Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Långtidsodling av enskilda Caenorhabditis elegans på fasta medier för longitudinell fluorescensövervakning och aversiva interventioner

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64682
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att odla isolerade enskilda nematoder på fasta medier för livslång fysiologisk parameterspårning och fluorescenskvantifiering. Detta odlingssystem inkluderar en palmitinsyrabarriär runt enmaskbrunnar för att förhindra att djur flyr, vilket möjliggör användning av aversiva ingrepp, inklusive patogena bakterier och kemiska stressfaktorer.

Abstract

Caenorhabditis elegans används ofta för att studera åldrande biologi. Standardpraxis i C. elegans åldringsstudier är att odla grupper av maskar på fasta nematodtillväxtmedier (NGM), vilket möjliggör effektiv insamling av data på populationsnivå för överlevnad och andra fysiologiska fenotyper, och periodisk provtagning av subpopulationer för fluorescerande biomarkörkvantifiering. Begränsningar för detta tillvägagångssätt är oförmågan att (1) följa enskilda maskar över tid för att utveckla åldersbanor för fenotyper av intresse och (2) övervaka fluorescerande biomarkörer direkt i samband med odlingsmiljön. Alternativa odlingsmetoder använder flytande kultur eller mikrofluidik för att övervaka enskilda djur över tid, i vissa fall inklusive fluorescenskvantifiering, med avvägningen att odlingsmiljön är kontextuellt skild från fast NGM. WorMotel är en tidigare beskriven mikrofabricerad flerbrunnsanordning för odling av isolerade maskar på fast NGM. Varje mask hålls i en brunn innehållande fast NGM omgiven av en vallgrav fylld med kopparsulfat, ett kontaktavvisande medel för C. elegans, vilket möjliggör longitudinell övervakning av enskilda djur. Vi finner kopparsulfat otillräckligt för att förhindra maskar från att fly när de utsätts för aversiva ingrepp som är vanliga i åldrande forskning, inklusive kostbegränsning, patogena bakterier och kemiska medel som inducerar cellulär stress. Multibrunnsanordningarna är också gjutna av polydimetylsiloxan, vilket ger höga bakgrundsartefakter vid fluorescensavbildning. Detta protokoll beskriver ett nytt tillvägagångssätt för odling av isolerade rundmaskar på fast NGM med kommersiellt tillgängliga polystyrenmikrobrickor, ursprungligen utformade för humant leukocytantigen (HLA) typning, vilket möjliggör mätning av överlevnad, fysiologiska fenotyper och fluorescens över livslängden. En palmitinsyrabarriär hindrar maskar från att fly, även i närvaro av aversiva förhållanden. Varje platta kan odla upp till 96 djur och anpassar sig enkelt till en mängd olika förhållanden, inklusive kostbegränsning, RNAi och kemiska tillsatser, och är kompatibel med automatiserade system för insamling av livslängds- och aktivitetsdata.

Introduction

C. elegans är en kraftfull modellorganism för forskning inom genetik, cellbiologi och molekylärbiologi, eftersom de lätt odlas i laboratoriet, har en kort generationstid och livslängd, delar en hög grad av proteinhomologi med däggdjur och har en transparent kroppsstruktur som möjliggör in vivo-visualisering av fluorescerande proteiner och färgämnen1. Som ett resultat av den långvariga användningen av C. elegans som ett viktigt modellsystem inom en rad områden, inklusive utvecklingsbiologi och åldrande, är deras tillväxt och utveckling väl förstådd, deras genom har sekvenserats fullständigt och en mängd kraftfulla genetiska verktyg har skapats, inklusive genomomfattande RNAi-matningsbibliotek och tusentals mutanta och transgena stammar. Historiskt odlas C. elegans som populationer på tillväxtmedier för fast agarnematod (NGM), och fenotyper utvärderas manuellt antingen genom direkt observation eller genom avbildning och nedströmsanalys. Fluorescerande mikroskopi används för att fånga en mängd olika molekylära fenotyper med färgämnen eller transgent uttryckta fluorescerande taggar i enskilda C. elegans. Fluorescerande avbildning innebär vanligtvis att fixera eller förlama ett djur på objektglas som innehåller tunna agaroskuddar, vilket är invasivt och ofta dödligt. Det innebär också användning av kemikalier, såsom levamisol eller natriumazid, som potentiellt kan störa den molekylära processen av intresse 2,3. Tillsammans tillåter dessa tillvägagångssätt tvärsnittsdata på populationsnivå som ska samlas in över ett brett spektrum av fenotyper, men tillåter inte spårning av enskilda djur över tid.

Under de senaste åren har flera metoder uppstått för att odla isolerade C. elegans, vilket gör det möjligt för forskare att fånga dynamiska förändringar i fysiologiska och molekylära fenotyper av djur över tid med hjälp av ny bildteknik. En kategori av C. elegans kulturmetod är mikrofluidikanordningar, inklusive WormFarm4, Nemalife-chipet5 och "beteende" -chipet av Chronis et al.6, bland olika andra 7,8,9. Relaterade till dessa är vätskebaserade odlingsmetoder, som använder flerbrunnsplattor för att karakterisera enskilda maskar eller små populationer över tiden10,11. Mikrofluidik och mikroplattsystem ger utmärkta kvantitativa mätningar av fenotypiska svar i C. elegans ner till ett enda djur, men odlingsmiljön utgör en viktig begränsning. Den stora majoriteten av tidigare forskning inom C. elegans, särskilt inom åldrande, har slutförts på fasta agarbaserade medier. Flytande kultur får C. elegans att simma kontinuerligt och representerar ett distinkt miljösammanhang som kan förändra den underliggande biologin. Till exempel har djur som odlats i flytande media drastiskt förändrat fettinnehåll och genuttryck - särskilt för gener som är involverade i stressresponsen - i förhållande till djur som odlas på agarbaserad fast NGM12,13. En alternativ kategori av avbildningsmetoder för enstaka djur innefattar polydimetylsiloxan (PDMS) -anordningar som isolerar enskilda djur på fasta medier, i ett försök att närmare efterlikna standardmiljön som upplevs av maskar odlade på fast NGM i gruppkultur på Petri-plattor. WorMotel är en 240-brunns PDMS-enhet utformad för att odla enskilda djur på fasta medier. Varje brunn fylls med en modifierad NGM med lågsmält agaros i stället för agar och sås med bakteriell mat, vilket skapar en fast mediemiljö som liknar det vanligaste odlingssystemet med Petri-plattor. Brunnsväggarna är runda, vilket gör att varje djur kan avbildas oavsett plats i brunnen (undvik den visuella skymningen orsakad av ett djur nära en vägg i en flerbrunnsplatta). Kopparsulfat i en smal vallgrav som omger varje brunn används som avskräckande medel för att hålla djur i sina brunnar14,15. En begränsning av detta tillvägagångssätt är att kopparsulfatet är ineffektivt för att förhindra maskar från att fly när aversiva miljöförhållanden är närvarande, inklusive kostbegränsning, patogena bakterier eller kemikalier som inducerar cellulär stress (t.ex. parakvat).

