Summary
Denne artikkelen beskriver en immunpaneringsprotokoll for voksne dorsale rotganglier hos mus. Ved å feste antistoffer mot kulturplater, kan vi negativt velge og fjerne ikke-nevronale celler. Vi viser at kulturene er beriket for nevroner ved hjelp av denne protokollen, noe som muliggjør en grundig studie av nevronresponser på manipulasjon.
Abstract
Dorsal rot ganglia (DRGs) er perifere strukturer ved siden av ryggmargens dorsale horn, som huser cellelegemene til sensoriske nevroner, samt forskjellige andre celletyper. Publiserte kulturprotokoller refererer ofte til hele dissosierte DRG-kulturer som nevronale, til tross for tilstedeværelsen av fibroblaster, Schwann-celler, makrofager og lymfocytter. Mens disse hele DRG-kulturer er tilstrekkelige for bildebehandlingsapplikasjoner der nevroner kan skjelnes basert på morfologi eller farging, er protein- eller RNA-homogenater samlet fra disse kulturer ikke primært neuronal opprinnelse. Her beskriver vi en immunpaneringssekvens for dyrkede muse-DRG-er. Målet med denne metoden er å berike DRG-kulturer for nevroner ved å fjerne andre celletyper. Immunopanning refererer til en metode for å fjerne celletyper ved å feste antistoffer mot cellekulturretter. Ved hjelp av disse rettene kan vi negativt velge mot og redusere antall fibroblaster, immunceller og Schwann-celler i kultur. Denne metoden tillater oss å øke prosentandelen av nevroner i kulturer.
Introduction
Dorsale rotganglier (DRG) huser cellelegemene til sensoriske nevroner som innerverer perifert vev. Ved å studere disse nevronene kan vi forstå det mekanistiske grunnlaget for smerte og sensoriske forhold. DRG består imidlertid ikke av nevroner alene, men inneholder også fibroblaster, Schwann-celler, makrofager og andre immunceller1. Til tross for tilstedeværelsen av disse forskjellige celletypene, blir hele DRG-kulturer ofte referert til i litteraturen som neuronal 2,3. Disse kulturene er fortsatt nyttige for nevronundersøkelse ved avbildning eller flowcytometri, noe som vil tillate nevronidentifikasjon ved farging, cellestørrelse og / eller morfologi. For analyser som polymerasekjedereaksjon (PCR) eller vestlig blotting, hvor kulturer homogeniseres for RNA- eller proteinoppsamling, kan tilstedeværelsen av ikke-nevronale celletyper imidlertid forstyrre resultatene. Derfor er det behov for å øke andelen nevronceller i DRG-kulturer.
Immunopanning er en teknikk som brukes til å rense en rekke celletyper, inkludert kortikale nevroner, astrocytter, oligodendrocyttforløperceller og mikroglia. Med enkle ord innebærer det å feste et antistoff mot en celleoverflatemarkør til en petriskål, beregnet på å binde visse celler (figur 1), og det kan brukes til å velge enten for eller mot celletyper av interesse 4,5,6. Immunopanning av embryonale DRG-er fra rotter for å selektere mot ikke-nevronale celler har tidligere blitt beskrevet av Zuchero7. Vi har imidlertid ikke vært i stand til å finne en immunopanning protokoll spesifikk for mus DRGs. I denne protokollen bygger vi på de grunnleggende leietakerne i Zuchero-protokollen, men tilpasset i stedet immunpaneringssekvensen for å berike voksne muse-DRG-kulturer (figur 2). Dette er et kraftig verktøy for å studere etablerte sensoriske nevroner i kultur. Det er fordelaktig da det tillater bruk av voksne mus fra genetiske, sykdoms- og skademodeller, slik at deres sensoriske nevroner kan studeres med større spesifisitet.
Denne protokollen er fordelaktig for lesere som ønsker å øke andelen nevroner i voksne mus DRG-kulturer. Imidlertid kan immunpaneringstrinnene også utelates, og denne protokollen kan også brukes til hele DRG-kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført med godkjenning fra University of Alberta Health Sciences Animal Care and Use Committee (protokoll 0000274).
