Summary
I denna studie presenteras en råttmodell av induktion av parodontit via en kombination av retentiv ligatur och repetitiva injektioner av lipopolysackarid härrörande från Porphyromonas gingivalis, under 14 dagar runt de första maxillära molarna. Ligerings- och LPS-injektionsteknikerna var effektiva för att inducera peridontit, vilket resulterade i alveolär benförlust och inflammation.
Abstract
Parodontit (PD) är en mycket utbredd, kronisk immuninflammatorisk sjukdom i parodontium, vilket resulterar i förlust av tandköttets mjukvävnad, parodontalt ligament, cementum och alveolärt ben. I denna studie beskrivs en enkel metod för PD-induktion hos råtta. Vi tillhandahåller detaljerade instruktioner för placering av ligaturmodellen runt de första maxillära molarna (M1) och en kombination av injektioner av lipopolysackarid (LPS), härrörande från Porphyromonas gingivalis på mesio-palatala sidan av M1. Induktionen av parodontit upprätthölls i 14 dagar, vilket främjade ackumulering av bakterier biofilm och inflammation. För att validera djurmodellen bestämdes IL-1β, en viktig inflammatorisk mediator, genom en immunanalys i gingival crevicular fluid (GCF), och alveolär benförlust beräknades med hjälp av cone beam computed tomography (CBCT). Denna teknik var effektiv för att främja tandköttsrecession, alveolär benförlust och en ökning av IL-1β-nivåerna i GCF i slutet av experimentproceduren efter 14 dagar. Denna metod var effektiv för att inducera PD och kunde därmed användas i studier av sjukdomsprogressionsmekanismer och framtida möjliga behandlingar.
Introduction
Parodontit (PD) är det sjätte vanligaste folkhälsotillståndet över hela världen och påverkar cirka 11% av den totala befolkningen, vilket är en avancerad, irreversibel och destruktiv form av periodontal sjukdom 1,2. PD är en inflammatorisk process som påverkar tandkötts- och parodontala vävnader, vilket resulterar i tandköttsrecession, apikal migration av korsningsepitelet med fickutveckling och förlust av alveolärt ben3. Dessutom är PD associerat med flera systemiska sjukdomar, inklusive hjärt-kärlsjukdom, fetma, diabetes och reumatoid artrit, för vilka miljö- och värdspecifika faktorer spelar en viktig roll 4,5.
Därför är PD en multifaktoriell sjukdom som främst initieras av ackumulering av mikrobiell plack - till följd av dysbios av mikrobiella samhällen - och av ett överdrivet värdimmunsvar mot parodontala patogener, vilket leder till nedbrytning av parodontal vävnad 4,6. Bland flera parodontala bakterier är den gramnegativa anaeroba bakterien Porphyromonas gingivalis en av de viktigaste patogenerna i PD4. P. gingivalis innehåller en komplex lipopolysackarid (LPS) i sina väggar, en molekyl som är känd för att inducera polymorfonukleär leukocytinfiltration och vaskulär dilatation i inflammerade parodontala vävnader7. Detta resulterar i produktion av inflammatoriska mediatorer, såsom interleukin 1 (IL-1), IL-6 och IL-8, tumörnekrosfaktor (TNF) eller prostaglandiner, med en efterföljande osteoklastaktivering och benresorption, vilket leder till vävnadsförstörelse och slutlig tandförlust3.
Bland de olika fördelarna med djurmodeller ingår förmågan att efterlikna cellulära komplexiteter som hos människor, eller att vara mer exakt än in vitro-studier , som utförs på plastytor med begränsade celltyper8. För modellering av PD experimentellt in vivo har olika djurarter använts, som icke-mänskliga primater, hundar, grisar, illrar, kaniner, möss och råttor9. Råttor är dock den mest studerade djurmodellen för patogenesen av PD eftersom de är billiga och lätta att hantera10. Deras dentala tandköttsvävnad har liknande strukturella egenskaper som mänsklig tandköttsvävnad, med en grund gingival sulcus och junctional epitel fäst vid tandytan. Dessutom, som hos människor, underlättar korsningsepitelet passagen av bakteriella, främmande material och utsöndringar från inflammatoriska celler 9.