Ett andra system som använder fasta medier är Worm Corral, som använder en hydrogel för att skapa en liten förseglad miljö för varje mask på ett objektglas, vilket möjliggör långsiktig övervakning av individuellt isolerade djur16. En viktig begränsning är att djur måste förseglas i miljön som ägg, vilket kräver användning av sterila djur för att förhindra reproduktion och begränsar läkemedelsbehandlingar till en enda applikation. Läkemedelsprövningar med flera doser kan utföras i WorMotel antingen genom att utföra flera exponeringsomgångar innan maskar överförs till enheten eller genom att lokalt tillsätta ytterligare läkemedel till brunnarna under experimentet. I det senare fallet är emellertid den faktiska exponeringsdosen efter tillsats av ytterligare ett läkemedel till en befintlig brunn svår att exakt kvantifiera och beror på hur snabbt läkemedlet bryts ned. Både WorMotel och Worm Corral är utmärkta för ljusfälts- eller mörkfältsavbildning för att fånga information relaterad till aktivitet och djurfysiologi (t.ex. tillväxt och utveckling). Även om dessa system kan användas för att övervaka fluorescens, är PDMS som används för att skapa andra enkelmaskavbildningstekniker enligt vår erfarenhet benägna att bilda mikrobubblor, fånga partiklar och andra små avvikelser som genererar oregelbundna fluorescerande artefakter som stör konsekvent fluorescensvisualisering och kvantifiering, särskilt i emissionsområdet för GFP, den vanligaste fluoroforen som används i C. elegans forskning. Hittills är levande fluorescensavbildning av C. elegans enskilda djur på ett longitudinellt sätt främst beroende av mikrofluidikanordningar17.

Här beskriver vi en ny metod för odling av enskilda C. elegans på fasta medier som är kompatibel med både aversiva interventioner och direkt fluorescerande avbildning. Detta tillvägagångssätt liknar konceptet för andra avbildningstekniker med en mask, förutom att det specialgjutna PDMS-chipet ersätts med kommersiellt tillgängliga mikrobrickor av polystyren som ursprungligen utvecklades för mikrocytotoxicitetsanalyser (även vanligen kallade Terasaki-brickor)18. Dessa mikrobrickor har brunnar som kan fyllas med fasta medier och sås med bakteriell mat, vilket nära efterliknar miljön som upplevs av djur under standard fast NGM-odlingsmetodik. Varje brunn är omgiven av en aversiv barriär av palmitinsyra snarare än kopparsulfat. Palmitinsyra används ofta för att förhindra maskar från att fly från fasta medier, med hjälp av standardgruppkultur på Petri-plattor i experiment där maskar utmanas med en aversiv miljö som kostbegränsning eller exponering för en kemisk stressor. Mikrobrickorna producerar också minimal och konsekvent fluorescerande bakgrund, vilket möjliggör fluorescerande avbildning av djur direkt i deras odlingsmiljö. Detta nya solida agarbaserade odlingssystem för ett djur gör det inte bara möjligt att spåra enskilda djur under hela livet och övervaka tillväxt, utveckling, aktivitet och livslängd, utan är också kompatibelt med direkt fluorescerande mikroskopi. Eftersom maskarna kan avbildas utan förlamning eller fixering kan fluorescensbiomarkörer in vivo kvantifieras longitudinellt hos enskilda djur som finns kvar på deras odlingssubstrat, vilket möjliggör observation av dynamiska förändringar under varje djurs livstid. Detta odlingssystem är också kompatibelt med nuvarande generationens automatiserade system för spårning av livslängd och andra hälsomått14,19. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för odling av enskilda C. elegans i detta mikrobrickbaserade system, diskuterar potentiella fallgropar och felsökning och diskuterar fördelar och begränsningar i förhållande till andra system, och i synnerhet ett uppdaterat och optimerat WorMotel-protokoll15.

Varje enkelmaskodlingsmiljö består av en mikrobricka monterad inuti ett standardfack med en brunn med en anpassad 3D-tryckt adapter (figur 1A). Brunnarna är fyllda med lågsmält agarosnematodtillväxtmedia (lmNGM), sådd med koncentrerade bakterier som näringskälla och omgiven av en palmitinsyrabeläggning för att förhindra att maskar flyr (figur 1B). Utrymmet mellan mikrobrickan och väggarna på enkelbrunnsplattan är fylld med mättade vattenkristaller för att bibehålla fuktigheten (figur 1B). En tvättmedelsbeläggning appliceras på bricklocket för att förhindra kondens. En enda mask läggs till varje brunn, och enkelbrunnsbrickan är förseglad med Parafilm för att bibehålla fukt och tillåta syreutbyte. Upp till sex mikrobrickor kan rimligen förberedas parallellt av en enda praktiserad forskare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Recept

OBS: Förbered stamlösningar innan du börjar förbereda mikrobrickplattan.