1. Forberedelse av reagens
- For dag 1, lag følgende reagenser: cellekulturklasse vann; poly-D-lysin-klargjøre en bestand ved å rekonstituere hele flasken i 50 ml kulturvann til en stamkonsentrasjon på 100 μg/ml, lagre ved 4 °C, og fortynne stammaterialet 1:10 i vann av kulturkvalitet til en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml; tris-HCl-forberede en bestand ved å oppløse pulverisert trishydroklorid i kultur grade vann til en lager konsentrasjon på 500 mM (3,94 g i 50 ml), pH 9,5, filter sterilisere (0,22 μm), lagre ved 4 ° C, og fortynne lager 1:10 i kultur grade vann til en endelig konsentrasjon på 50 mM; sekundære antistoffer (geit anti-rotte, -kanin og -mus).
- For dag 2, klargjør følgende reagenser.
- Forbered cellekulturgrad Ca 2+, Mg2+-fri Hanks balanserte saltløsning (HBSS; HBSS-/-), og cellekulturgrad D-fosfatbufret saltvann (PBS) med Ca 2+ og Mg2+. Tilbered en lamininkraftalikot og oppbevar ved -80 °C umiddelbart etter mottak; fortynne stambeholdningen i steril HBSS-/- til en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml for arbeidsmateriell.
- Tilbered 4% bovint serumalbumin (BSA) lager ved å oppløse 400 mg BSA i 7,5 ml D-PBS (pH 7,4), bring volumet til 10 ml, filtrer steriliser (0,22 μm), alikot og oppbevar ved -20 °C. Klargjør 0,2 % BSA ved å fortynne 750 μL 4 % BSA i 14,25 ml D-PBS.
- Forbered 0,4% DNAse-lager ved å tilsette 1 ml Earles balanserte saltløsning (EBSS) per 12 500 enheter DNAse, filtrer steriliser (0,22 μm), alikot og oppbevar ved -20 °C. Forbered panoreringsbuffer (0,02 % BSA) ved å legge til 3 ml 0,2 % BSA og 100 μL 0,4 % DNAse i 27 ml D-PBS. Forbered primære antistoffer (CD45, PDGRFβ, O4).
MERK: Denne protokollen bruker en O4 hybridoma8,9, men 10 μg av et kommersielt tilgjengelig O4-antistoff vil også være passende. - Forbered kombinasjonskollagenasestammen ved å løse opp en flaske med kombinasjonskollagenase (50 mg) i 5 ml HBSS-/-, alikot og oppbevares ved -20 °C. Forbered et arbeidslager per to mus ved å tilsette 500 μL oppvarmet kombinasjonskollagenase og 50 μL oppvarmet 0,4% DNase til 4,5 ml HBSS-/-.
- Forbered lav ovomucoid ved å tilsette 3 g BSA til 150 ml D-PBS, tilsett deretter 3 g trypsinhemmer og bland for å oppløse. Juster pH til 7,4 og bring volumet opp til 200 ml med D-PBS. Filtrer sterilisering, tilbered 1 ml alikoter og oppbevar ved -20 °C. På dagen for disseksjon, kombiner 1 ml lav ovomucoid i 9 ml D-PBS for arbeidsløsningen.
- Klargjør 15 % BSA ved å løse opp 7,5 g BSA i 50 ml HBSS-/- (legg på en shaker for å løse opp helt), filtrer steriliser og oppbevar ved 4 °C.
- Forbered 50 ml nevronmedier ved å tilsette 23,2 ml DMEM, 23,2 ml nevrobasalt medium, 500 μL glutamaks, 500 μL natriumpyruvat, 500 μL penicillin/streptomycin (alikot umiddelbart ved ankomst og oppbevares ved -20 °C), 500 μL insulin (5 μg/ml endelig), 500 μL SATO, 50 μL N-acetyl-L-cystein (NAC; 5 μg/ml finale), og 1000 mikrol B27+ (umiddelbart alikot og oppbevares ved -20 °C ved mottak).
- Klargjør insulinlageret ved å løse opp i vann av dyrkningskvalitet til en konsentrasjon på 0,5 mg/ml (50 mg i 100 ml), juster pH til 7,4, filtrer steriliser (0,22 μm), tilbered 500 μl alikoter og oppbevar ved -20 °C.
- Forbered SATO-bestanden ved å kombinere 20 μL progesteron (2,5 mg i 100 μL etanol), 800 μL natrium selenitt (4 mg i 10 ml neurobasal media + 10 μL av 1 N NaOH), 800 mg BSA, 800 mg transferrin, 128 mg putrescin dihydroklorid og 80 ml neurobasal. Filtrer steriliser (0,22 μm), tilbered 500 μL alikoter, og oppbevar ved -20 °C. Det er viktig å lage ferske progesteron og natrium selenitt løsninger.