En av de mest rapporterade experimentella modellerna av PD-induktion hos råttor är placeringen av ligaturer runt tänderna, vilket är tekniskt utmanande men tillförlitligt10. Ligaturplaceringen underlättar tandplack och bakteriell ackumulering, vilket genererar en dysbios i tandköttssulci, som orsakar parodontal vävnadsinflammation och förstörelse11. Förlust av parodontal bindning och resorption av alveolärt ben kan inträffa inom 7 dagar i denna råttmodell8.
En annan djurmodell för PD består av injektion av LPS i tandköttsvävnaden. Som ett resultat stimuleras osteoklastogenes och benförlust. De histopatologiska egenskaperna hos denna modell liknar humant etablerad PD, kännetecknad av högre nivåer av proinflammatoriska cytokiner, kollagennedbrytning och alveolär benresorption 6,8.
Således var syftet med denna studie att beskriva en enkel råttmodell av experimentell PD baserad på teknikerna för P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) injektioner, kombinerat med ligaturplacering runt de första maxillära molarna (M1). Detta är en modell med liknande egenskaper som de som observerats vid human PD-sjukdom, som kan användas i studien av sjukdomsprogressionsmekanismer och framtida möjliga behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Försöksprotokollet för studien godkändes av den etiska kommittén för djurförsök vid Balearerna Health Research Institute (CEEA-UIB; referensnummer 163/03/21).
1. Djurbedövning och beredning av procedurer
- Sterilisera alla kirurgiska instrument (munmunkavlar i aluminium, dental explorer, diamantlans, kirurgisk sax, mikrokirurgisk tång, en mikronålhållare, en hollenback-snidare, en periosteal mikrokirurgisk hiss och mikrokirurgisk sax) (5 min vid 135 ° C) före operationen.
- Bered alla lösningar som behövs för proceduren under sterila förhållanden, enligt beskrivningen:
- Bered en blandning av ketamin (60 mg/ml) och xylazin (8 mg/ml) genom att blanda 1,6 ml ketamin med 1 ml xylazin utspätt i fosfatbuffertlösning (PBS)/saltlösning. Förvara buljongen vid 4 °C.
- Späd atipamezol till en slutlig koncentration på 0,25 mg/ml i PBS/saltlösning. Förvara buljongen vid 4 °C.
- Späd buprenorfin till en slutlig koncentration på 0,03 mg/ml i PBS/saltlösning. Förvara buljongen vid 4 °C.
- Bered 1 ml Pg-LPS (1 mg/ml) i steril saltlösning. Förvara buljongen vid -20 °C.
- För experimentet, använd kvinnliga och manliga Wistar-råttor, i åldern 12 veckor och väger 210-350 g vid operationen. Håll djuren inhysta i grupper under lämpliga miljöer och konstanta förhållanden (20-24 °C, 12 timmar per dag ljus-mörka cykler), med mat och standardvatten, som erbjuds ad libitum.
- För att inducera anestesi, väg råttan och administrera blandningen av ketamin/xylazin i en koncentration av 80/10 mg/kg intraperitonealt (IP) med hjälp av en 25 G steril injektionsnål och 1 ml spruta.
- Efter att råttan har bedövats, placera djuret på ryggen på en uppvärmd kirurgisk plattform; Under proceduren täcker djurets kropp för att förhindra värmeförlust.
OBS: Anestesidjupet bedöms genom förlust av pedalreflex under proceduren och genom övervakning av vitala tecken. Om det behövs, använd en liten noskon för att bibehålla anestesi med 2% isofluran i 100% syre. Applicera steril oftalmisk salva på båda ögonen efter anestesiinduktion för att skydda hornhinnorna och förhindra torkning. - Under procedurerna, administrera 100% syre med en liten näskon och övervaka pulsfrekvensen och syremättnaden med pulsoximetri.
OBS: Om syremättnaden och pulsfrekvensen sjunker under 95% respektive 190 slag per minut, stoppa proceduren och placera djuret i lateral decubitusposition tills det når normala värden. - Öppna råttmunnen med en aluminiummungag runt framtänderna (övre och nedre), dra tillbaka tungan med den och stabilisera maxillan och underkäken i en öppen, bekväm arbetsställning, vilket möjliggör åtkomst till mandibulära molarer.
