렇지 않았습니다(그림 2C). E9에서 격리 된 청각 덕트는 덕트 길이 전체에 걸쳐 광범위한 EGFP 형광을 나타 냈습니다 (그림 2D-E). 횡단면에서 EGFP+ 세포는 달팽이관 벽을 따라 있는 기저 유두(BP)와 AG에서 확인되었습니다(그림 2F-G). Fmr1 shRNA의 녹다운 효과는 인접한 형질주입되지 않은 유모 세포(•, 그림 2H-J)와 비교하여 형질감염된 유모 세포(*, 그림 2H-J)에서 FMRP 면역 반응성의 현저한 감소에 의해 검증되었습니다. 지지 세포의 경우, FMRP 면역반응성은 형질감염된 세포와 형질주입되지 않은 세포 모두에서 약하였다(도 2H-J). 유모 세포와 유사하게, FMRP 면역 반응성은 인접한 형질주입되지 않은 뉴런에 비해 형질감염된 AG 뉴런에서 크게 감소했습니다(그림 2K-M).
다음으로 우리는 청각 신경을 통해 뇌간으로 형질 감염된 AG 뉴런의 중심 투영을 추적했습니다. AG에서 Fmr1 shRNA 형질감염의 모자이크 패턴은 발달 닭 내이31에 대한 마커인 Islet-1 면역반응성(도 3A)을 사용하여 E6에서 추가로 확인되었다. 해부 중에 뇌간과 함께 AG의 일부를 추출했을 때 뇌간 내에서 분리된 EGFP+ AG 뉴런과 그 섬유를 동일한 제제에서 현장에서 시각화했습니다(그림 3B-C). NM 수준의 횡단면에서 EGFP+ ANF는 E9(그림 3D)에서 NM에 도달했으며 E15 및 E19에서 지속적으로 관찰되었습니다(그림 3E-F). 고배율 이미지는 E9에서 ANF의 성장 원뿔 모양의 결말을 나타냈으며(그림 3H), E15에서 큰 손바닥 모양의 끝구근을 형성한 후 E19에서 복잡한 가지를 가진 Held 형태의 특성화된 끝구브로 성장했습니다(그림 3I-J). NM 외에도 또 다른 주요 달팽이관 핵인 NA에서도 ANF의 광범위한 가지가 관찰되었습니다(그림 3E). 이것은 동일한 ANF가 닭32에서 NM과 NA 모두를 자극하기 위해 분기되기 때문에 예상되었습니다. 우리는 또한 그림 3E와 같이 하강 전정 핵(VeD)을 포함하여 인접한 전정 세포 그룹으로 들어가는 EGFP+ 섬유를 보았습니다. AG가 형성되는 이낭의 앞쪽 부분을 우선적으로 표적으로 삼기 위해 전기 천공 전극의 위치를 최적화했지만 일부 전정 신경절 뉴런도 형질감염되었습니다. 닭에서 ANF의 마커인 파브알부민에 대한 면역염색은 뇌간의 청각 섬유와 전정 섬유를 구별하는 데 사용할 수 있습니다(그림 3F-G).