  1. Stamlösningar för tillväxtmedier för agarosnematod med låg smälthalt (lmNGM)
    1. Bered 1 MK2 HPO4 genom att lösa 174,18 g K2HPO4 i 1 liter sterilt avjoniserat vatten i en 1 L flaska. Autoklavera lösningen vid 121 °C, 15 psi, i 30 minuter och förvara den i rumstemperatur (RT).
    2. Bered 1 M KP i (pH 6,0) genom att lösa 136,09 g KH2HPO4 i 1 liter sterilt avjoniserat vatteni en 1 L flaska. Titrera lösningen med 1 M K2HPO4 för att uppnå pH 6,0. Autoklavera lösningen vid 121 °C, 15 psig, i 30 minuter och förvara den vid rumstemperatur.
    3. Bered 1 M CaCl2 genom att lösa upp 73,5 gCaCl2 i 500 ml sterilt avjoniserat vatten i en 500 ml flaska. Autoklavera lösningen vid 121 °C, 15 psig, i 30 minuter och förvara den vid rumstemperatur
    4. Bered 1 M MgSO4 genom att lösa 123,25 gMgSO4 i 500 ml sterilt avjoniserat vatten i en 500 ml flaska. Autoklavera lösningen vid 121 °C, 15 psig, i 30 minuter och förvara den vid rumstemperatur.
    5. Förbered 3 M NaCl för lmNGM: I ren 100 ml flaska, kombinera 100 ml ultrarent vatten och 18,20 g NaCl. Autoklav vid 121 °C, 15 psig, i 30 min.
    6. Förbered 5 mg / ml kolesterol genom att kombinera 2,5 g kolesterol, 275 ml 100% etanol och 25 ml sterilt avjoniserat vatten i en 500 ml bärnstensfärgad flaska. Autoklavera lösningen vid 121 °C, 15 psig, i 30 minuter och förvara den vid rumstemperatur.
    7. Bered 50 mM fluorodeoxiuridin (FUdR) genom att lösa 0,1231 g FUdR i 10 ml sterilt avjoniserat vatten i ett 15 ml koniskt rör. Använd en 10 ml spruta och 0,22 μm filter för att sterilisera lösningen. Alikvot 1 ml av lösningen vardera i 10 mikrocentrifugrör och förvara dem vid -20 °C.
    8. Bered 50 mg/ml karbenicillin genom att lösa 500 mg karbenicillin i 10 ml sterilt avjoniserat vatten i ett 15 ml koniskt rör. Använd en 10 ml spruta och 0,22 μm filter för att sterilisera lösningen. Alikvot 1 ml av lösningen vardera i 10 mikrocentrifugrör och förvara dem vid -20 °C.
    9. Bered 1 mM isopropyl ß-D-1-tiogalaktospyranosid (IPTG) genom att lösa 2,38 g IPTG i 10 ml sterilt avjoniserat vatten i ett 15 ml koniskt rör. Använd en 10 ml spruta och 0,22 μm filter för att sterilisera lösningen. Alikvot 1 ml av lösningen vardera i 10 mikrocentrifugrör och förvara dem vid -20 °C.
    10. Bered 100 mg/ml ampicillin genom att lösa 1 g ampicillin i 10 ml sterilt avjoniserat vatten i ett 15 ml koniskt rör. Använd en 10 ml spruta och 0,22 μm filter för att sterilisera lösningen. Alikvot 1 ml av 100 mg/ml ampicillinlösning vardera i 10 mikrocentrifugrör och förvara rören vid -20 °C.
  2. Beredning av tillväxtmedier för nematoder (NGM) för allmänt underhåll av C. elegans
    1. För att göra 50 plattor, lös upp 10 g Bacto agar, 1,5 g NaCl och 1,25 g Bacto pepton i 486 ml ultrarent vatten i en 1 L kolv. Sterilisera mediet genom autoklavering på en vätskecykel vid 121 °C, 15 psig, i minst 30 minuter.
    2. Efter autoklav, låt mediet svalna till 55 °C. Tillsätt sedan 12,5 ml 1 M KPi, 500 μL 1 MMgSO4, 500 μL 1 MCaCl2 och 500 μL 5 mg/ml kolesterol till lösningen.
    3. Häll med steril teknik 10 ml av det medium som beretts i steg 1.2.2 i varje 60 mm platta (totalt 50). Låt plattorna stelna i minst 30 minuter. Pipettera 300 μL över natten odlad bakteriekultur på plattans mitt och lämna plattan på bänken. Låt kulturen torka och växa tjockare i 1-2 dagar. Förvara dessa NGM-plattor med bakterier vid 4 °C.
  3. Beredning av lmNGM-förblandning
    1. I en 250 ml Erlenmeyerkolv kombinerar du 2 g agaros med låg smälthalt, 0,25 g pepton, 1 ml 3 M NaCl och 99 ml ultrarent vatten. Autoklav lösningen vid 121 °C, 15 psig, i 30 min.
    2. Alikvot 10 ml lmNGM i provrör och täck med Parafilm för att förhindra förlust av vätska. Täck rören och låt dem svalna och stelna.
  4. Förbered 85 mM NaCl för bakteriell mat: I en 100 ml flaska, kombinera 515,61 mg NaCl och fyll upp till 100 ml med ultrarent vatten. Autoklav vid 121 °C, 15 psig, i 30 min.
  5. Bered vattenabsorberande polyakrylamidkristaller genom att lösa upp 1 g superabsorberande polymer av typ S i 150 ml ultrarent vatten i en autoklaverbar pressflaska. Skär spetsen för att säkerställa en tillräcklig dispenseringsstorlek. Autoklav vid 121 °C, 15 psig, i 30 min, lock med infoil och skaka för att blanda kristallerna.
  6. Bered en tvättmedelslösning genom att kombinera 3 ml 100% Tween-20 med 7 ml ultrarent vatten i en 15 ml konisk injektionsflaska.
  7. Förbered 5 mg / ml kolesterol genom att kombinera 2,5 g kolesterol, 275 ml 100% EtOH och 25 ml ultrarent vatten i en 500 ml flaska.
  8. Förbered palmitinsyra arbetslösning
    1. Mal 500 mg fast palmitinsyra i en mortel och stöt och kombinera den med 15 ml Tween-20 i en 50 ml konisk injektionsflaska. Blanda genom att virvla, lösa upp så många av kristallerna som möjligt.
    2. Tillsätt 17,5 ml 100% etanol och virvla lösningen för att lösa upp så mycket palmitinsyra som möjligt.
    3. Tillsätt 17,5 ml ultrarent vatten och virvel noggrant. Värm försiktigt lösningen i ett pärlbad vid 80 °C tills palmitinsyran har lösts upp helt. Vissa palmitinsyra kan fällas ut under kylning.
  9. Bered lysogenbuljong (LB) genom att blanda 20 g LB-pulver i 1 liter avjoniserat vatten i en 1 l eller större bägare. Alikvot 500 ml av buljongen i två 500 ml bägare. Autoklav buljongen vid 121 °C, 15 psig, i 30 min. Förvara den beredda buljongen vid RT.
  10. Förbereda agarplattor för lysogenbuljong (LB)
    1. Blanda 10 g LB-pulver och 7,5 g Bacto-agar i 500 μL avjoniserat vatten i en 1 L kolv. Autoklav lösningen på en vätskecykel vid 121 °C, 15 psig, i 30 minuter.
    2. Tillsätt om så önskas valfria antibiotika (500 μl 100 μg/ml ampicillin) efter att det autoklaverade mediet har kylts till 55 °C. Gör LB-agarplattor med steril teknik genom att hälla 20 ml media i varje 100 mm platta (totalt 25). Förvara plattorna vid 4 °C.

2. Förbereda en population av ålderssynkroniserade maskar

  1. Förbered en population av ålderssynkroniserade maskar som är redo att läggas till mikrobrickan vid larvstadium 4 (L4). Alternativt kan maskar i vilket livsstadium som helst tillsättas (FUdR bör uteslutas från mikrobrickmediet om maskar tillsätts i ett utvecklingsstadium tidigare än L4 för att förhindra utvecklingsstopp).
    OBS: Detta steg bör slutföras 2 dagar innan maskarna läggs till mikrobrickan om mållivsstadiet i början av experimentet är L4. Synkroniseringstiden kan justeras så att maskarna kan nå önskat livsstadium.
  2. Temperaturen kan påverka livslängden. För konsekventa resultat, använd standard NGM-plattor (se avsnitt 1) för att hålla C. elegans vid 20 °C och överför maskar till färska plattor om de börjar få slut på bakteriemat.
  3. Från stamplattorna med många unga vuxna maskar, använd en standardmetod för att generera en ålderssynkroniserad population, oftast blekning20 eller tidsbestämd äggläggning21.
  4. Isolera äggen och lägg dem i en bakteriefläckig NGM-platta. Om du använder vildtyp C. elegans, kommer äggen att kläckas och bilda maskar och nå L4-larvstadiet om 2 dagar.

3. Förbereda bakteriekultur

  1. Dagen före experimentets början, inokulera den önskade bakteriella matkällan. Förbered ~ 5 ml bakteriekultur per platta.
    OBS: Bakteriestrimman kan förberedas upp till 1 månad i förväg och förvaras vid 4 ° C för E. coli matkälla.
    1. Stryk bakterier för enskilda kolonier på LB-agarplattan från en frusen glycerolstam.
    2. Odla kulturen vid 37 ° C över natten.
    3. Inokulera flytande LB-buljong med en enda koloni per ympning.
    4. Skaka vid ~ 250 rpm vid 37 ° C i 12-16 timmar.