OBS: Om djuret behöver placeras i lateral decubitus, ta bort mungagen innan du ändrar sin position för att gynna återhämtning. När djuret är bedövat, samla gingival crevicular fluid (GCF) före operationen (prov i basala förhållanden) (dag 0). - Samla in GCF enligt beskrivningen i följande steg:
- Placera djuret på ryggen på en kirurgisk plattform och stabilisera maxillan och underkäken i ett öppet läge med aluminiummungags.
- Samla GCF med totalt fyra (två för varje M1) absorberande papperspunkt nr 30 (0,03 cm diameter x 3 cm längd) genom att sätta in den i tandköttssprickan (utrymmet mellan tandköttsepitel och intilliggande emalj) runt M1: s mesio-palatal tills det är lätt motstånd. Håll papperspunkten i samma position i totalt 30 sekunder innan den omedelbart tas bort.
- Efter uppsamling, överför omedelbart papperspunkten till en injektionsflaska av plast och förvara den vid -80 °C tills analysen fungerar.
2. Retentiv ligaturteknik och intragingival Pg -LPS-injektion
OBS: Ligaturmodellen skapades (dag 0) genom att placera en steril flätad sidenligatur (5/0) runt M1 bilateralt inom tandköttssulcus med hjälp av mikrokirurgiska instrument och säkra den med kirurgens knutar på palatalytan. De mikrokirurgiska instrument som användes var mikrokirurgiska tänger, en mikronålhållare, en hollenbackskärare, en periosteal mikrokirurgisk hiss och mikrokirurgisk sax. Kirurgiska luppar med LED-ljuskälla användes också (3,6x förstoring).
- Placera suturens distala svans på tandprotesens palatala sida och sätt in det proximala segmentet mellan kontakten mellan M1 och andra maxillära molar (M2).
- Använd periosteal mikrokirurgisk hiss för att sätta in suturen i sulcus. Linda ligaturen runt den buckala ytan på M1 mycket noggrant, eftersom vävnaderna på denna nivå presenterar en smal zon av fäst tandkött. På den palatala aspekten, se till att suturen är åtdragen i båda ändarna för att säkerställa att den drivs in i tandköttssulcusen.
OBS: Om motstånd observeras när suturen sätts in mellan M1 och M2, kan kontakten öppnas något med hjälp av en dental explorer och diamantlansformad bur. - Bind suturens ändar med en kirurgknut och trimma svansarna så korta som möjligt. Sätt in knuten i sulcusen.
OBS: Tips av kirurgiska instrument kan orsaka oralt trauma och blödning. Förbered små segment av gasväv eller en bomullspinne för att ta bort blod från munhålan och applicera tryck för att stoppa blödning. Noggrann mjukvävnadshantering med ett mikrokirurgiskt tillvägagångssätt minimerar kirurgiska komplikationer och leder till mindre vävnadstrauma. - Efter ligaturpositionering injiceras 40 μl Pg-LPS i steril saltlösning med en 25 G steril injektionsnål och en 1 ml spruta till den subgingivala vävnaden (mellan tandroten eller tandhalsen och tandköttskanten) bilateralt på den mesio-palatala sidan av M1 (dag 0).
3. Förfarandets slut
- Efter ligeringspositionering och Pg-LPS-applikation, släpp råttan från det kirurgiska tillståndet och placera den i en ren individuell bur under en värmelampa.
- Injicera antagonisten Atipamezol (0,5 mg/kg subkutant (SC)) med en 25 G steril injektionsnål och en 1 ml spruta.
- För smärtlindring, injicera 0,03 mg/kg buprenorfin, SC.
- Övervaka djurets återhämtning tills effekterna av operationen är helt omvända. Inhysa varje råtta individuellt i lämplig miljö under konstanta förhållanden (20–24 °C, 12 timmar per dag i ljus-mörker-cykler). Erbjud mat och avjoniserat vatten ad libitum.
- Under de första 2 dagarna efter ingreppet, väg djuren och injicera Buprenorfin SC två gånger dagligen för smärtlindring.
OBS: Buprenorfin kan administreras innan proceduren påbörjas för att eliminera avvecklingseffekten. - Under försökets gång, övervaka djuren efter vikt och allmän beteendebedömning en eller två gånger i veckan.