요약하면,이 전기 천공 전략은 AG-NM 회로에서 시냅스 전 뉴런의 선택적 형질 감염을 제공하며 유전자 조작 후 개별 말단 수준에서 Held의 endbulb 발달을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1. 치킨 NM의 FMRP 녹다운. (A) 전기 천공 설정 이미지. (B) HH12 닭 배아의 능형 r5/6 수준에서 미세 주입 부위를 보여주는 개략도. 약어 : NT = 신경관; SO = 소마이트. (C) 가시성을 높이기 위해 인디언 잉크 (검정색)를 주사기로 배아 아래에 주입했습니다. 이어서 빠른 녹색으로 착색된 플라스미드 혼합물을 신경관의 내강에 주입하였다. (D) 전기 천공을위한 바이폴라 전극의 위치. + 및 -는 각각 양수 및 음수를 나타냅니다. 참고로, 파란색 플라스미드 혼합물은 전기천공 후 양성 쪽의 신경관으로 확산되었습니다. (E-F) 명시야 (BF) 이미지 (E)는 배아 3 일 (E3)에 전기 천공 된 닭 배아의 EGFP 채널 (F)과 병합되어 이부엽의 동일한 전후 수준에서 신경관에서의 형질 감염을 보여줍니다. Dox는 전기천공 후 E2, 6시간에 적용하였다. 이동하는 두개골 신경 볏 (CNC) 세포는 노란색 화살표로 표시되고 F의 삽입물에서 확대됩니다. 스케일 바 = E의 500 μm, E 및 F에 적용됩니다. 삽입물에 100 μm. (지에이치) 형질감염된 E3 배아의 단면에 Fmr1 shRNA 및 EGFP를 갖는 형질감염된 세포. EGFP+ 세포는 신경관의 한쪽에 갇혀 있었습니다. 절편을 FMRP 면역반응성(회색)으로 이중 염색하였다. 스케일 바 = G에서 40 μm, G 및 H에 적용됩니다. (I-J) BF 이미지 (I)는 E15에서 Dox 처리 후 E8 뇌간의 EGFP 채널 (J)과 병합되었습니다. 스케일 바 = I에서 1mm, 형질주입된(트랜스) 쪽에 EGFP+ NM 뉴런이 있는 E15 뇌간의 I 및 J. (K-L) 단면에만 적용됩니다. 반대쪽(반대쪽)(K)에서 EGFP+ 축삭은 핵층류(NL)의 복부 부분에서 관찰되었습니다. (남-엔) FMRP(빨간색) 및 SNAP25(파란색) 면역염색의 이중 표지를 사용한 E19에서 NM의 고배율 이미지. SNAP25는 Held의 끝 전구에 레이블을 지정하는 시냅스 전 마커입니다. 이웃하는 비형질감염된 뉴런(•)과 비교하여 형질주입된(녹색; *) 뉴런에서 FMRP 면역반응성의 현저한 감소에 주목하십시오. (오피) FMRP 면역 반응성을 갖는 E19에서의 청각 신경절 (AG)의 고배율 이미지. AG 뉴런 (AGN)은 형질감염되지 않았다 (EGFP-). F로 표시된 CNC 세포로부터 유래된 일부 신경교 세포를 형질감염시켰다. 스케일 바 = 10 μm (M)이며 M-P에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 닭 청각 덕트의 FMRP 녹다운. (A) HH13에서 이주머니에 플라스미드의 미세 주입을 보여주는 명시야(BF) 이미지. 인도 잉크 (검정색)는 가시성을 높이기 위해 배아 아래에 주입되었습니다. (B) 전기 천공을위한 바이폴라 전극의 위치. 양성 측면 (더하기 기호, +로 표시)은 otocyst의 앞쪽에 위치하고, 부정적 측면 (빼기 기호, -로 표시)은 otocyst의 뒤쪽에 위치했습니다. (c) E6에서 닭 머리의 횡단면을 FMRP (적색) 및 뉴로필라멘트 (NF; 청색)에 대해 면역염색하였다. Dox는 전기천공 후 E3에서 적용되었습니다. EGFP 형광은 이낭자에서 검출되었지만 뇌간에서는 검출되지 않았습니다. 스케일 바 = 100 μm. (D-E) BF 이미지 (D)는 E9에서 청각 덕트의 EGFP 채널 (E)과 병합되었습니다. 