- Klargjør 50 μL N-acetyl-L-cystein (NAC) stamløsning ved å oppløses i nevrobasalt medium til en stamkonsentrasjon på 5 mg/ml (50 mg i 10 ml), filtrer steriliser (0,22 μm), alikot og oppbevar ved -20 °C.
- For dag 4 og 5, klargjør følgende reagenser.
- Forbered 0,2 M fosfatbuffer (PB) ved å oppløse 21,8 g natriumfosfatdibasisk (Na 2 HPO 4) og 8,34 g natriumfosfatmonobasisk dihydrat (NaH2PO4) i 1000 ml vann. Juster pH til 7,4 og oppbevar ved romtemperatur.
- Forbered 8% paraformaldehyd (PFA) som følger: Varm 50 ml vann til 55 °C i en avtrekksventilator, slå av varmen og tilsett 8 g PFA-priller, rør hele tiden. Tilsett 1 N NaOH dråpevis til oppløsningen begynner å bli klar, tilsett deretter 40 ml 0,2 M PB, og fortsett omrøringen til den er klar. Avkjøl løsningen til romtemperatur, juster pH til 7,4, og bring volumet opp til 100 ml med 0,2 M PB. Filtrer og oppbevar ved 4 °C i opptil 2 uker.
- Forbered D-PBS + Triton X-100 (PBSTX) ved å legge til 0,2% Triton X-100 i kulturklasse D-PBS (1 ml Triton + 500 ml D-PBS). Oppbevares ved 4 °C. Forbered blokkeringsløsning, som er 1% normalt eselserum (NDS) i PBSTX. På forhånd kan 1 ml NDS + 9 ml PBSTX tilberedes og lagres ved -20 °C i 10 ml alikoter.
- Forbered antistoffoppløsning som er 0,2% NDS / 0,2% BSA i PBS TX: 200 μL NDS + 200 mg BSA + 9,6 ml PBSTX; kan tilberedes på forhånd og oppbevares ved -20 °C i 10 ml alikoter.
2. Oppsett av utstyr
- Sett opp følgende utstyr: sterilt cellekultur biosikkerhetsskap, mikropipettsett, serologiske pipetter og pipettepistol, 10 cm petriskåler, ønskede cellekulturretter for plating (her ble 24-brønns svarte glassbunnplater brukt til avbildning), 15 ml og 50 ml koniske rør, disseksjonsverktøy (nemlig: fin fjærsaks for laminektomi og nervetrimming, fine tang, og et barberblad), vannbad satt til 37 °C, 70 μm cellesil, sentrifuge (10 min ved 300 x g) med adaptere for 15 ml koniske rør, trypanblå og hemocytometer, avtrekkshette og magnetisk omrøringskokeplate.
3. Eksperimentell metode
- Dag 1: tilberedning av retter
- I et biosikkerhetsskap, belegg ønsket kulturoverflate med nok poly-D-lysin til å dekke bunnen av brønnen. Oppbevares over natten ved 4 °C. Her ble 24-brønns glassbunnplater brukt til avbildning, og dermed ble 300 μL poly-D-lysin brukt.
- Forbered panoreringsfatene i et biosikkerhetsskap: til CD45-parabolen, tilsett 10 ml fungerende tris-HCl-løsning og 30 μL geit-anti-rotte IgG til en 10 cm petriskål; for PDGFRβ-parabolen, tilsett 10 ml arbeidstris-HCl-løsning og 30 μL geit-antikanin IgG til en 10 cm petriskål; for O4 hybridoma-parabolen, tilsett 10 ml fungerende tris-HCl-løsning og 30 μL geit-anti-mus IgG til en 10 cm petriskål. Sørg for at oppløsningen dekker hele oppvaskområdet og la den stå ved 4 °C over natten.
- Dag 2: disseksjon, triturering og immunpanning
- Aspirer poly-D-lysin, vask platene tre ganger med vevskulturvann, vipp lokket åpent og la overflaten tørke helt i et biosikkerhetsskap. Påfør nok laminin på platene til å belegge bunnen av hver brønn, og legg i en inkubator ved 37 °C. For 24-brønnsplatene er 200 μL tilstrekkelig.
- Fullfør forberedelsene til panoreringsrettene. Vask hver tallerken med D-PBS og inkuber med 10 μg primært antistoff. La stå i romtemperatur i minst 2 timer.