4. Applicera palmitinsyrabeläggning på mikrobricka

OBS: Palmitinsyra fungerar som en aversiv barriär för att förhindra att djur flyr från de enskilda brunnarna. Beläggningen appliceras på hela mikrobrickans bottenyta, med undantag för brunnarnas inre ytor. Nystatin tillsätts till palmitinsyran för att mildra svampförorening. Detta steg kan slutföras 1 dag före experimentstart om så önskas.

  1. Ställ in pärlbadet på 80 °C så att det hinner förvärmas.
  2. Omedelbart före användning, alikvot 1 ml av palmitinsyraarbetslösningen per mikrotråg i en separat steril behållare (vanligtvis en 15 ml injektionsflaska med konisk injektion) och tillsätt 4 μl 10 000 enheter/ml nystatin per 1 ml palmitinsyralösning före upphettning.
  3. Spraya inuti och utanför mikrobrickan med etanol (70% eller mer) till mättnad och skaka av överflödig etanol.
    OBS: Resterande etanol bör avdunsta under behandling i UV-tvärbindning (steg 4.4).
  4. Använd en UV-tvärbindare för att sterilisera mikrobrickan (följande instruktioner är för UV-tvärbindaren som används i denna studie):
    1. Placera mikrobrickan och locket i UV-tvärbindaren separat (dvs. placera inte locken på plattorna, eftersom UV inte tränger igenom plasten).
    2. Stäng luckan och slå på UV-tvärbindaren.
    3. Tryck på Tid, ange 20 minuter och tryck sedan på Start.
    4. Efter 20 minuter vänder du på plattan och locket och upprepar steg 4.2.2-4.2.3.
    5. När du bär handskar, placera locken på mikrobrickan för att förhindra kontaminering efter sterilisering.
  5. Blanda palmitinsyrans arbetslösning noggrant genom virvling och invertering.
  6. Placera den 15 ml koniska injektionsflaskan med palmitinsyralösningen i pärlbadet och låt alla synliga kristaller lösas upp helt före användning.
  7. Placera mikrobrickan på avsatsen som omger pärlbadet med locken på i ~ 2 minuter för att värma upp.
  8. Ta bort mikrobrickans lock. Tillsätt långsamt 200 μL palmitinsyralösning över mikrobrickans bakvägg (långsida). Sätt tillbaka locken och låt mikrobrickan sitta på pärlbadet i 2-3 minuter så att palmitinsyralösningen sätter sig över mikrobrickans botten.
    OBS: Medan hela botten av mikrobrickan inte kommer att vara helt belagd förrän steg 4.10, bör lösningen spridas jämnt över mer än hälften av bottenytan. Om palmitinsyralösningen inte sprider sig jämnt, slå på en virvel eller vibrerande motor nära mikrobrickan. Detta kommer att ge en liten mängd vibrationer som kan hjälpa till att tillåta palmitinsyralösningen att spridas lättare. Håll mikrobrickans lock på plats för att mildra kontaminering.
  9. Upprepa steg 4.8.
    OBS: Ungefär hälften eller mer av mikrobrickans botten bör vara synligt täckt med den flytande palmitinsyran.
  10. Vrid mikrobrickan 180° och upprepa steg 4.8 och 4.9 på andra sidan av magasinet.
    OBS: Terasaki-brickans botten täcks endast med ett tunt lager palmitinsyralösning efter att hela den kombinerade volymen har lagts till på båda sidor (steg 4.9 och 4.10). Mer eller mindre palmitinsyrablandning kan krävas beroende på blandningsberedning, temperatur och andra faktorer. I allmänhet är mellan 400 och 800 μL av palmitinsyrablandningen tillräcklig för att belägga hela botten av mikrobrickan. Så snart botten av mikrobrickan är synligt täckt, bör ingen ytterligare palmitinsyra tillsättas, eftersom detta kan förorena brunnarna.
  11. Torka brickan i en steril torklåda eller laminär flödeshuv i minst 1 h utan lock. Alternativt kan du slutföra detta steg dagen före lastning av plattorna (avsnitt 5) och torka mikrobrickan med locket på vid rumstemperatur i minst 16 timmar.

5. Ladda mikrobrickan med smält nematodtillväxtmedia (lmNGM)

OBS: Denna metod använder standard NGM blandad med lågsmält agaros i stället för den vanliga agaren. Agar kan börja gela vid 45 °C. Vid arbete med de små volymer som behövs för att fylla mikrotrågbrunnarna täpper den agarbaserade NGM ofta pipettspetsen och/eller producerar ojämna brunnsytor på grund av snabb gelning. NGM med agaros med låg smälthalt börjar gela vid ~ 28 ° C, vilket gör att det smälta mediet lätt kan pipetteras och konsekvent bilda plana brunnsytor. Förbered lmNGM samma dag som maskarna ska placeras på mikrobrickan. Om du förbereder mikrobrickan med lmNGM, sådd med bakterier och laddar C. elegans alla inom samma dag, se till att djuren är i eller nära önskad ålder innan du börjar denna uppsättning steg.

  1. Placera ett pipettfat i ett 80 ° C pärlbad för att värma upp.
  2. Smält en 10 ml lmNGM-förblandning per mikrobricka som bereds (steg 1.1) i mikrovågsugnen i ~30-45 s.
    1. Placera lmNGM förblandningsprovrör i en 200 ml bägare, utan lock så att de inte välter.
    2. Efter ~ 10-15 s, eller när lmNGM-förblandningen bara börjar bubbla, pausa mikrovågsugnen, häll lmNGM-förblandningen i en steril 200 ml bägare och återuppta mikrovågsugnen.
    3. Pausa efter behov för att förhindra att det kokar över och virvla för att blanda.
    4. Sluta mikrovågsugna när all lmNGM har förvandlats till vätska utan bitar.
      OBS: En enda alikvot på 10 ml är tillräcklig för att fylla totalt 192 brunnar (två mikrobrickor).
  3. Bered lmNGM genom att tillsätta följande komponenter i angiven ordning till den varma agarosen med låg smälthalt (volymerna är per 10 ml agaros med låg smälthalt): 250 μL 25 mM KPi (pH 6), 10 μL 1 MCaCl2, 10 μL 1 MMgSO4 och 10 μL 5 mg/ml kolesterol
    1. Om forskaren planerar att undersöka vuxna djur över tid och behöver förhindra reproduktion, tillsätt också 10 μL 50 mM FUdR.
    2. Om du utför ett RNAi-matningsexperiment med den vanliga HT115 RNAi E. coli-stammen och associerade RNAi-plasmider, tillsätt också 5 μL 50 mg / ml karbenicillin (för att välja RNAi-plasmiden) och 12 μL 1 mM IPTG (för att inducera uttryck av det dubbelsträngade RNA från RNAi-plasmiden).
      OBS: Ytterligare tillsatser kan inkluderas beroende på selektiva antibiotika och andra kemikalier som behövs för önskad matkälla. Läkemedel eller kemiska stressfaktorer kan också läggas till lmNGM i detta skede. NGM och lmNGM innehåller samma slutliga koncentration av NaCl men skiljer sig åt i hur NaCl tillsätts mediet. För NGM läggs all NaCl till under medieförberedelsen (steg 1.2). För lmNGM tillsätts en del av NaCl under medieberedningen (steg 5.3) och en del med bakteriematen (avsnitt 6). Anledningen till denna förändring härrör från den lilla medievolymen i varje mikrofackbrunn. Tillsats av 5 μL koncentrerade bakterier suspenderade i LB till en brunn innehållande 20 μL substrat kommer att väsentligt förändra näringsämnessammansättningen i mediet (genom att tillsätta komponenterna i LB vid en jämförbar volym). För att undvika detta återsuspenderas bakterierna istället i en lösning av NaCl för att avlägsna LB-komponenterna samtidigt som osmotisk stress på bakterierna förhindras. NaCl som tillsätts mediet reduceras i enlighet därmed för att ta hänsyn till saltet som tillsätts bakterierna.
  4. Häll lmNGM i den uppvärmda pipettbassängen.
  5. Med mikrobrickan på en bänkskiva, pipettera 20 μL lmNGM i varje mikrobricka. Täck mikrobrickan när du fyller på pipetten för att minimera kontaminering.
    OBS: Detta steg är lättare med en elektronisk repeterande pipett.