스케일 바 = 500 μm. (F-G) FMRP (빨간색) 및 NF (파란색) 면역 염색이있는 E9 청각 덕트의 횡단면. EGFP+ 세포는 달팽이관 벽, 기저 유두(BP) 및 청각 신경절(AG)에서 관찰되었습니다. 스케일 바 = F에서 50μm, F 및 G에 적용됩니다. (HJ) 형질주입되지 않은 HC(•)에 비해 형질감염된 유모 세포(HC; *)에서 FMRP 면역 반응성이 크게 감소한 E9 BP의 고배율 이미지. NF 양성 섬유(청색)는 AG 뉴런으로부터의 말초 신경 분포였다. (케이엠) FMRP 면역 염색을 사용한 E9에서 AG 뉴런의 고배율 이미지(빨간색). FMRP 면역 반응성은 형질주입되지 않은 뉴런(•)에서 강했고 형질감염된 뉴런(EGFP+; *)에서는 검출되지 않았습니다. 스케일 바 = H에서 50 μm이며 H-M에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 뇌간에서 형질감염된 AG 뉴런의 축삭 추적. 배아는 Fmr1 shRNA의 이주머니 형질감염을 위해 HH13에서 전기천공하였다. Dox 응용 프로그램은 E2에서 시작되었습니다. (A) Islet-1 면역 염색 및 DAPI 카운터 염색이있는 E6 닭 머리의 횡단면. EGFP+ 세포는 청각 신경절(AG)에서 분명했습니다. 별*은 삽입된 여러 AG 뉴런을 나타냅니다. 스케일 바 = A에서 100μm, 삽입에서 10μm. (B-C) 명시야 (BF) 이미지 (B)는 E9 뇌간의 EGFP 채널 (C)과 병합되었습니다. 이 경우 AG (흰색 화살표)의 일부가 청각 뇌간에 연결되었습니다. 노란색 화살표는 삽입된 형질감염된 AG 뉴런(AGN)을 나타냅니다. EGFP+ 섬유는 뇌간의 형질감염된 쪽에서 분명했습니다. 스케일 바 = B에서 1mm, B 및 C에 적용됩니다. 삽입물에 100 μm. (D) 점선으로 C로 표시된 수준에서 E9 뇌간의 단면. EGFP + 청각 신경 섬유 (ANF, 녹색)는 뇌간의 등쪽 가장자리를 따라 확장되어 핵 마그노 셀룰라 리스 (NM)에 접근했습니다. 스케일 바 = 100 μm. (E-G) E15 (E) 및 E19 (F-G)의 EGFP + 섬유. 일부 섬유는 각도 핵 (NA)과 하강 전정 핵 (VeD)에서도 나타났습니다. E19 절편은 ANFs에 대한 마커로서 파브알부민(PV) 면역반응성에 대해 염색하였다. F의 점선 상자는 인셋에서 확대되어 PV 면역 반응성인 EGFP+ ANF를 보여줍니다. 스케일 바 = E에서 100 μm; F에서 50 μm, F 및 G에 적용됩니다. 인셋에서 2 μm. (H-J) E9, E15 및 E19에서 NM에서 ANF 말단의 고배율 이미지로, Held의 말단부의 형성 및 점진적인 성숙을 보여줍니다. 스케일 바 = H에서 5 μm, H-J에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
FMRP의 세포 자율 기능을 결정하기 위해서는 개별 세포 그룹 또는 세포 유형에서 발현을 조작해야합니다. FMRP의 주요 기능 중 하나는 시냅스 형성과 가소성을 조절하는 것이므로 특정 회로의 각 시냅스 구성 요소를 선택적으로 조작하는 것은 시냅스 통신에서 FMRP 메커니즘을 완전히 이해하기 위한 전제 조건입니다. 닭 배아의 난자 전기천공을 사용하여 시냅스 전 AG 뉴런 또는 시냅스 후 NM 뉴런에서 AG-NM 회로에서 FMRP 발현을 표적으로 하는 방법을 시연했습니다. 이를 위해서는 전기 천공을위한 적절한 발달 단계를 선택하고 배아에 전기 천공 전극을 정확하게 배치하는 것이 중요한 단계입니다. NM 뉴런은 HH1223의 r5/6 수준에서 신경관의 신경 전구 세포에서 발생합니다. 같은 단계에서, 두개골 신경 볏 세포는 신경관의 등쪽 끝에서 달팽이관 전정 신경절로 이동하여 미래의 AG 뉴런(33)을 감싸고 있습니다. 