- For CD45-parabolen, tilsett 5 ml 0,2% BSA og 20 μL CD45 primær; for PDGFRβ-parabolen, tilsett 5 ml 0,2% BSA og 15,4 μL PDGFRβ; for O4-parabolen, tilsett 3 ml 0,2% BSA, 2 ml O4-hybridom og ytterligere 100 μL 4% BSA (for å sikre at den endelige BSA-konsentrasjonen forblir på 0,2%).
- Avlive én til fire mus med 0,1 ml/kg natriumpentobarbitol (per 10 cm immunpaneringsfat). Vi brukte C57BL/6 mus ved 8-10 ukers alder. Begge kjønn ble brukt og dyrket separat fra hverandre. Perfus dyret med 30 ml kald 0,9% saltvann.
- Fest for- og bakpotene til et styrofoam-stadium og bruk et rent barberblad for å eksponere ryggraden fra baksiden. Utfør en laminektomi ved å lage kutt omtrent halvveis dypt på hver side av den dorsale ryggraden, fjerne den dorsale halvdelen av kolonnen, for å avsløre ryggmargen. Enten forsiktig kutte nerver og fjerne ryggmargen, eller forsiktig skyve ledningen til siden, opprettholde nerveintegriteten.
- Bruk spinalnerverøttene (enten kuttet eller festet til ryggmargen) for å finne og fjerne alle DRG fra hver side av ryggraden. Trim nerverestene fra hver DRG når den fjernes (mer nerverester i kulturen kan føre til dårlig kulturoverlevelse). Samle DRGene i 15 ml HBSS-/- i et 15 ml konisk rør på is.
MERK: Merk at vevet dissekeres i friluft, men når DRG er lagt til røret, bør de behandles som sterile og bare manipuleres i et biosikkerhetsskap. - Plasser frosne lagre av stemxyme 1 og 0,4% DNAse i et vannbad, ca. 30 minutter før slutten av disseksjonene (omtrent når du starter den siste musen). La dem slå seg til bunnen av det koniske røret, og fortsett deretter protokollen i et biosikkerhetsskap.
- Aspirer det meste av HBSS-/- fra DRG-ene. Bruk en pipette i stedet for sug for å få <1 ml væske, og la ~ 100 μL væske for ikke å risikere å miste vev.
- Vask tre ganger med 1 ml HBSS-/-. Tilsett 5 ml arbeidsstammeoppløsning til vevet. Dekk lokket med en gjennomsiktig film og flyt røret på siden i et vannbad satt til 37 °C i 1 time.
- Etter inkubering i enzymet, tilsett 1 ml oppløsning med lav ovo-hemmer til røret. Triturer cellene forsiktig med en p1000 pipette 10-15 ganger. La vevsbitene slå seg ned.
- Overfør de øverste 2-3 ml av løsningen (inneholdende dissosierte celler) til frisk lav ovomucoid løsning. Gjenta til vevet er fullstendig dissosiert og ingen synlige biter forblir.
- Sentrifuge i 10 min ved 300 x g ved romtemperatur. Siphon av supernatanten igjen, bruk en pipette i stedet for sug for de siste 1 ml, forlater ~ 100 μL, og resuspender cellepelleten i 1 ml panoreringsbuffer.
- Pipetter forsiktig for å blande. Forvåt en 70 μm cellesil med 1 ml panoreringsbuffer over et 50 ml konisk rør. Filtrer celleløsningen gjennom cellesilen.
- Vask røret med 1 ml panoreringsbuffer, og pass deretter gjennom silen (3 ml filtrat). Legg cellesuspensjonen forsiktig (1 ml om gangen) på toppen av 2 ml av en 15 % BSA-pute for å fjerne myelinrester. En pute på 2 ml er effektiv for to mus, og 3 ml er effektiv for fire mus.
- For lagdeling, plasser 2 ml BSA i røret, lukk og belegg forsiktig sidene av røret med BSA. Deretter legger du forsiktig celleopphenget på toppen ved å pipettere mot siden av røret.
- Sentrifuge ved romtemperatur ved 300 x g i 10 minutter (langsom akselerasjon og retardasjon). Bruk en P1000-pipette for å fjerne den klare væsken på toppen, myelinfasen i mellom, og BSA, 1 ml om gangen (endre spisser mellom hver ml). La ~100 μL BSA stå for ikke å forstyrre pelleten.
- Tilsett 5 ml panoreringsbuffer og inkuber røret i en 37 °C, 10% CO2 -inkubator i 30-45 minutter. Dette muliggjør gjenfinning av antigen. Pass på å løsne lokket for å tillate gassutveksling.