6. Såning av mikrobrickbrunnarna med bakteriell mat

OBS: 5 μL 10x koncentrerad mat från en inokulerad kultur över natten är tillräcklig för att mata en enda C. elegans under hela dess livslängd.

  1. Överför bakterierna från nattkulturen till en 50 ml konisk injektionsflaska.
  2. Centrifugera vid ~3 500 x g i 20 minuter.
  3. Ta bort supernatanten. Resuspendera bakteriekulturen vid en 10x koncentration (1/10 volym av den ursprungliga kulturen) med 85 mM NaCl-lösning.
  4. Innan du tillsätter bakterier till brunnarna, inspektera mikrobrickan visuellt för att säkerställa att den fasta lmNGM är helt innesluten i varje brunn. Om någon lmNGM hänger från sidan av en brunn, skrapa bort överskottet lmNGM med en pipettspets. Detta överskott av media kan orsaka att maten går in i palmitinsyra om den inte rensas.
  5. Pipettera försiktigt 5 μL 10x koncentrerad bakteriekultur på ytan av lmNGM i varje brunn. Försök att undvika att låta bakteriekulturen rinna över brunnens sida och in i palmitinsyran, eftersom detta kommer att locka maskar att lämna brunnen.
  6. Låt mikrobrickorna torka i en steril torklåda eller laminär flödeshuv i ~ 35 minuter. Kontrollera var ~ 5 minut och var försiktig så att du inte torkar för mycket. Ta bort när några brunnar är synligt lite våta, eftersom brunnarna torkar ytterligare medan nematoderna tillsätts.

7. Omsluta varje mikrobricka i en platta med en brunn

OBS: I det här avsnittet är mikrobrickan monterad inuti en vanlig enkelbrunnsplatta med en anpassad 3D-tryckt insats och omgiven av vattenabsorberande kristaller. Enbrunnsplattan stängs sedan och förseglas med Parafilm. Detta möjliggör syreutbyte samtidigt som kontaminering förhindras och tillräcklig fuktighet upprätthålls för att förhindra att lmNGM torkar ut under flera veckors experiment (masklivslängdsexperiment kan pågå i 6-8 veckor om man undersöker livslängdsförlängande mutationer eller miljöförhållanden). Under beredningen, se till att täcka plattan när något inte aktivt tillsätts för att minimera bakteriell eller svampkontaminering.

  1. Sterilisera en platta med en brunn och en 3D-tryckt adapter och lock genom att doppa var och en i en 10% blekmedelslösning. Skölj noggrant med sterilt DI-vatten. Torka torrt med en aktivitetstorkning.
  2. Spraya plattan med en brunn och den 3D-tryckta adaptern och locket med 70 % eller mer etanollösning och torka av med en specialservett. Låt eventuell kvarvarande etanol lufttorka.
    OBS: UV-strålning kan också användas efter blekmedel och etanol med samma parametrar som mikrobrickan, som beskrivs ovan i steg 4.4.
  3. Placera det sterila 3D-printade inlägget i en steril platta med en brunn.
  4. Sterilisera utsidan av den beredda mikrobrickan genom att spruta den med 70% etanol.
  5. Placera mikrobrickan i den 3D-utskrivna adaptern i plattan med en brunn.
  6. Kassera mikrobrickans lock.
  7. Fördela rikligt vattenkristaller ovanpå den 3D-tryckta insatsen mellan mikrobrickans yttervägg och den inre väggen på enkelbrunnsplattan.
  8. Tillsätt omedelbart maskarna (avsnitt 8) eller försegla mikrobrickan för att använda nästa dag. Stäng bricklocket och använd en enda bit Parafilm för att linda alla fyra sidorna för att försegla mikrobrickan. Upprepa tätningssteget med Parafilm ytterligare två gånger för totalt tre lager.
  9. Efter försegling av mikrobrickan, lämna den på bänken vid RT i upp till 4 dagar innan maskarna tillsätts (avsnitt 8).

8. Lägga maskar i mikrofacket

OBS: En mask kan läggas till manuellt i varje brunn genom att överföra djur från de ålderssynkroniserade maskpopulationerna (avsnitt 2) med hjälp av en platinaplockning. Överför endast djur i önskat livsstadium. Om överföringsprocessen tar mer än 1 timme kan lmNGM i mikrobrickbrunnarna torka ut. Att överföra grupper om 10 till 20 maskar åt gången kan påskynda detta steg, men det tar lite övning att konsekvent släppa bara ett enda djur per brunn.

  1. Tillsätt en nematod per brunn när de når önskat livsstadium.
  2. Sätt tillbaka locket över mikrobrickan när du plockar maskar från källplattan för att minimera kontaminering.

9. Avsluta förberedelserna av kulturmiljön för långvarig användning

OBS: Stegen nedan utförs för att säkerställa att media och maskar i mikrobrickan förblir hydratiserade under experimentets varaktighet.

  1. Tillsätt ~ 40 μL av tvättmedelslösningen på locket på en platta med en brunn och använd en arbetsduk för att jämnt täcka locket. Denna beläggning förhindrar kondens över tiden när plattan är förseglad. Använd ytterligare arbetsservetter för att sprida tvättmedelslösningen tills synen genom locket inte förvrängs (detta tar vanligtvis ungefär två arbetsservetter).
  2. Undersök vattenkristallerna för att säkerställa att de båda är i nivå med mikrobrickans övre kant och inte överflödar. Tillsätt eller ta bort vattenkristaller på plattan vid behov.
  3. Använd följande tillvägagångssätt, linda in brickan med Parafilm (totalt tre stycken) för att säkerställa att Parafilm-tätningen håller länge.
    1. Sträck den första biten Parafilm något för att täcka två sidor av brickan.
    2. Sträck den andra biten Parafilm något och täck de återstående sidorna av brickan.
    3. Sträck ut den sista biten av Parafilm och linda in alla fyra sidor av brickan helt och täck den första och andra biten av Parafilm. En ordentligt förseglad mikrobricka kan förbli hydratiserad i ~ 2 månader.
      OBS: Övervaka Parafilms integritet var 1-2: e vecka under hela experimentet och byt ut vid behov.
    4. Torka av toppen av facket med en specialtorkning, fuktig med 70% etanol, för att ta bort eventuella fingeravtryck.
  4. Märk plattan med en brunn med tejp. Mikrobrickan är nu redo för bildbehandling och långtidslagring för att övervaka maskar över tid. Håll facket vid 20 °C mellan bildsessionerna. Mikrobrickan kan öppnas och återförslutas flera gånger för läkemedelsdosering eller andra procedurer, men bör minimeras för att förhindra kontaminering och fuktförlust.