4. Uppföljning efter förfarandet
OBS: Induktionen av PD bibehölls i 14 dagar för att främja ackumulering av bakteriebiofilm och därmed inflammation. Ligaturerna måste undersökas och justeras, och Pg-LPS injiceras tre gånger per vecka (dag 2, dag 4, dag 6, dag 8, dag 10 och dag 12).
- Undersök och justera ligaturen (dag 2, dag 4, dag 6, dag 8, dag 10 och dag 12) enligt följande:
- Bedöva med 2% isofluran i 100% syre med hjälp av en anestesiinduktionskammare.
- Efter att råttan är bedövad, placera djuret på ryggen och använd en liten noskon under proceduren med 1% isofluran i 100% syre för underhåll av djurbedövningen.
- Öppna råttmunnen med hjälp av aluminiummunnen runt framtänderna (övre och nedre), dra tillbaka tungan med den och stabilisera maxillan och underkäken i en öppen, bekväm arbetsställning, vilket möjliggör åtkomst till ligaturer.
- Dra åt ligaturerna mot tandköttet med hjälp av en periosteal mikrokirurgisk hiss och se till att ligaturernas sutur sätts in, vilket skapar inflammation runt tandköttet.
OBS: Det är möjligt att 7-10 dagar efter operationen förloras ligaturer. Om detta händer, följ protokollet som förklaras för injektion av Pg-LPS (steg 2.4).
- Efter ligaturjusteringen injiceras bilateralt 40 μl Pg-LPS med en 25 G steril injektionsnål och en 1 ml spruta till den subgingivala vävnaden på mesio-palatala sidan av M1 (dag 2, dag 4, dag 6, dag 8, dag 10 och dag 12).
- Ta bort noskonen för anestesi och placera råttan i buret. Övervaka djurets återhämtning tills effekterna av anestesin är helt omvända.
5. Djuroffer och analys
OBS: Det finns olika alternativ för att utvärdera utvecklingen av PD. Här består den beskrivna analysen av en utvärdering av proinflammatoriska cytokiner vid gingival crevicular fluid (GCF) och en utvärdering av förlusten av alveolärt ben.
- På dag 14 av studien (dag 14), offra djuren med CO2 i en koldioxidkammare. En förskjutningshastighet på 30% till 70% av kammarvolymen/min rekommenderas för gnagare.
OBS: Brist på djurrespons på pedalreflex och frånvaro av vitala tecken måste verifieras för att bekräfta avlivning. - Samla in GCF enligt beskrivningen i följande steg:
OBS: GCF samlas in före PD-induktion (före operation) (dag 0) och efter PD-induktion (efter offer) (dag 14).- Placera djuret på ryggen på en kirurgisk plattform och stabilisera maxillan och underkäken i ett öppet läge med aluminium mungags.
- Samla upp GCF med adsorbentpapperspunkt nr 30 (0,03 cm diameter x 3 cm längd) genom att föra in den i tandköttssprickan runt M1:s mesio-palatal tills det är lätt motstånd. Håll papperspunkten i samma position i totalt 30 sekunder innan den omedelbart tas bort.
- Efter uppsamling, överför omedelbart papperspunkten till en injektionsflaska av plast och förvara vid -80 °C tills analysen fungerar.
- För att utvärdera proteiner inom GCF, förbered följande lösningar och följ stegen i elueringsmetoden enligt beskrivningen:
OBS: IL-1β utvärderas på GCF (dag 14) med hjälp av en immunanalys, enligt tillverkarens protokoll.- Förbered elueringsbufferten färsk och håll den på is under hela extraktionsprocessen för att hämma proteasaktiviteten.
- Bered alla lösningar som behövs för elueringsbufferten enligt beskrivningen:
- Bered 1 ml aprotinin (1 mg / ml) i ultrarent vatten.
- Bered 10 ml fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) (200 mM) i metanol.
- Tillsätt 125 μl PMSF och 250 μl aprotinin till 24,5 ml PBS-lösning (pH = 7,4) för att bereda elueringsbufferten.
- Lös upp en tablett för kommersiell fosfatashämmare med 10 ml nyberedd elueringsbuffert i 10 minuter under omrörning vid 4 °C.
OBS: Varaktigheten av GCF-eluering är begränsad; Använd omedelbart för centrifugering efter tillsats av fosfatashämmare tablett inom de första 30 minuterna. - Efter tillsats av fosfatashämmaren, tillsätt 11 μL fullständig elueringsbuffert direkt på röret med papperspunkterna.