- Vask CD45-fatet tre ganger med D-PBS. Hell av den endelige skyllingen. Dekanter cellesuspensjonen i CD45-fatet.
- Inkuber cellene på CD45-fatet i totalt 20 minutter ved romtemperatur, virvle forsiktig ved 10 minutters punkt for å gi cellene lik tilgang til antistoffet.
- Skyll PDGFRβ-parabolen tre ganger med D-PBS og hell av den endelige skyllingen. Overfør de ubundne cellene fra CD45-parabolen til PDGFRβ-parabolen.
- Rist CD45-fatet forsiktig og støtt det opp i vinkel. Pipetter forsiktig 1 ml av cellesuspensjonen over fatet for å samle ubundne celler. Dekanter den inn i PDGFRβ-skålen og pipetten for å overføre den gjenværende cellesuspensjonen til PDGFRβ-platen.
- Inkuber PDGFRβ-platen i totalt 20 minutter ved romtemperatur, virvle forsiktig ved 10 minutters punkt for å gi cellene lik tilgang til antistoffet.
- Skyll O4-fatet tre ganger med D-PBS og hell av den endelige skyllingen. Overfør de ubundne cellene fra PDGFRβ-parabolen til O4-parabolen på samme måte som i trinn 3.2.19. Inkuber O4-platen i totalt 20 minutter ved romtemperatur, virvler forsiktig ved 10 minutters punkt for å gi cellene lik tilgang til antistoffet.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml konisk rør og sentrifuge i 10 minutter ved 300 x g. Bryt cellene i ønsket volum, og fortynn 1: 1 med trypanblå for celle levedyktighet. Telle mellomstore til store celler med et hemocytometer (dette vil tillate den beste representasjonen av antall nevroner i kulturen).
- Fjern laminin og plate cellene med ønsket tetthet. Ikke la platen tørke mellom lamininfjerning og plating, og tilsett cellene umiddelbart.
- Dyrkning: de kvantifiserte cellene for nevronanrikning (figur 3) med 500 nevroner i 25 μL kulturmedium (beskrevet i 1.2.7) per brønn i 24-brønnsplater og inkuberer ved 37 °C i 30 minutter. Oversvømme brønnene til et endelig volum på 500 μL.
- Dag 4: osteocytokjemi (ICC) fiksering, blokkering og primær
- Etter 48 timers vekst, tilsett 500 μL/brønn (eller volum tilsvarende mediet i brønnen) på 8% PFA i 15 minutter ved romtemperatur for å fikse cellene. Hvis medieanalyse er ønsket, kan man fikse med 4% PFA direkte. Dette har vi imidlertid ikke testet.
- Vask cellene med D-PBS tre ganger. Merk at vi har holdt disse cellene i kultur uten medieendring i maksimalt 72 timer, men hypoteser at de kan overleve lenger, spesielt hvis media er halvskiftet ut.
- Fjern den endelige vasken og tilsett nok blokkeringsløsning per brønn til å dekke cellene helt. Blokker i 30 min ved romtemperatur. Fjern blokkeringsløsningen og tilsett primært antistoff i antistoffløsning: β3-tubulin ved en 1:1000 fortynning. Forsegl platen med gjennomsiktig film og rug over natten ved 4 °C.
MERK: Man kan vurdere farging med PDGFRβ for fravær av fibroblaster, CD45 for fravær av immunceller, P0 eller PMP22 for fravær av myelin, eller fabp7 for satellittglia.
- Dag 5: ICC sekundær
- Vask cellene med D-PBS tre ganger. Fjern den endelige vasken og tilsett sekundære antistoffer i antistoffoppløsning: antikanin 488 ved en 1:500 fortynning og DAPI ved en 1:2 000 fortynning. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
- Vask med D-PBS tre ganger. Legg nok D-PBS til å dekke bunnen av brønnen, og bildet. Platen kan forsegles med gjennomsiktig folie, beskyttes mot lys og oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De faste cellene farget med DAPI og β3-tubulin ble deretter avbildet med et konfokalt screeningsystem med høyt innhold. Bildene ble analysert ved hjelp av egnet kommersiell programvare for å bestemme prosentandelen av DAPI-positive celler som co-merket med β3-tubulin (figur 3). Hele DRG-kulturer ble bestemt til å ha 42,36% ± 6,4% β3-tubulinfarging, og immunpanerte DRG-kulturer ble bestemt å ha 71,44% ±7,43% β3-tubulinfarging. Dette viser en signifikant økning i nevronberikelse med immunpanning (p < 0,0001, uparret t-test).
Figur 1: Grunnleggende immunopanning. Et sekundært antistoff festes til en dyrkningsskål over natten, og primære antistoffer blir deretter introdusert. Dette gjør at cellene av interesse kan festes til platen av et overflateantigen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Voksen mus DRG nevron immunpanering ved negativ seleksjon. DRG høstes, dissosieres og siles til en enkeltcelleløsning. Myelinrester fjernes ved sentrifugering gjennom en BSA-pute. Cellesuspensjonen føres deretter over tre immunpanneretter (CD45, PDGFRβ og O4) for å oppnå en kultur som er beriket for nevroner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: DRG-dyrkning nevronberikelse ved immunpanning. Faste kulturer ble farget med β3-tubulin for nevroner, og DAPI for alle kjerner. (A) Representativt bilde av en hel (ikke-immunpanert) kultur. (B) Representativt bilde av en immunpanorert kultur. (C) Kvantifisering av β3-tubulin-positive celler i prosent av totale DAPI-positive celler. Søyler angir gjennomsnitt ± standard feilmiddel (SEM). = p < 0,0001, upparet t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne immunpaneringsprotokollen øker andelen nevronceller i DRG-primærkulturer. For best resultat bør disseksjoner gjøres i tide, og DRG bør trimmes for overskytende nerver. Dissosiasjonstrinnet bør overvåkes nøye, og bør ikke overstige 1 time, for å forhindre at cellene blir unødvendige stress. Med hensyn til immunpanning spesielt, bør hver plate forsiktig virvles halvveis for å tillate cellene å få tilgang til de belagte antistoffene. Platene bør også ses under et kulturmikroskop etter at nevroncellesuspensjonen er samlet for å sikre at ikke-nevronale celler har bundet.
En begrensning i bruken av voksne mus er DRGs etablerte natur. Manglende evne til å fjerne alle ikke-nevronale celletyper etterlater omtrent 30% av kulturen som ikke-nevronal (figur 3). Mens vi kan dissosiere og redusere populasjonen av immunceller, fibroblaster og Schwann-celler fra kulturer, kan satellittglia være svært vanskelig å dissosiere fra nevroner. Vi har også en hypotese om at disse nevronene kan ha dårlig overlevelse uten den metabolske støtten fra satellittglia10. Mens vårt forsøk på å farge for disse cellene ved hjelp av GFAP mislyktes på grunn av dårlig antistoffspesifisitet, kan en fremtidig retning være å flekke for disse cellene ved hjelp av fabp7. Vi forsøkte å fjerne CD9-positive ikke-nevronale celler som satellittglia ved feilsøking av denne protokollen. I CD9-platen ble det imidlertid funnet at mange nevroner var festet til platen. Vi hypoteser at musenevroner kan ha noe CD9-uttrykk. Faktisk bruker ekstracellulær vesikkellitteratur fra museneuronlignende celler CD9 som markør11. Hvis et mer egnet panoreringsantistoff kan bli funnet å redusere andelen satellittglia, kan man vurdere ytterligere tilskudd med vekstfaktorer som NGF, BDNF eller NT3 for å motvirke tapet av disse støttecellene.
Denne immunpaneringsprotokollen kan forbedre nøyaktigheten av nevronavlesninger fra homogene DRG-kulturprøver ved å øke andelen nevronceller i kultur. Det gir også en avenue for å dyrke voksne mus DRG-nevroner, noe som muliggjør en grundig undersøkelse av neuronale fenotyper i genetiske, sykdoms- og skademusemodeller.
Immunopanning er også et svært tilpassbart verktøy. For eksempel kan celleoverflatemarkøren isolektin-B4 brukes til å selektere spesifikt for ikke-peptiderge musenociseptorer. Immunopanning kan også brukes til å berike andre primære kulturer, inkludert kortikale nevroner, mikroglia, astrocytter og oligodendrocyttforløperceller. Det er et kraftig verktøy som kan utvide anvendelsene av primære cellekulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et prosjektstipend fra Canadian Institutes of Health Research (FRN-162434) og et Discovery Grant fra MS Society of Canada (EGID-3761). Forfatterne takker Dr. Sun og Cross Cancer Institute for opplæring og bruk av ImageXpress-systemet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D.
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Developmental Biology. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