10. Avbildning av enskilda maskar i mikrobrickbrunnar

OBS: Syftet med detta protokoll är att ge en detaljerad beskrivning av hur man förbereder mikrobrickkulturmiljön. När mikrobrickans enkelmaskodlingsmiljöer väl är förberedda och befolkade med maskar kan de användas för att longitudinellt övervaka många fenotyper med hjälp av tekniker som är etablerade för standardodling på Petri-plattor. Följande avsnitt innehåller grundläggande instruktioner för mätning av några vanliga fenotyper. Fluorescerande avbildning måste utföras i upprätt mikroskop. Brytning av ljus genom Terasaki-brickan minimeras i ett mörkt rum.

  1. Livslängd: Mät livslängden genom att försiktigt knacka på sidan eller toppen av plattan eller lysa ett starkt blått ljus på plattan och observera varje djur. Gör ett djur "dött" om det inte rör sig inom några sekunder. Upprepa denna uppgift var 1-3: e dag tills alla maskar har dött.
    OBS: Mikrofackkulturmiljön är kompatibel med system som automatiserar bildinsamling och analys för livslängdsuppskattning14,19.
  2. Standardmikroskopi: Utför ljusfältsavbildning (eller mörkfältsavbildning) på enskilda brunnar eller på hela brickan med en högupplöst kamera eller skanner. Dessa bilddata kan användas för en mängd olika fenotyper, inklusive djurstorlek 22,23,24, utveckling 25, aktivitet 14,19 och livslängd.
  3. Fluorescerande mikroskopi: Utför fluorescerande avbildning på enskilda brunnar antingen manuellt eller med ett motoriserat plattformssystem. Brickorna med en brunn är kompatibla med vanliga plattadaptrar med flera brunnar. Signal-till-brus minimeras om apparaten placeras i en svartväggig låda.
    OBS: Eftersom maskarna avbildas medan de förblir fria att krypa, är detta odlingssystem väl lämpat för lågupplöst avbildning för att fånga helkroppsfluorescens och grov vävnadslokalisering av fluoroforer. Högupplöst och högförstoringsavbildning kräver vanligtvis att djuren immobiliseras för att förhindra rörelse. Även om det bör vara möjligt att lokalt applicera ett förlamande medel (t.ex. natriumazid eller levamisol) på varje brunn och fortsätta med högre upplösning, skulle detta utesluta upprepade mätningar av samma mask vid senare tidpunkter. Odlingssystemet, som beskrivits, är inte heller avsett att inverteras, vilket förhindrar användning av inverterade mikroskopsystem.
    1. Om brightfield inte används för att mäta livslängden och endast fluorescens fångas upp, mät livslängden manuellt. Att lämna det blå ljuset (används för GFP-excitation) på masken i 5 s kommer att uppmana djuret att röra sig. Om djuret inte har rört sig inom 5 s, betrakta djuret som dött.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den mikrobrickbaserade enmaskodlingsmiljön som beskrivs här kan användas för att övervaka en mängd olika fenotyper, inklusive livslängd och hälsospan, aktivitet och rörelse, kroppsform och krypgeometri och uttrycket av transgent uttryckta fluorescerande biomarkörer hos enskilda djur över tid. Mikrobrickodlingssystemet är kompatibelt med livslängdsanalys genom antingen manuell poängsättning eller bildinsamling och nedströms bildanalys. Som med standardkultur på Petri-plattor21 kan maskar manuellt poängsättas som döda eller levande baserat på rörelse efter en stimulans (t.ex. knackning på plattan eller exponering för blått ljus). För bildbaserad livslängdsanalys används en jämförelse av ram-till-ram-skillnader mellan bilder som tagits efter att stimulansen har applicerats för att bestämma när varje mask slutar röra sig. Detta är kompatibelt med automatiserade bildinsamlings- och analyssystem och ger ytterligare data i form av aktivitetsnivån för enskilda djur vid varje tidpunkt. Denna information kan sedan användas inte bara för att uppskatta livslängden (upphörande av rörelse), utan också hälsospannet (en tröskel för minskad aktivitet; flera definitioner har föreslagits). Ytterligare parametrar (kroppsstorlek, form och hållning) kan också mätas från dessa bilder.

De viktigaste egenskaperna hos detta mikrobrickodlingssystem är (1) förmågan att spåra enskilda djur över tid, (2) kompatibiliteten mellan odlingssystemet och aversiva ingrepp som kostbegränsning eller kemiska stressmedel, och (3) förmågan att mäta fluorescens direkt i odlingsmiljön. För att demonstrera dessa egenskaper exponerade vi maskar för 250 μM kopparsulfat (CuSO4) för att inducera tungmetallspänning eller 10 mM ditiotreitol (DTT) för att inducera proteinfelveckningsstress och mätt daglig aktivitet, livslängd och hälsospan. Både CuSO4och DTT minskade maskens livslängd signifikant (figur 2A). Övervakning av daglig aktivitet gjorde det möjligt för oss att uppskatta det individuella hälsospannet för varje mask, här definierat som den ålder då en mask inte längre kan röra sig en hel kroppslängd som svar på stimulansen. CuSO4 och DTT minskade hälsospannet jämfört med obehandlade kontroller (figur 2B). Däremot minskade CuSO4 andelen liv som spenderades i god hälsa, medan DTT inte gjorde det (figur 2C). CuSO4 minskade också den genomsnittliga aktiviteten hos individer inom populationen i större utsträckning än DTT i alla åldrar (figur 2D), liksom kumulativ aktivitet för varje djur under hela livslängden (beräknat som arean under aktivitetskurvan [AUC]; Figur 2E). En viktig fördel med denna mikrobricka är dess förmåga att korrelera fenotyper mätta vid olika tidpunkter över enskilda djur inom en population. I det här fallet finner vi att kumulativ aktivitet för enskilda djur fram till dag 10 korrelerar med livslängden för DTT-utmanade djur men inte för obehandlade kontroller eller CuSO 4-utmanade djur (figur 2F).

För att demonstrera förmågan att övervaka fluorescerande biomarkörer över hela livslängden använde vi mikrotrayodlingssystemet för att övervaka uttrycket av mScarlet-transgen smält till C-terminalen i kynu-1-genen, som kodar för enzymet kynureninas i kynureninens metaboliska väg, vid dess endogena locus. Vi har tidigare funnit att uttrycket av humant kynureninas, kodat av Kynu, ökar med åldern i blod26, och att knockdown av kynu-1 i C. elegans är tillräckligt för att förlänga livslängden27. KYNU-1 visar åldersberoende uttryck; det är nästan omöjligt att upptäcka vid L4-larvstadiet och toppar vid dag 9 i vuxen ålder. En drastisk ökning av uttrycket observeras mellan dag 3 och 8 i vuxen ålder, och det finns en progressiv nedgång med åldern därefter (figur 3A, kompletterande figur 1). För att bedöma förhållandet mellan KYNU-1 och C. elegans åldrande kvantifierade vi den kumulativa förekomsten av KYNU-1 fram till dag 14 i vuxen ålder (en ålder då de flesta djur fortfarande levde) och fann en signifikant korrelation med livslängden (figur 3B). Eftersom KYNU1-uttryck är dynamiskt under en livstid jämförde vi KYNU-1-uttryck i olika åldrar med total överlevnad hos enskilda djur. Vid ingen enskild tidpunkt var KYNU-1-uttryck signifikant korrelerat med överlevnad (figur 3C-F), vilket visar att livslångt uttryck är en bättre indikation på livslängdspåverkan än enstaka tidpunktsbedömningar.