- Centrifugera röret vid 452 x g i 5 min vid 4 °C.
- Överför det eluerade innehållet till en ny injektionsflaska av plast. Upprepa denna process ytterligare fyra gånger för att få en total volym på 50 μl.
- Efter den sista centrifugeringen tillsätts en total volym på 60 μl direkt på papperspunkten och centrifugeras en sista gång vid 452 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Använd önskad volym eluerad för proteinutvärdering.
- Efter eutanasi och GCF-insamling, med hjälp av kirurgisk sax, skär ut råttornas överlägsna käke. Försök att avlägsna råttans mask och lämna så lite mjukvävnad som möjligt.
- Placera käken i mikroskopsteget för visualisering och ta en bild med önskad förstoring.
- Placera käken direkt i 4% paraformaldehyd (PFA) utspädd i PBS. Uppdatera två gånger i veckan med ny PFA i 12 dagar för en fullständig fixering.
VARNING: Steg som involverar PFA bör utföras i ett dragskåp enligt rekommendationerna i säkerhetsdatabladet. - Efter fullständig käkfixering, utvärdera benförlust med hjälp av en CBCT-skanner (cone-beam computed tomography) enligt följande:
- Öppna datorn.
- Öppna CBCT-analysprogrammet.
- Välj Scan Protocol > Denture Scan Mode.
- Välj synfält (FOV) > ( 11x8) HIRes ( 90 kV spänning och 3 mA ström).
- Placera råttornas fasta övre maxilla i portalen.
- Klicka på Nästa.
- Klicka på röntgenavfyrningsknappen (tryck på röntgenfjärrkontrollen för att göra emissionen och håll den intryckt under hela skanningen).
- Om det behövs, flytta den övre maxillan i mitten av frontplanet genom att trycka på kontrollknappen och klicka sedan på röntgenavfyrningsknappen (tryck på röntgenfjärrkontrollen för att göra emissionen och håll den intryckt under hela skanningen).
- Klicka på Nästa.
- Klicka på röntgenavfyrningsknappen (tryck på röntgenfjärrkontrollen för att göra emissionen och håll den intryckt under hela skanningen).
- Om det behövs, flytta protesen i mitten av sagittalplanet genom att trycka på kontrollknappen och klicka sedan på röntgenavfyrningsknappen (tryck på röntgenfjärrkontrollen för att göra emissionen och håll den intryckt under hela skanningen).
- Klicka på Nästa.
- Klicka på Start-knappen (tryck på röntgenfjärrkontrollen för att göra emissionen och håll den intryckt under hela tentamen). Vänta tills du får ett bearbetningsmeddelande och följ sedan instruktionerna som visas.
- En fönstervy visas. Reglera gråtonen till 65 % och klicka på Använd.
- För att spara skanningen, klicka på Arkiv och spara den i DICOM-format. Klicka sedan på Alla bilder och i fönstret DICOM-exportval väljer du alla parametrar som visas (inledande bild, original axiell, omformaterad axiell, multiplan) och väljer fördefinierad typ.
- Bearbeta maxillära molarernas tvådimensionella och sagittala representativa bilder med hjälp av ett analysprogram enligt följande:
- Öppna programvaran.
- Klicka på Arkiv och öppna och välj sedan mappen med bilder i DICOM-format och klicka på Öppna.
- Vänta tills fönstret "Konvertera till 8 bitar" visas, välj intervallet från 0 till 6 000 och klicka på OK.
- Klicka på Raw-bilder.
- Definiera markeringens övre och nedre del för att begränsa intresseområdet. Sök efter den första och sista bilden där alveolärt ben visas och markera den med toppen av markeringen och botten av markeringskommandona.
OBS: Representativa tvådimensionella bilder av molarbenets alveolära ben kan exporteras, som i figur 3A, B. - För sagittala representativa bilder, klicka på Växla profilfält.
- Rita en sagittal linje i mitten av gommen och klicka på Dela upp modell. Bestäm parametrar för att avgränsa området av intresse (segmentavstånd: 1; antal segment: 100) och klicka på OK. Vänta tills segmenteringsmodellen är slut. Klicka slutligen på spara Resliced images.