따라서 AG의 NM 뉴런과 아교 세포는 모두 신경관에서 파생됩니다. 대조적으로, 유모 세포 및 AG 뉴런은 외배엽24로부터 유래한다. r5/6 수준에 인접한 외배엽은 HH10에서 두꺼워진 다음 침범하여 HH13에서 귀 컵을 형성합니다. 그런 다음 귀 컵이 닫히고 외배엽에서 분리되어 이낭을 형성하고 앞쪽 부분은 청각 감각 기관이되고 뒤쪽 부분은 전정 시스템에 기여합니다. 청각 부분과 전정 부분 모두에서 귀 컵의 복부 부분에 있는 신경모세포 세포가 박리되고 이동하여 달팽이관 전정 신경절을 형성합니다. 이러한 운명 매핑 연구를 바탕으로 우리는 이전에 확립된 전략인 HH12에서 신경관을 전기천공하여 NM 뉴런의 전구체를 형질감염시켰습니다.26,28,34. 이 전략은 뇌간과 AG에서 신경교 세포의 추가 형질감염으로 이어지지만, AG 뉴런 중 어느 것도 형질감염되지 않았습니다. 뉴런 특이적 형질감염은 우리가 이전에 했던 것처럼 Atoh1 프로모터 구동 전략을 사용하여 달성할 수 있습니다.21. AG 뉴런의 선택적 형질감염을 위해, 우리는 HH13에서 이낭을 전기천공하였다. 귀 컵에 주입된 플라스미드는 도 2B에 도시된 바와 같이 전극을 위치시킬 때 유모 세포 및 AG 뉴런 형질감염을 위해 이낭의 앞쪽 부분으로 우세하게 들어갔다. 유모 세포보다 AG 뉴런을 우선적으로 표적화하기 위해, 박리된 신경아세포가35개를 위치하는 전방 이부낭에 인접한 영역에 플라스미드 용액을 직접 주입하는 것이 가능합니다. 그러나, 이 방법은 플라스미드가 주입 후 빠르게 확산되기 때문에 이주머니 주사에 비해 AG 뉴런 형질감염의 효율이 낮다. 이 방법은 또한 주변 머리 중간엽 세포의 추가적인 형질감염을 유도할 수 있다. AG 뉴런보다 유모 세포를 우선적으로 표적으로 삼는 한 가지 방법은 대부분의 신경 아세포 (AG 뉴런 전구체)가이 단계24에서 이낭에서 이동했기 때문에 이주머니 주사 및 HH18 (~ 배아 3 일)로의 전기 천공을 지연시키는 것입니다.
수정을 통해이 방법을 확장하여 전정 시스템을 연구 할 수 있습니다. 전정 신경절 형질감염의 경우, 청각 및 전정 신경절 전구체의 뚜렷한 위치로 인해 이낭의 후방 부분을 형질주입하기 위해 그림 2B 에 표시된 전극의 방향을 반전시켜야 합니다.
닭 배아의 전기 천공은 발달 초기 단계 (배양 첫 주 이내)를 조사하기위한 잘 정립 된 기술입니다. 장기 연구의 경우 생존율이 주요 관심사입니다. E8에서 Dox 치료를 시작할 때 여기에서 발견되는 생존율은 E60에서 ~ 9 %이지만 E30에서는 15 %로 떨어지고 E19에서는 더 낮습니다. 전기 천공 알에서 부화하는 것은 가능하지만 드물며 대부분의 경우 며칠 동안 만 생존 할 수 있습니다. 생존율을 높이려면 다음을 고려해야합니다 : 1) 날카로운 파도 대신 구형파를 제공하는 전기 천공기를 사용하십시오. 2) 알부민 층이 전기 전도도를 촉진 할만큼 두껍지 않은 경우 배아 상단에 멸균 PBS 한두 방울을 바르십시오 (전기 외상을 줄이는 데 도움이됩니다). 3) 성공적인 형질주입을 위해 주사 부위에서 배아를 노출시키기 위한 유리막 막의 개방은 배아에 해를 끼칠 수 있고; 4) 오염 위험을 줄이려면 창을 다시 여는 대신 주사기를 사용하여 파라필름을 찌르고 Dox를 투여합니다. 주입 후 투명 필름을 75 % 에탄올로 닦고 바늘 구멍을 테이프로 덮으십시오. 5) 이주머니 형질감염의 경우, 아래 대동맥 등쪽에 구멍이 뚫리지 않도록 45° 각도의 피펫으로 플라스미드를 배측으로 이낭에 주입합니다. 대동맥 등쪽이 손상되면 출혈로 플라스미드가 플러시되고 사망에이를 수도 있습니다. 6) 가능하면 배아를 시각화하기 위해 인도 잉크를 사용하지 마십시오. 취급이 적고 절차가 적을수록 생존율이 높아집니다.
AG 또는 NM 뉴런을 선택적으로 형질감염시키는 능력 외에도, in ovo 전기천공은 데이터 분석을 위해 이웃 비교를 허용하는 독특한 시스템을 제공한다. 전기천공 후, NM 또는 AG 내의 세포의 서브세트만이 형질감염되어, 동일한 세포 그룹 내의 주변의 형질주입되지 않은 세포가 이상적인 대조군(20)으로서 기능할 수 있게 한다. 이웃 뉴런 간의 잠재적 인 상호 작용이 우려되는 경우, 귀와 뇌의 형질주입되지 않은 쪽의 뉴런 대응 물이 추가 제어 역할을 할 수 있습니다. 조직학 및 영상 연구의 경우 이 결과를 통해 단일 세포 또는 단일 섬유 수준에서 높은 효율로 데이터를 분석할 수 있습니다. 분자 분석은 형광 기반 세포 분류 및 질량 분석 및 차세대 시퀀싱과 같은 대규모 단백질 및 RNA 분석과 결합하면 실현 가능합니다. 그러나 유전자 편집 수단으로 ovo 전기 천공을 사용하는 것은 세포 그룹 내에서 형질 감염된 세포의 비율이 기능적 결과를 초래할 만큼 충분히 크지 않을 수 있기 때문에 기능 및 행동 연구에 어려울 수 있습니다.
in ovo 전기천공 접근법을 채택할 때 두 가지 검증 분석을 수행하는 것이 필수적입니다. 첫째, 관심 단백질에 대한 유전자 편집의 효과를 확인해야합니다. ovo 전기천공에서는 NM 또는 AG에서 뉴런의 하위 집합(즉, 모자이크 패턴)만 형질주입합니다. 형질감염된 뉴런과 형질감염되지 않은 뉴런의 혼합물을 함유하는 균질화된 조직에 대해 웨스턴 블롯을 수행하는 것은 녹다운 효과를 정확하게 반영하기에 충분히 민감하지 않다. 따라서 검증은 면역 세포 화학과 같은 방법을 사용하여 개별 세포 수준에서 수행되어야합니다. 이를 위해 우리는 이전에 닭 FMRP를 인식하는 항체를 생성했습니다. 이 항체의 특이성은 이전 연구30에서 면역세포화학 및 웨스턴 블롯에 의해 검증되었다. Fmr1 shRNA의 녹다운 효과는 인접한 비형질감염된 뉴런과 비교하여 형질감염된 NM 뉴런에서 FMRP 면역 반응성의 강도가 유의하게 감소하는 것을 관찰함으로써 정량적으로 검증되었습니다. 둘째, 스크램블된 RNA 또는 다른 대조군 구축물을 사용하는 대조군을 사용하여 FMRP 오발현20,21의 관찰된 세포 효과의 특이성을 확인해야 합니다. 이 목표를 달성하기 위해 우리는 스크램블된 shRNA를 설계하고, 이를 동일한 Tet-On 벡터 시스템에 클로닝하고, 앞서 설명한 대로 NM 전구체로 전기천공했습니다.20. 스크램블된 shRNA로 형질감염된 NM 뉴런에서의 FMRP 발현은 이웃하는 비형질감염된 뉴런과 비교하여 FMRP 면역반응성의 변하지 않은 강도에 의해 입증된 바와 같이 영향을 받지 않았다. 우리는 또한 축삭 성장, 수지상 가지치기, 말단 형성 및 신경 전달에 대한 Fmr1 shRNA 형질감염의 여러 효과를 확인했습니다(Curnow and Wang, 2022에서 검토)36. 우리는 스크램블된 shRNA가 유사한 변화를 유도하지 못했기 때문에 이러한 효과가 FMRP의 세포 자율 손실에 의해 구체적으로 유도되었다고 결론지었습니다.
결론적으로, in ovo 전기 천공 기술은 청각 귀 뇌간 회로에서 시간적 제어 및 구성 요소 특이성을 가진 선택적 Fmr1 유전자 편집을 가능하게하고 전정 시스템을 조작하도록 수정할 수 있습니다. 발달 생물학에서 잘 확립 된 모델 인 닭 배아에서이 첨단 기술의 개발은 FXS와 같은 정상 및 비정상 조건에서 뇌 발달에 대한 우리의 이해에 계속 기여할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 보조금 (No. 32000697); 광저우 과학 기술 프로그램 (202102080139); 광동 자연 과학 재단 (2019A1515110625, 2021A1515010619); 중앙 대학을위한 기초 연구 기금 (11620324); 지난 대학 교육부 재생 의학 핵심 실험실의 연구 보조금 (No. ZSYXM202107); 중국 중앙 대학 기초 연구 기금 (21621054); 그리고 중국 광동성 의료 과학 연구 재단 (20191118142729581). 지난 대학의 의료 실험 센터에 감사드립니다. 원고를 신중하게 편집해 주신 테라 브래들리 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
References
- Hagerman, R. J., et al.
- Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
- Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
- Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
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