Tillsammans ger dessa experiment representativa data som belyser kapaciteten hos det mikrobrickbaserade enmaskodlingssystemet för att möjliggöra dynamiska förändringar i maskaktivitet, hälsa, livslängd och fluorescerande biomarkörer som ska fångas och jämföras över åldrar hos enskilda djur. I synnerhet möjliggör möjligheten att övervaka individer vid flera tidpunkter dynamiska förändringar i både fysiologiska och molekylära fenotyper att spåras in vivo, vilket möjliggör detektion av mönster som inte skulle vara uppenbara med tvärsnittsmätningar över populationer.

Figure 1
Figur 1: Mikrobricka enmaskkulturmiljö . (A) 3D-rendering av en mikrobricka monterad i en platta med en brunn med hjälp av en anpassad 3D-tryckt adapter. (B) Schema över odlingssystemet med en mask som visar den relativa positionen för en mikrobrickbrunn med tillväxtmedium för agarosnematod med låg smält (NGM), bakteriemat, isolerade C. elegans, aversiv palmitinsyrabeläggning, den 3D-tryckta adaptern, vattenkristaller och enbrunnsplattan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Korrelation av fenotyper hos enskilda djur över populationer med hjälp av Microtray single-worm miljöer. Alla paneler tillhandahåller data från ett experiment som jämför tre grupper av vildtyp (N2) C. elegans som inte utsatts för några tillsatser (kontroll; N = 55), 250 μM kopparsulfat (CuS04; N = 38), eller 10 mM ditiotreitol (DTT; N = 34) från dag 2 i vuxen ålder. Livslängd (A) och hälsospann (B) reduceras båda måttligt genom kronisk exponering för antingen CuSO4 eller DTT. Hälsospannet definieras som den sista dagen ett djur kan röra sig minst en hel kroppslängd på tallriken. Parvis signifikans beräknas med hjälp av log-rank-testet (R survdiff-funktionen). (C) Hälsospann och livslängdsgenomsnitt inom varje population (överst: absoluta värden; nederst: normaliserade till varje grupps genomsnittliga livslängd). (D) Genomsnittlig maskaktivitet (3 dagars rullande medelvärde av daglig aktivitet) inom varje grupp under hela livslängden och (E) populationsgenomsnittet för det enskilda djurområdet under livstidsaktivitetskurvan (AUC) försämras båda väsentligt av CuSO4 eller DTT. Signifikans bestämd av Mann-Whitney U-testet för att jämföra AUC för enskilda djur mellan grupper. F) Kumulativ aktivitet för enskilda djur fram till dag 10 (nederst) korrelerar med en livslängd för djur som exponeras för DTT, men inte för kontrolldjur eller djur som exponeras för CuSO4, bestämd genom linjär regression (lm-funktion i R). n.s. = inte signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Bonferroni-metoden användes för att justera alla p-värden för multipla jämförelser. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Dynamisk kvantifiering av KYNU-1 i enskilda C. elegans under hela livslängden. C. elegans med mScarlet transgent smält i ramen till C-änden av kynu-1-genen (KYNU-1::mScarlet) avbildades med hjälp av ett fluorescerande stereomikroskop utrustat med en monokrom kamera var 1-4: e dag i 36 dagar tills alla djur hade dött. (A) KYNU-1, mätt genom daglig kvantifiering av KYNU-1::mScarlet fluorescens, visar ett distinkt åldersberoende uttrycksmönster över hela livslängden (medelvärde för maskar visas vid varje ålder). (B) Kumulativ KYNU-1::mScarlet uttryck till och med dag 14 i vuxen ålder korrelerar med livslängden hos enskilda djur. KYNU1::mScharlakansrött uttryck i larvstadiet (C) L4 (dag 0 i vuxen ålder), (D) dag 4 i vuxen ålder, (E) dag 9 i vuxen ålder och (F) dag 15 i vuxen ålder korrelerade inte med livslängden hos enskilda djur. Korrelationer beräknade med linjär regression (Data Analysis Regression-funktionen i Microsoft Excel). n.s. = inte signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Alla p-värden justerades för multipla jämförelser med Bonferroni-metoden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur 1: Enkel KYNU-1::mScarlet C. elegans avbildad under hela livslängden under röd kanal. Enkel brunn av en prefabricerad mikrobricka innehållande en enda C. elegans med mScarlet märkt KYNU-1 som lever på koncentrerad E. coli matkälla. Djuret avbildades först i L4-larvstadiet och avbildades sedan i steg om 1-5 dagar under resten av sitt liv. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Terasaki-bricka kontra WorMotel bakgrund och artefaktjämförelse under fluorescensmikroskopi. Brunnar av prefabricerade mikrobrickor (överst) eller gjutna PDMS WorMotels (botten) avbildades under GFP (A), RFP (B) och DAPI (C) fluorescenskanaler med hjälp av ett fluorescerande stereomikroskop utrustat med en monokrom kamera. Bilder visas i falsk färg och en värmekarta används för att markera mättnadspunkter. Båda kultursystemen har låg bakgrund i alla kanaler. WorMotel-plattorna är benägna att sporadiska artefakter med hög signal, som sannolikt antingen är mikrobubblor eller damm eller andra partiklar som fångas oavsiktligt under PDMS-gjutningsprocessen14,15. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 1: Microtray_adapter_2021-10-20.STL. En stereolitografifil (STL) för det 3D-tryckta skäret på vilket mikrobrickan är placerad i enbrunnsplattan. Denna fil innehåller den fullständiga versionen med en solid botten och passar bäst för användning i ett system där ljuskällan är ovanför plattan. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Microtray_adapter_bottomless_2021-10-20.STL. En stereolitografifil (STL) för det 3D-tryckta skäret på vilket mikrobrickan är placerad i enbrunnsplattan. Den här filen innehåller den bottenlösa versionen och passar bäst för användning i ett system där ljuskällan ligger under plattan. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi ett nytt odlingssystem som anpassar mikrobrickor, ursprungligen utvecklade för humana leukocytantigenvävnadstypningsanalyser, för att möjliggöra isolering och karakterisering av enstaka C. elegans över tid i en fast mediemiljö som kontextuellt liknar den agarbaserade NGM som är standarden i C. elegans forskning. Detta system är kompatibelt med en mängd olika ingrepp, inklusive kostbegränsning, exogen läkemedelsbehandling, en utmaning med kemiska eller miljömässiga stressfaktorer och RNAi. Det möjliggör vidare longitudinell övervakning av fluorescerande biomarkörer in vivo hos enskilda djur. Förmågan att följa enskilda djur inom en population gör det möjligt att inom individen bedöma variabilitet inom en population för fenotyper med en distinkt tidskomponent, inklusive beteende, patogenes, respons på stressiga förhållanden och försämrad hälsa. Det gör det också möjligt för tidiga livsegenskaper som varierar inom en befolkning att kopplas till sena livsresultat, inklusive livslängd och hälsa. I likhet med andra avbildningstekniker med en mask gör detta mikrobrickbaserade odlingssystem det möjligt att övervaka enskilda djur vid flera tidpunkter under hela livet samtidigt som potentiella störfaktorer undviks, såsom aktivering av stressresponsvägar som uppstår när maskar odlas i flytande miljöer (vilket är fallet i många mikrofluidikanordningar). Detta gör att data som samlas in i detta odlingssystem kan jämföras mer direkt med majoriteten av tidigare C. elegans arbete som utförts på fasta medier. De senaste tekniska framstegen möjliggör automatisering av många aspekter av C. elegans karakterisering, inklusive tillväxt, utveckling och åldrande28. Detta odlingssystem, i kombination med automatiserad mikroskopi och tillhörande programvara, är kompatibelt med en automatiserad insamling av livslängd, hälsospan, aktivitet och andra fysiologiska parametrar14,19.