OBS: Representativa sagittala föreställningar av molarernas alveolära ben kan exporteras, som i figur 3C, D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tidslinje för de experimentella stegen presenteras i figur 1. Figur 2A visar en bild av mandibula efter kirurgisk ingrepp, med ligaturplacering runt sulcus av M1 vid tidpunkten 0 av experimentet. Figur 2B visar hur ligaturen runt M1 efter 14 dagars ingrepp kommer in i tandköttssulcusen, vilket orsakar inflammation i tandköttet och infiltrerar ackumulering.
Figur 1: Schematisk representation av tidslinjen för det experimentella förfarandet för parodontit (PD) induktion hos råttor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Representativa tvådimensionella bilder (figur 3; röd fyrkant) visar skillnader i alveolär benförlust i mandibulan mellan basalkontrollen, som visar mer benvolym (figur 3A), och efter PD-etablering, som visar högre alveolär benförlust (figur 3B). Vidare belyser analysen av sagittalbilderna den större alveolära benförlusten i det interradikulära benområdet i M1 (figur 3D; röd pil) och M2 (figur 3D; grön pil) efter PD-etablering, jämfört med den basala kontrollgruppen (figur 3C). Dessutom kännetecknades alveolär benresorption av en ökning av utrymmet mellan cementemaljkorsningen (CEJ) och alveolär benvapen (ABC). Avståndet mellan CEJ och ABC i båda råttgrupperna visas i figur 3C,D med blå pilar. Etablerad PD utvecklade stora utrymmen mellan CEJ och ABC (figur 3D), jämfört med basalkontrollen (figur 3C).
Vid offerögonblicket presenterade bilder av gommen skillnader i tandköttsrecession i M1 i de olika grupperna (figur 4A, B). PD-gruppen (figur 4B) visar en större apikal tandköttsmigration på grund av förlust av benstöd och rotexponering jämfört med den basala kontrollgruppen (figur 4A). Dessutom presenterade PD-gruppen (figur 4B) en större inflammation i tandköttet runt maxillära molarer jämfört med den basala kontrollgruppen (figur 4A). Figur 4C visar resultaten av analysen av proinflammatoriskt cytokin IL-1β från GCF, vilket visar en signifikant högre frisättning av IL-1β som visas i PD-gruppen jämfört med kontrollgruppen. Enligt litteraturen deltar IL-1β i inflammation, immunreglering och benresorption vid parodontit och är en stark stimulator för periodontal vävnadsförstörelse12.
Figur 2: Bilder av ligaturen som sätts in i sulcus på M1 vid olika tidpunkter. (A) Råttgom med ligaturplacering runt M1, 0 dagar efter införandet av ligaturen. (B) Råttgom med ligaturplacering runt M1, 14 dagar efter införandet av ligaturen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa tvådimensionella bilder av alveolärt ben och maxillära molarer. Representativa tvådimensionella foton erhållna genom CBCT av alveolärt ben av maxillära molar (röd fyrkant) av (A) basalkontrollen och (B) etablerad parodontit (PD) i 14 dagar med ligaturinsättning och Pg-LPS-injektion. Representativa sagittala tvådimensionella vyer av maxillära molarer av (C) basalkontrollen och (D) PD. De röda pilarna indikerar det interradikulära alveolära benområdet på M1, de blå pilarna indikerar avståndet mellan CEJ och ABC och de gröna pilarna indikerar det interradikulära alveolära benområdet på M2. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa bilder av gommen. Representativa bilder av gommen efter avlivning av (A) basalkontrollgruppen och (B) parodontit (PD) gruppen, behandlade i 14 dagar med ligaturinsättning och Pg-LPS-injektion. (C) Bestämning av IL-1β-koncentrationer i GCF i den basala kontrollgruppen och PD-gruppen (n = 9). Data representerar medelvärdet ± SEM. Resultaten jämfördes statistiskt av Kruskal-Wallis: * p < 0,05 PD-gruppen jämfört med basalkontrollgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod beskriver induktionen av PD hos råttor efter en kombinerad teknik med Pg-LPS-injektioner och ligaturplacering runt M1, vilket avslöjar att signifikanta förändringar i parodontala vävnader och alveolärt ben kan induceras inom 14 dagar efter denna metod.
Under denna procedur måste uppmärksamhet ägnas åt olika kritiska steg. Under djurbedövning och procedurberedning är bedömning av korrekt anestesi under den kirurgiska processen avgörande för dess framgång, liksom att säkerställa korrekt positionering av djuret, stabilisera den öppna råttmunnen med aluminiummunnen runt snittarna och undvika att djuren skadas med munkavle och kirurgiska instrument. Om syremättnad och pulsfrekvens faller, bör proceduren stoppas och djuret placeras i lateral decubitusposition tills det når normala värden. Under ligaturpositionen är det viktigt att suturen och knuten sätts in korrekt i sulcus, med tanke på att mjukvävnadsskada bör minimeras för att förhindra smärta och inflammation i andra områden. Med hänsyn till etiska frågor om djurens välbefinnande är det viktigt att övervaka djurets återhämtning tills effekterna av bedövningen är helt omvända. Smärtstillande läkemedel under de första 2 dagarna efter proceduren är oumbärlig. Övervakning av djurens vikt och beteende är också viktigt för att bedöma hur väl råttan tål proceduren och säkerställa att den inte uppvisar någon extrem nöd. Under protokollet efter proceduren för injektion av Pg-LPS och justering av ligaturen till den subgingivala vävnaden runt M1 är det först och främst viktigt att dra åt och flytta ligaturen i en apikal position för att skapa inflammationen. För det andra är det viktigt att bilateralt injicera Pg-LPS med försiktighet för att inte orsaka oralt trauma. Dessutom måste man vara försiktig när man bedövar djuret, och det bör övervakas tills återhämtning. Under insamlingen av GCF bör det kalibrerade papperet hållas på samma position under samma totala tid, och det är viktigt att sätta in det i samma tandköttskreva runt mesio-palatal M1. Under GCF-elueringsstegen är det viktigt att använda elueringsbufferten omedelbart efter tillsats av den kommersiella fosfatashämmaretabletten. Ett sista kritiskt steg i protokollet är under CBCT-skanningar; En korrekt anpassning av proverna och analysprotokollet är avgörande för att få tolkningsbara resultat.
Variationen av varje djurs specifika exponering för Pg-LPS-injektion och den retentiva ligaturen runt M1 kan inkluderas som orsaker till att inte uppnå rätt inflammation och den därav följande benresorptionen. Även om goda resultat uppnås vid induktion av PD genom att använda denna procedur, är det viktigt att noggrant minska variationen mellan djur genom att följa protokollet noga. En av de viktigaste modifieringarna av metoden är placeringen av den retentiva ligaturen runt M1, och inte runt M2, den mest traditionella ligaturmodellen i litteraturen13,14,15. Operationsproceduren för ligaturplacering hos möss eller råttor utgör tekniska svårigheter och utgör en potentiell utmaning för många forskare på grund av den lilla storleken på murin munhåla och tänder11,16. Användningen av råttor och placering av ligaturen runt M1 underlättade manipulationen och tillgången till området, vilket också minskade djurets stress under proceduren. Inget djurlidande observerades under protokollet, men om någon råtta visar tecken på nöd, överväg att ta bort dem från experimentet för att förhindra lidande. Slutligen är det mest begränsande steget i proceduren att undvika förlust av ligaturen, vilket kan hända 7-10 dagar efter operationen. För att öka och bibehålla sjukdomsintensiteten med tiden är det viktigt att justera ligaturerna för att upprätthålla intim kontakt med tandköttsvävnader, vilket minskar variationen i intensiteter vid parodontitinduktion mellan djur15. I allmänhet, om proceduren utförs korrekt, bör inga ändringar behövas, och konsekventa resultat kommer att erhållas.
Det är viktigt att notera att denna modell presenterar flera begränsningar. Först och främst utvecklades en teknik för studier av PD orsakad av en traumatisk skada (ligaturposition), vilket tros underlätta lokal ackumulering av bakterier och därigenom förbättra bakteriemedierad inflammation och benförlust13,10, med kombinationen av Pg-LPS-injektion. Men i själva verket efterliknar metoden inte de naturliga etiologiska faktorerna som är ansvariga för mikrobiota dysbios vid human periodontit och efterliknar inte flera andra möjliga mekanismer genom vilka parodontit kan uppstå. Dessutom är murina tandstrukturer inte identiska med människa15. Vidare, medan den presenterade metoden är effektiv för att studera akut PD, kanske den inte återspeglar den långsiktiga benförlusten och inflammatoriska infiltrationsegenskaperna vid kronisk PD16. I detalj med den metod som föreslås för utvärdering av alveolär benförlust är den vanligaste metoden för flerdimensionell utvärdering av ben mikro-CT, vilket möjliggör utvärdering av yttre faktorer och ger tredimensionella bilder av benet. Dessutom kan trabekulära benparametrar, benvolym och benmineraldensitet analyseras utan att bryta benen14,17. Användningen av CBCT för bedömning av alveolär benförlust föreslogs dock här (figur 3) som ett alternativ till mikro-CT; Även om bilder med lägre upplösning erhålls, ger det också en användbar kvalitativ och kvantitativ analys av parodontit progression18,19,20. Så, CBCT-undersökningar ger en exakt metod för avbildning, mer tillgänglig och tillgänglig än mikro-CT, vilket skulle underlätta studier av parodontitinduktion hos råttor.
Bland de olika djurmodeller som har använts för att efterlikna PD in vivo16 för att bedöma tandbärande vävnader (tandkött och ben) under välkontrollerade förhållanden har den ligaturinducerade PD-modellen använts i stor utsträckning hos råttor, hundar och icke-mänskliga primater13. Litteraturen indikerar också att, trots att de används i vissa protokoll, resulterar användningen av möss - som representerar en bekväm, billig och mångsidig modell - i en mer teknisk utmaning på grund av den relativt lilla storleken på musens munhåla jämfört med råttor13. Jämfört med andra modeller erbjuder den ligaturinducerade PD-råttmodellen flera fördelar, inklusive snabb sjukdomsinduktion, som kan börja vid en förutsägbar tidpunkt och kulminera i alveolär benförlust inom några dagar (möss och råttor)13. Det finns andra fördelar med denna metod, såsom möjligheten att studera parodontal vävnad och alveolär benregenerering, liksom förmågan att lokalisera och dissekera inflammerad tandköttsvävnad för att bedöma inflammationsnivån15. Metoden att kombinera den ligaturinducerade PD-modellen med LPS-injektionen tillför ett lokalt destruktivt inflammatoriskt svar i parodontium som ökar förlusten av bindvävsbindning och alveolär benresorption genererad av ligaturen. Denna additiva effekt rekommenderas att öka med koncentrationen och frekvensen av LPS-injektioner10. Metoden som redovisas här presenterar ett optimerat protokoll för en kombination av ligatur med Pg-LPS-injektion, med fördelarna och betydelsen av båda metoderna.
Optimering och utveckling av säkra och ekonomiska in vivo-modeller av PD är avgörande för att underlätta förståelsen av patogenesen av periodontal sjukdom och testa nya terapeutiska metoder. PD-modellen av den kombinerade tekniken med Pg-LPS-injektioner och ligaturplacering runt M1 som presenteras här bedöms vara en attraktiv studiemodell för att undersöka värd-mikrobinteraktioner, inflammation i parodontit och alveolär benresorption. Denna modell identifierar de mest kritiska uppsättningarna av protokollet, beskriver dem i bildbaserad teknisk detalj och standardiserar och optimerar användningen av dessa kombinerade tekniker. Användning av ytterligare tekniker för utvärdering av parodontit progression kan vara möjlig, inklusive histologiska analyser av både det alveolära benet och omgivande bifogade tandkött, bestämning av andra cytokiner involverade i inflammation och karakterisering av oral mikrobiota. Även om modellen inte kan återspegla alla aspekter av mekanismerna eller orsakerna till PD hos människor, avslöjar denna studie att signifikanta degenerativa och inflammatoriska förändringar i parodontala vävnader och alveolärt ben kan induceras 14 dagar efter interventionen, vilket ger grunden för framtida prekliniska förebyggande eller behandlingsstudier för periodontal sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept call 2020), av Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, medfinansierat av ESF Europeiska socialfonden och Eruf Europeiska regionala utvecklingsfonden (kontrakt till M.M.B; FI18/00104) och av Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (kontrakt med M.M.F.C; FPI/040/2020). Författarna tackar Dr. Anna Tomás och Maria Tortosa för deras hjälp vid den experimentella operationen och plattformen för IdISBa. Slutligen, tack till ADEMA School of Dentistry för tillgången till CBCT-skannern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
References
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