Vi använder rutinmässigt WorMotels14,15 för att övervaka fysiologiska fenotyper (t.ex. livstidsaktivitet), hälsospann och livslängd för enskilda C. elegans under icke-stressiga förhållanden som läkemedelsbehandlingar och RNAi. Enligt vår erfarenhet ger andra avbildningstekniker med en mask ett utmärkt verktyg för att övervaka individuell variation i dessa fenotyper, men de har två begränsningar. För det första, i samband med fluorescensavbildning, tenderar PDMS-materialet som används för att forma chipet att bilda mikrobubblor och fånga små partiklar, vilka båda fluorescerar nära GFP-emissionsvåglängden. Detta genererar visuella artefakter när plattor visualiseras under olika fluorescenskanaler (kompletterande figur 2). En andra begränsning är att kopparsulfat är ett otillräckligt avskräckande medel för att förhindra flykt när maskar utsätts för ingrepp som själva är aversiva, särskilt kostbegränsning, patogena bakterier eller stressinducerande medel. Vallgraven för andra enkelmaskuppsättningar är för smal och hydrofob för att rymma palmitinsyra, vilket är ett starkare aversivt medel som vanligtvis används för att upprätthålla populationer under kostbegränsning eller andra aversiva förhållanden på Petri-plattor.

Microtray single-worm culture technology som presenteras här adresserar båda begränsningarna. Den större vallgravsstorleken och det hydrofila materialet i mikrobrickorna, tillsammans med appliceringen av värme och införandet av Tween 20, gör att palmitinsyra kan appliceras som en förbättrad aversiv barriär runt varje brunn utan att förorena lmNGM-dynorna själva. Mikrobrickornas polystyrenkonstruktion genererar endast lågnivå, konsekvent distribuerad autofluorescens, vilket undviker problemet med autofluorescerande mikrobubblor och partikelinneslutningar i PDMS (kompletterande figur 2). Både bakgrundsbrus och artefakter minskas ytterligare genom att använda en svart yta under och runt facket för att minimera diffraktionen. Vi inkluderar 3D-utskriftsfiler för både en ihålig adapter (som tillåter ljusfältsavbildning) och en solid svart adapter (som ger ett mörkfält som förbättrar både mörkfälts- och fluorescensavbildning; se Kompletterande fil 1 och Kompletterande fil 2). Medan lmNGM i sig genererar viss autofluorescens, minimeras påverkan på bildkvaliteten av den lilla brunnsvolymen. Dessa faktorer gör mikrobrickor optimala för upprepad fluorescerande avbildning av enskilda djur in vivo utan att ta bort dem från deras odlingsmiljö. Den största nackdelen med mikrobrickans enkelkultursystem i förhållande till andra enkelmaskavbildningstekniker är provstorleken; varje mikrobricka rymmer upp till 96 individuellt odlade djur, i motsats till 240-djurkapaciteten för varje WorMotel14,15. Båda erbjuder kapabla enmaskodlingssystem, och den experimentella applikationen avgör vilken som är mest lämplig.

Det finns flera begränsningar för mikrobrickkultursystemet. För det första är det mikrobrickbaserade odlingssystemet både svårare och mer tidskrävande att installera än standardodlingsmetoder med Petri-plattor. För det andra stimuleras C. elegans av flera vanliga excitationsvåglängder i fluorescensmikroskopi. Eftersom djur inte immobiliseras under avbildningsprocessen kan fluorescerande biomarkörer som kräver långa exponeringstider vara suddiga. Vi finner att det i allmänhet är tillräckligt att ta flera bilder under varje tidpunkt för att möjliggöra noggrann kvantifiering av lysrörssignalen för hela djuret. På grund av detta problem är dock mikrofackodlingssystemet inte kompatibelt med högupplöst avbildning, såsom med konfokalmikroskopi, och är inte optimalt för avbildning av lågsignalbiomarkörer. Även i ljuset av dessa begränsningar ger denna nya metod potential att förstå komplexa fysiologiska processer med tidsberoende dynamik eller hög individ-till-individuell variabilitet i samband med aktivitet och överlevnad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna uppger att de inte har några intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH R35GM133588 till G.L.S., ett NIHT32GM008659 utbildningsbidrag till L.E., ett United States National Academy of Medicine Catalyst Award till G.L.S. och State of Arizona Technology and Research Initiative Fund som administreras av Arizona Board of Regents.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printed terasaki inserts Custom printing company Robot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		 FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood Fisher Scientific 36-100-4376
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
CaCl2 Acros organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin Goldbio C-103-25
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2 Fisher Scientific G-560
FUdR  Research Products International F10705-1.0
Hydrating water crystals  M2 Polymer Technologies Type S Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera Leica Microsystems 11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope Leica Microsystems 10450826
Low-melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4  Fisher Chemical M-8900
NaCl Fisher bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Scientific 264728
Nystatin Sigma N1538
Palmitic acid Acros organics 129700010
Paper towels Coastwide Professional 365374
Parafilm M Parafilm 16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075 UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda) One Lambda 151431
Thermolyne Dri-bath Thermolyne DB28125
Tween  Thermo Scientific J20605-AP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).
  2. Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
  3. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
  4. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  5. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  6. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  7. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).
  8. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  9. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).
  10. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
  11. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
  12. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
  13. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
  14. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  15. Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  16. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  17. Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
  18. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  19. Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  21. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  22. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142 (2013).
  23. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).
  24. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), Taylor & Francis. 982437 (2014).
  25. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
  26. Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).
  27. Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
  28. Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).

Tags

Indragning utgåva 190
Långtidsodling av enskilda <em>Caenorhabditis elegans</em> på fasta medier för longitudinell fluorescensövervakning och aversiva interventioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espejo, L., Hull, B., Chang, L. M.,… More

Espejo, L., Hull, B., Chang, L. M., DeNicola, D., Freitas, S., Silbar, V., Haskins, A., Turner, E. A., Sutphin, G. L. Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions. J. Vis. Exp. (190), e64682, doi:10.3791/64682 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter