Summary
Neste estudo, um modelo de indução de periodontite em ratos é apresentado através de uma combinação de ligadura retentiva e injeções repetitivas de lipopolissacarídeo derivado de Porphyromonas gingivalis, durante 14 dias ao redor dos primeiros molares superiores. As técnicas de ligadura e injeção de LPS foram eficazes na indução de peridontite, resultando em perda óssea alveolar e inflamação.
Abstract
A periodontite (DP) é uma doença imuno-inflamatória crônica de alta prevalência do periodonto, que resulta em perda de tecido mole gengival, ligamento periodontal, cemento e osso alveolar. Neste estudo, um método simples de indução de DP em ratos é descrito. Fornecemos instruções detalhadas para a colocação do modelo de ligadura ao redor dos primeiros molares superiores (M1) e uma combinação de injeções de lipopolissacarídeo (LPS), derivado de Porphyromonas gingivalis na face mesio-palatal do M1. A indução da periodontite foi mantida por 14 dias, promovendo o acúmulo de biofilme bacteriano e inflamação. Para validar o modelo animal, a IL-1β, um mediador inflamatório chave, foi determinada por imunoensaio no fluido crevicular gengival (GCF), e a perda óssea alveolar foi calculada por meio da tomografia computadorizada de feixe cônico (TCFC). Esta técnica mostrou-se eficaz em promover recessão gengival, perda óssea alveolar e aumento dos níveis de IL-1β no GCF ao final do procedimento experimental após 14 dias. Esse método mostrou-se eficaz na indução da DP, podendo ser utilizado em estudos sobre mecanismos de progressão da doença e futuros possíveis tratamentos.
Introduction
A periodontite (DP) é a sexta condição de saúde pública mais prevalente no mundo, afetando aproximadamente 11% da população total, sendo uma forma avançada, irreversível e destrutiva da doença periodontal 1,2. A DP é um processo inflamatório que afeta os tecidos gengival e periodontal, resultando em recessão gengival, migração apical do epitélio juncional com desenvolvimento de bolsa e perda de osso alveolar3. Além disso, a DP está associada a várias doenças sistêmicas, incluindo doenças cardiovasculares, obesidade, diabetes e artrite reumatoide, para as quais fatores ambientais e específicos do hospedeiro desempenham um papelsignificativo4,5.
Assim, a DP é uma doença multifatorial iniciada primariamente pelo acúmulo de placa microbiana - resultante da disbiose das comunidades microbianas - e por uma resposta imune exagerada do hospedeiro aos patógenos periodontais, o que leva à quebra do tecido periodontal 4,6. Dentre as várias bactérias periodontais, a bactéria anaeróbia gram-negativa Porphyromonas gingivalis é um dos principais patógenos na DP4. P. gingivalis contém um complexo lipopolissacarídeo (LPS) em suas paredes, molécula conhecida por induzir infiltração leucocitária polimorfonuclear e dilatação vascularem tecidos periodontais inflamados7. Isso resulta na produção de mediadores inflamatórios, como interleucina 1 (IL-1), IL-6 e IL-8, fator de necrose tumoral (TNF) ou prostaglandinas, com subsequente ativação osteoclástica e reabsorção óssea, levando à destruição tecidual e perda dentária final3.
Entre as diferentes vantagens dos modelos animais estão a capacidade de mimetizar complexidades celulares como em humanos, ou de ser mais preciso do que estudos in vitro , que são realizados em superfícies plásticas com tipos celulareslimitados8. Para a modelagem experimental in vivo da DP, diferentes espécies animais têm sido utilizadas, como primatas não humanos, cães, porcos, furões, coelhos,camundongos e ratos9. No entanto, o rato é o modelo animal mais estudado para a patogênese da DP por ser de baixo custo e fácilmanuseio10. Seu tecido gengival dentário tem características estruturais semelhantes ao tecido gengival humano, com sulco gengival raso e epitélio juncional aderido à superfície dentária. Além disso, como em humanos, o epitélio juncional facilita a passagem de bactérias, materiais estranhos e exsudatos das células inflamatórias 9.
Um dos modelos experimentais de indução de DP em ratos mais relatados é a colocação de ligaduras ao redor dos dentes, o que é tecnicamente desafiador, masconfiável10. A colocação da ligadura facilita a placa dental e o acúmulo bacteriano, gerando uma disbiose nos sulcos gengivais, que causa inflamação e destruição do tecido periodontal11. A perda da inserção periodontal e da reabsorção do osso alveolar poderia ocorrer em 7 dias neste modelo derato8.
Outro modelo animal para DP consiste na injeção de LPS no tecido gengival. Como resultado, a osteoclastogênese e a perda óssea são estimuladas. As características histopatológicas desse modelo são semelhantes às da DP estabelecida pelo homem, caracterizada por maiores níveis de citocinas pró-inflamatórias, degradação do colágeno e reabsorção óssea alveolar6,8.
Assim, o objetivo deste estudo foi descrever um modelo simples de DP experimental em ratos, baseado nas técnicas de injeção de P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), combinado com a colocação de ligaduras ao redor dos primeiros molares superiores (M1). Trata-se de um modelo com características semelhantes às observadas na DP humana, que poderá ser utilizado no estudo dos mecanismos de progressão da doença e futuros possíveis tratamentos.
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Protocol
OBS: O protocolo experimental do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Instituto de Pesquisa em Saúde das Ilhas Baleares (CEEA-UIB; número de referência 163/03/21).
1. Anestesia animal e preparo do procedimento
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos (mordaças bucais de alumínio, explorador dentário, lança de diamante, tesoura cirúrgica, alicate microcirúrgico, um suporte de microagulha, um entalhador hollenback, um elevador microcirúrgico periosteal e uma tesoura microcirúrgica) (5 min a 135 °C) antes da cirurgia.
- Preparar todas as soluções necessárias para o procedimento em condições estéreis, conforme descrito:
- Preparar uma mistura de Cetamina (60 mg/mL) e Xilazina (8 mg/mL) misturando 1,6 mL de Cetamina com 1 mL de Xilazina diluída em Solução Tampão de Fosfato (PBS)/soro fisiológico. Conservar a 4 °C.
- Diluir o atipamezol até uma concentração final de 0,25 mg/mL em PBS/solução salina. Conservar a 4 °C.
- Diluir a buprenorfina até uma concentração final de 0,03 mg/mL em PBS/solução salina. Conservar a 4 °C.
- Preparar 1 mL de Pg-LPS (1 mg/mL) em solução salina estéril. Conservar o stock a -20 °C.
- Para o experimento, utilizaram-se ratos Wistar fêmeas e machos, com idade de 12 semanas e peso entre 210 e 350 g no momento da cirurgia. Manter os animais alojados em grupos sob ambiente adequado e condições constantes (20-24 °C, ciclos claro-escuro de 12 h por dia), com ração e água padrão, oferecidos ad libitum.
- Para induzir a anestesia, pesar o rato e administrar a mistura de cetamina/xilazina na concentração de 80/10 mg/kg por via intraperitoneal (IP), utilizando uma agulha hipodérmica estéril de 25 G e seringa de 1 mL.
- Após o rato estar anestesiado, colocar o animal de costas em uma plataforma cirúrgica aquecida; Durante o procedimento, cubra o corpo do animal para evitar a perda de calor.
OBS: A profundidade da anestesia é avaliada pela perda do reflexo pedal durante o procedimento e pela monitorização dos sinais vitais. Se necessário, use um pequeno cone nasal para manter a anestesia com isoflurano a 2% em oxigênio a 100%. Aplique pomada oftálmica estéril em ambos os olhos após a indução da anestesia para proteger as córneas e evitar o ressecamento. - Durante os procedimentos, administrar oxigênio a 100% usando um pequeno cone nasal e monitorar a frequência de pulso e a saturação de oxigênio por oximetria de pulso.
OBS: Se a saturação de oxigênio e a frequência de pulso caírem abaixo de 95% e 190 bpm, respectivamente, interromper o procedimento e colocar o animal em decúbito lateral até atingir valores normais. - Abra a boca do rato com uma mordaça de alumínio ao redor dos incisivos (superior e inferior), retraindo a língua com ela e estabilizando a maxila e a mandíbula em uma posição de trabalho aberta e confortável, permitindo o acesso aos molares inferiores.
OBS: Caso o animal necessite ser colocado em decúbito lateral, retire a mordaça bucal antes de mudar de posição para favorecer a recuperação. Uma vez anestesiado o animal, coletar líquido crevicular gengival (GCF) antes da cirurgia (amostra em condições basais) (dia 0). - Colete o GCF conforme descrito pelas seguintes etapas:
- Colocar o animal de costas sobre uma plataforma cirúrgica e estabilizar a maxila e a mandíbula em posição aberta com mordaças bucais de alumínio.
- Coletar GCF utilizando um total de quatro (dois para cada M1) ponto de papel absorvente nº 30 (0,03 cm de diâmetro x 3 cm de comprimento), inserindo-o na fenda gengival (espaço entre o epitélio gengival e o esmalte adjacente) ao redor do mesio-palatal de M1 até leve resistência. Mantenha o ponto de papel na mesma posição por um total de 30 s antes da remoção imediata.
- Após a coleta, transfira o ponto de papel imediatamente para um frasco plástico e armazene a -80 °C até o desempenho do ensaio.
2. Técnica de ligadura retentiva e injeção intragengival de Pg-LPS
OBS: O modelo de ligadura foi criado (dia 0) colocando-se uma ligadura de seda trançada estéril (5/0) ao redor do M1 bilateralmente dentro do sulco gengival com instrumental microcirúrgico e prendendo-a com os nós do cirurgião na superfície palatina. Os instrumentos microcirúrgicos utilizados foram um alicate microcirúrgico, um porta-microagulhas, um entalhador hollenback, um elevador microcirúrgico periosteal e uma tesoura microcirúrgica. Também foram utilizadas lupas cirúrgicas com fonte de luz LED (aumento de 3,6x).
- Posicionar a cauda distal da sutura na face palatina da dentição e inserir o segmento proximal entre o contato de M1 e os segundos molares superiores (M2).
- Utilizar o elevador microcirúrgico periosteal para inserir a sutura dentro do sulco. Enrole a ligadura ao redor da superfície bucal do M1 com muito cuidado, pois os tecidos neste nível apresentam uma estreita zona de gengiva aderida. No aspecto palatino, certifique-se de que a sutura esteja apertada em ambas as extremidades para garantir que ela seja conduzida para o sulco gengival.
OBS: Se for observada resistência ao inserir a sutura entre o M1 e o M2, o contato pode ser levemente aberto com um explorador dental e broca em forma de lança de diamante. - Amarre as extremidades da sutura com um nó de cirurgião e corte as caudas o mais curto possível. Insira o nó no sulco.
OBS: Pontas de instrumentos cirúrgicos podem causar trauma oral e sangramento. Prepare pequenos segmentos de gaze ou um cotonete para remover o sangue da cavidade oral e aplique pressão para parar qualquer hemorragia. O manejo cuidadoso dos tecidos moles com uma abordagem microcirúrgica minimiza as complicações cirúrgicas e leva a menos trauma tecidual. - Após o posicionamento da ligadura, injetar 40 μL de Pg-LPS em solução salina estéril com agulha hipodérmica estéril 25 G e seringa de 1 mL no tecido subgengival (entre a raiz ou colo de um dente e a margem gengival) na face mesiopalatal do M1 bilateralmente (dia 0).
3. Fim do procedimento
- Após o posicionamento da ligadura e aplicação do Pg-LPS, solte o rato do estado cirúrgico e coloque-o em uma gaiola individual limpa sob uma lâmpada de calor.
- Injetar o antagonista Atipamezol (0,5 mg/kg por via subcutânea (SC)) com uma agulha hipodérmica estéril de 25 G e uma seringa de 1 mL.
- Para alívio da dor, injetar 0,03 mg/kg de Buprenorfina, SC.
- Monitore a recuperação do animal até que os efeitos da operação sejam completamente revertidos. Alojar individualmente cada rato no ambiente adequado em condições constantes (20-24 °C, ciclos claro-escuro de 12 h por dia). Ofereça comida e água deionizada ad libitum.
- Durante os primeiros 2 dias após o procedimento, pesar os animais e injetar Buprenorfina SC duas vezes ao dia para alívio da dor.
NOTA: Buprenorfina pode ser administrada antes de iniciar o procedimento para eliminar o efeito de enrolamento. - Durante o tempo do experimento, monitorar os animais por meio de avaliação de peso e comportamento geral uma ou duas vezes por semana.
4. Seguimento pós-procedimento
OBS: A indução da DP foi mantida por 14 dias para promover o acúmulo de biofilme bacteriano e consequente inflamação. As ligaduras devem ser examinadas e ajustadas, e o Pg-LPS é injetado três vezes por semana (dia 2, dia 4, dia 6, dia 8, dia 10 e dia 12).
- Examine e ajuste a ligadura (dia 2, dia 4, dia 6, dia 8, dia 10 e dia 12) da seguinte forma:
- Anestesiar com isoflurano a 2% em oxigênio a 100% com câmara de indução anestésica.
- Após anestesiar o rato, colocar o animal de costas e utilizar um pequeno cone nasal durante o procedimento com isoflurano a 1% em oxigênio a 100% para manutenção da anestesia do animal.
- Abra a boca do rato com o gag boca de alumínio ao redor dos incisivos (superior e inferior), retraindo a língua com ela e estabilizando a maxila e a mandíbula em uma posição de trabalho aberta e confortável, permitindo o acesso às ligaduras.
- Aperte as ligaduras contra a gengiva com a ajuda de um elevador microcirúrgico periosteal e certifique-se de que a sutura das ligaduras seja inserida, criando inflamação ao redor da gengiva.
NOTA: É possível que 7-10 dias após a cirurgia, ligaduras são perdidas. Se isso acontecer, siga o protocolo conforme explicado para a injeção de Pg-LPS (passo 2.4).
- Após o ajuste da ligadura, injetar-se bilateralmente 40 μL de LPS-Pg com agulha hipodérmica estéril 25 G e seringa de 1 mL no tecido subgengival da face mesiopalatina do M1 (dia 2, dia 4, dia 6, dia 8, dia 10 e dia 12).
- Retire o cone nasal para anestesia e coloque o rato em sua gaiola. Monitorar a recuperação do animal até que os efeitos da anestesia sejam completamente revertidos.
5. Sacrifício e análise de animais
NOTA: Existem diferentes opções para avaliar a progressão da DP. Aqui, a análise descrita consiste na avaliação de citocinas pró-inflamatórias no fluido crevicular gengival (GCF) e na avaliação da perda de osso alveolar.
- No dia 14 do estudo (dia 14), sacrificar os animais com CO2 em uma câmara de dióxido de carbono. Uma taxa de deslocamento de 30% a 70% do volume da câmara/min é recomendada para roedores.
NOTA: A falta de resposta do animal ao reflexo pedal e a ausência de sinais vitais devem ser verificadas para confirmar a eutanásia. - Colete o GCF conforme descrito pelas seguintes etapas:
NOTA: O GCC é coletado antes da indução da DP (antes da cirurgia) (dia 0) e após a indução da DP (após o sacrifício) (dia 14).- Colocar o animal de costas sobre uma plataforma cirúrgica e estabilizar a maxila e a mandíbula em posição aberta com paligas bucais de alumínio.
- Coletar o GCF com papel adsorvente ponto nº 30 (0,03 cm de diâmetro x 3 cm de comprimento) inserindo-o na fenda gengival ao redor do mesiopalato do M1 até obter ligeira resistência. Mantenha o ponto de papel na mesma posição por um total de 30 s antes da remoção imediata.
- Após a coleta, transfira o ponto de papel imediatamente para um frasco plástico e armazene a -80 °C até o desempenho do ensaio.
- Para avaliar as proteínas dentro do GCF, prepare as seguintes soluções e siga os passos do método de eluição conforme descrito:
OBS: A IL-1β é avaliada no GCF (dia 14) por imunoensaio, de acordo com o protocolo do fabricante.- Prepare o tampão de eluição fresco e mantenha-o no gelo durante todo o processo de extração para inibir a atividade da protease.
- Prepare todas as soluções necessárias para o buffer de eluição conforme descrito:
- Preparar 1 mL de Aprotinina (1 mg/mL) em água ultrapura.
- Preparar 10 mL de fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) (200 mM) em metanol.
- Adicionar 125 μL de PMSF e 250 μL de Aprotinina a 24,5 mL de solução de PBS (pH = 7,4) para preparar o tampão de eluição.
- Dissolver um comprimido comercial de inibidor de fosfatase com 10 ml de tampão de eluição recém-preparado durante 10 minutos sob agitação a 4 °C.
NOTA: A duração da eluição do GCF é limitada; Use imediatamente para centrifugações após a adição de comprimido inibidor de fosfatase dentro dos primeiros 30 min. - Depois de adicionar o inibidor de fosfatase, adicionar 11 μL de tampão de eluição completo diretamente no tubo com os pontos de papel.
- Centrifugar o tubo a 452 x g durante 5 min a 4 °C.
- Transfira o conteúdo eluído para um novo frasco para injetáveis de plástico. Repita este processo mais quatro vezes para obter um volume total de 50 μL.
- Após a última centrifugação, adicionar um volume total de 60 μL diretamente no ponto de papel e centrifugar uma última vez a 452 x g por 5 min a 4 °C.
- Use o volume eluído necessário para avaliação de proteínas.
- Após a eutanásia e coleta do GCF, com a ajuda de tesoura cirúrgica, corte a mandíbula superior dos ratos. Tente tirar a máscara do rato e deixar o mínimo de tecido mole possível.
- Posicione a mandíbula no estágio do microscópio para visualização e tire uma foto na ampliação desejada.
- Coloque a mandíbula diretamente em paraformaldeído (PFA) a 4% diluído em PBS. Atualize duas vezes por semana com o novo PFA por 12 dias para uma fixação completa.
CUIDADO: As etapas que envolvem PFA devem ser realizadas em um exaustor de fumaça seguindo as recomendações da Ficha de Dados de Segurança. - Após a fixação completa da mandíbula, avaliar a perda óssea com o aparelho de tomografia computadorizada de feixe cônico (TCFC), da seguinte forma:
- Abra o PC.
- Abra o programa de análise CBCT.
- Selecione Protocolo de varredura > Modo de varredura de prótese.
- Selecione Campo de visão (FOV) > ( 11x8) HIRes ( 90 kV de tensão e 3 mA de corrente).
- Coloque a maxila superior fixa dos ratos no pórtico.
- Clique em Avançar.
- Clique no botão de disparo de raios-X (pressione o controle remoto de raios-X para fazer a emissão e mantê-lo pressionado durante toda a duração da varredura).
- Se necessário, realoque a maxila superior no centro do plano frontal pressionando o botão de controle e, em seguida, clique no botão de disparo de raios-X (pressione o controle remoto de raios-X para fazer a emissão e mantê-lo pressionado durante toda a duração da varredura).
- Clique em Avançar.
- Clique no botão de disparo de raios-X (pressione o controle remoto de raios-X para fazer a emissão e mantê-lo pressionado durante toda a duração da varredura).
- Se necessário, realoque a prótese no centro do plano sagital pressionando o botão de controle e, em seguida, clique no botão de disparo de raios-X (pressione o controle remoto de raios-X para fazer a emissão e mantê-la pressionada durante toda a duração da varredura).
- Clique em Avançar.
- Clique no botão Iniciar (pressione o controle remoto de raio-X para fazer a emissão e mantê-lo pressionado durante todo o exame). Aguarde até receber uma mensagem de processamento e siga as instruções mostradas.
- Uma exibição de janela é exibida. Regule o cinza em 65% e clique em Aplicar.
- Para salvar a digitalização, clique em Arquivo e salve-o no formato DICOM. Em seguida, clique em Todas as imagens e, na janela de seleção de exportação DICOM, selecione todos os parâmetros mostrados (imagem inicial, axial original, axial reformatado, multiplanar) e selecione o tipo predefinido.
- Processar as imagens representativas bidimensionais e sagitais dos molares superiores utilizando um programa de análise, da seguinte forma:
- Abra o software.
- Clique em Arquivo e Abrir e, em seguida, selecione a pasta com imagens no formato DICOM e clique em Abrir.
- Aguarde até que a janela "Converter para 8 bits" apareça, selecione o intervalo de 0 a 6.000 e clique em OK.
- Clique em Imagens brutas.
- Defina a parte superior e inferior da seleção para limitar a região de interesse. Procure a primeira e a última imagens onde o osso alveolar aparece e selecione-o com a parte superior da seleção e a parte inferior dos comandos de seleção .
OBS: Imagens bidimensionais representativas do osso alveolar dos molares puderam ser exportadas, como na Figura 3A,B. - Para imagens representativas do plano sagital, clique em Alternar barra de perfil.
- Desenhe uma linha sagital no meio do palato e clique em Modelo de recorte. Determine parâmetros para delimitar a região de interesse (espaçamento entre fatias: 1; número de fatias: 100) e clique em OK. Aguarde até que o modelo de refatiamento termine. Por fim, clique em Salvar imagens em fatias.
OBS: Imaginações sagitais representativas do osso alveolar dos molares poderiam ser exportadas, como na Figura 3C,D.
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Representative Results
Uma linha do tempo das etapas experimentais é apresentada na Figura 1. A Figura 2A mostra uma imagem da mandíbula após a intervenção cirúrgica, com colocação de ligadura ao redor do sulco de M1 no tempo 0 do experimento. A Figura 2B mostra como, após 14 dias do procedimento, a ligadura ao redor do M1 entra no sulco gengival, causando inflamação da gengiva e acúmulo infiltrativo.
Figura 1: Representação esquemática da linha do tempo do procedimento experimental de indução de periodontite (DP) em ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Imagens bidimensionais representativas (Figura 3; quadrado vermelho) demonstram diferenças na perda óssea alveolar na mandíbula entre o controle basal, mostrando maior volume ósseo (Figura 3A), e após o estabelecimento da DP, mostrando maior perda óssea alveolar (Figura 3B). Além disso, a análise das imagens sagitais destaca a maior perda óssea alveolar na área óssea inter-radicular de M1 (Figura 3D; seta vermelha) e M2 (Figura 3D; seta verde) após o estabelecimento da DP, em comparação com o grupo controle basal (Figura 3C). Além disso, a reabsorção óssea alveolar foi caracterizada pelo aumento do espaço entre a junção esmalte cimentício (JCE) e a crista óssea alveolar (ABC). A distância entre a JEC e o ABC em ambos os grupos de ratos é mostrada na Figura 3C,D com setas azuis. A DP estabelecida desenvolveu grandes espaços entre a JEC e o ABC (Figura 3D), em comparação com o controle basal (Figura 3C).
No momento do sacrifício, as imagens do palato apresentaram diferenças na recessão gengival no M1 nos diferentes grupos (Figuras 4A,B). O grupo DP (Figura 4B) apresenta maior migração gengival apical devido à perda de suporte ósseo e exposição radicular, quando comparado ao grupo controle basal (Figura 4A). Além disso, o grupo DP (Figura 4B) apresentou maior inflamação da gengiva ao redor dos molares superiores, comparado ao grupo controle basal (Figura 4A). A Figura 4C mostra os resultados da análise da citocina pró-inflamatória IL-1β do GCF, mostrando uma liberação significativamente maior de IL-1β exibida no grupo DP em comparação com o grupo controle. De acordo com a literatura, a IL-1β participa da inflamação, regulação imunológica e reabsorção óssea na periodontite, sendo um forte estimulador da destruição do tecido periodontal12.
Figura 2: Imagens da ligadura inserida no sulco de M1 em diferentes momentos. (A) Palato de rato com colocação de ligadura ao redor do M1, 0 dias após a inserção da ligadura. (B) Pato de rato com colocação de ligadura ao redor do M1, 14 dias após a inserção da ligadura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens bidimensionais representativas do osso alveolar e molares superiores. Fotos bidimensionais representativas obtidas pela TCFC do osso alveolar dos molares superiores (quadrado vermelho) do (A) controle basal e (B) periodontite (PD) estabelecida por 14 dias com inserção de ligadura e injeção de Pg-LPS. Visões bidimensionais sagitais representativas dos molares superiores de (C) controle basal e (D) DP. As setas vermelhas indicam a área óssea alveolar inter-radicular de M1, as setas azuis indicam a distância entre a JEC e o ABC e as setas verdes indicam a área óssea alveolar inter-radicular de M2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens representativas do palato. Imagens representativas do palato após sacrifício do grupo (A) controle basal e (B) grupo periodontite (PD), tratados por 14 dias com inserção de ligadura e injeção de Pg-LPS. (C) Determinação das concentrações de IL-1β no GCF do grupo controle basal e do grupo DP (n = 9). Os ±resultados foram comparados estatisticamente por Kruskal-Wallis: * p < grupo DP 0,05 versus grupo controle basal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este método descreve a indução de DP em ratos após uma técnica combinada de injeções de Pg-LPS e colocação de ligadura ao redor do M1, revelando que alterações significativas nos tecidos periodontais e no osso alveolar poderiam ser induzidas em 14 dias após esse método.
Durante este procedimento, deve-se prestar atenção às diferentes etapas críticas. Durante a anestesia do animal e o preparo do procedimento, avaliar a anestesia adequada durante o processo cirúrgico é fundamental para o seu sucesso, assim como garantir o posicionamento correto do animal, estabilizar a boca aberta do rato com a mordaça da boca de alumínio ao redor dos incisivos e evitar que os animais sejam feridos com a mordaça e os instrumentos cirúrgicos. Em caso de queda da saturação de oxigênio e da frequência de pulso, o procedimento deve ser interrompido e o animal colocado em decúbito lateral até atingir valores normais. Durante a posição da ligadura, é essencial que a sutura e o nó sejam inseridos corretamente no sulco, considerando que a lesão de partes moles deve ser minimizada para evitar dor e inflamação em outras áreas. Levando em consideração questões éticas relacionadas ao bem-estar dos animais, é essencial monitorar a recuperação do animal até que os efeitos da anestesia sejam completamente revertidos. A medicação para dor durante os primeiros 2 dias após o procedimento é indispensável. O monitoramento do peso e do comportamento dos animais também é importante, para avaliar o quão bem o rato tolera o procedimento e garantir que ele não exiba nenhum sofrimento extremo. Durante o protocolo pós-procedimento de injeção de Pg-LPS e ajuste da ligadura ao tecido subgengival ao redor do M1, primeiramente, é importante apertar e realocar a ligadura em posição apical para criar a inflamação. Em segundo lugar, é importante injetar o LPS-Pg bilateralmente com cuidado, para não causar trauma oral. Além disso, deve-se tomar cuidado ao anestesiar o animal, e ele deve ser monitorado até a recuperação. Durante a coleta do GCF, o papel calibrado deve ser mantido na mesma posição pelo mesmo tempo total, sendo importante inseri-lo na mesma fenda gengival ao redor do M1 mesiopalatal. Durante as etapas de eluição do GCF, é importante usar o tampão de eluição imediatamente após a adição do comprimido comercial inibidor de fosfatase. Uma última etapa crítica do protocolo é durante a TCFC; Um alinhamento adequado das amostras e protocolo de análise é fundamental para a obtenção de resultados interpretáveis.
A variação da exposição específica de cada animal à injeção de Pg-LPS e a ligadura retentiva ao redor do M1 poderiam ser incluídas como razões para a não obtenção da inflamação correta e consequente reabsorção óssea. Embora bons resultados sejam alcançados na indução da DP com o uso desse procedimento, é importante reduzir de perto a variação entre os animais, seguindo o protocolo de perto. Uma das modificações mais significativas do método é a colocação da ligadura retentiva ao redor do M1, e não ao redor do M2, o modelo de ligadura mais tradicional da literatura13,14,15. O procedimento operatório para a colocação da ligadura em camundongos ou ratos apresenta dificuldade técnica e representa um desafio potencial para muitos pesquisadores devido ao pequeno tamanho da cavidade oral murina e dosdentes11,16. O uso de ratos e a colocação da ligadura ao redor do M1 facilitaram a manipulação e o acesso à área, o que também reduziu o estresse do animal durante o procedimento. Nenhum sofrimento animal foi observado durante o protocolo, mas se algum rato mostrar sinais de angústia, considere removê-los do experimento para evitar sofrimento. Finalmente, a etapa mais limitante do procedimento é evitar a perda da ligadura, que poderia acontecer de 7 a 10 dias após a cirurgia. Para aumentar e manter a intensidade da doença com o tempo, é importante ajustar as ligaduras para manter contato íntimo com os tecidos gengivais, atenuando a variabilidade de intensidades na indução de periodontite entre osanimais15. Em geral, se o procedimento for realizado corretamente, nenhuma modificação deve ser necessária, e resultados consistentes serão obtidos.
É importante ressaltar que esse modelo apresenta várias limitações. Primeiramente, foi desenvolvida uma técnica para o estudo da DP causada por lesão traumática (posição da ligadura), que se acredita facilitar o acúmulo local de bactérias e, assim, aumentar a inflamação e a perda óssea mediadas por bactérias13,10, com a combinação da injeção de LPS-Pg. Mas, de fato, o método não mimetiza os fatores etiológicos naturais responsáveis pela disbiose da microbiota na periodontite humana e não mimetiza vários outros possíveis mecanismos pelos quais a periodontite pode surgir. Além disso, as estruturas dentárias murinas não são idênticas às humanas15. Além disso, embora o método apresentado seja eficaz para o estudo da DP aguda, ele pode não refletir as características de perda óssea e infiltração inflamatória em longo prazo na DPcrônica16. Detalhadamente com a metodologia proposta para a avaliação da perda óssea alveolar, o método de avaliação multidimensional óssea mais utilizado é a micro-TC, que permite a avaliação de fatores externos e fornece imagens tridimensionais do osso. Além disso, parâmetros do osso trabecular, volume ósseo e densidade mineral óssea podem ser analisados sem a quebra dosossos14,17. Entretanto, o uso da TCFC para avaliação da perda óssea alveolar foi aqui proposto (Figura 3) como alternativa à micro-TC; Embora imagens de menor resolução sejam obtidas, elas também fornecem uma análise qualitativa e quantitativa útil da progressão da periodontite18,19,20. Assim, os exames de TCFC fornecem um método de imagem preciso, mais disponível e acessível do que a micro-TC, o que facilitaria os estudos de indução de periodontite em ratos.
Dentre os vários modelos animais que têm sido utilizados para mimetizar a DP in vivo16 para avaliar os tecidos de suporte dentário (gengiva e osso) em condições bem controladas, o modelo de DP induzida por ligadura tem sido extensivamente utilizado em ratos, cães e primatas não humanos13. A literatura também indica que, apesar de ser utilizado em alguns protocolos, o uso de camundongos – que representa um modelo conveniente, barato e versátil – resulta em um desafio mais técnico devido ao tamanho relativamente pequeno da cavidade oral de camundongos em comparação com ratos13. Comparado a outros modelos, o modelo de DP induzida por ligadura em ratos oferece várias vantagens, incluindo a rápida indução da doença, que pode começar em um tempo previsível e culminar em perda óssea alveolar em poucos dias (camundongos e ratos)13. Existem outras vantagens desse método, como o potencial para estudar o tecido periodontal e a regeneração óssea alveolar, bem como a capacidade de localizar e dissecar o tecido gengival inflamado para avaliar o nível deinflamação15. O método de combinar o modelo de DP induzida por ligadura com a injeção de LPS adiciona uma resposta inflamatória destrutiva local no periodonto que aumenta a perda de fixação do tecido conjuntivo e a reabsorção óssea alveolar gerada pela ligadura. Esse efeito aditivo é aconselhável aumentar com a concentração e frequência de injeções de LPS10. O método aqui relatado apresenta um protocolo otimizado de combinação de ligadura com injeção de Pg-LPS, com as vantagens e significância de ambos os métodos.
A otimização e o desenvolvimento de modelos in vivo seguros e econômicos de DP são fundamentais para facilitar o entendimento da patogênese da doença periodontal e testar novas abordagens terapêuticas. O modelo de DP da técnica combinada de injeções de Pg-LPS e colocação de ligadura ao redor do M1 aqui apresentado é avaliado como um modelo de estudo atraente, para investigar interações hospedeiro-micróbio, inflamação na periodontite e reabsorção óssea alveolar. Esse modelo identifica os conjuntos mais críticos do protocolo, descreve-os em detalhes técnicos baseados em imagens e padroniza e otimiza o uso dessas técnicas combinadas. O uso de técnicas adicionais para a avaliação da progressão da periodontite poderia ser possível, incluindo análises histológicas do osso alveolar e da gengiva adjacente, determinação de outras citocinas envolvidas na inflamação e caracterização da microbiota oral. Embora o modelo não possa refletir todos os aspectos dos mecanismos ou causas da DP em humanos, este estudo revela que alterações degenerativas e inflamatórias significativas nos tecidos periodontais e no osso alveolar podem ser induzidas aos 14 dias após a intervenção, fornecendo a base para futuros estudos pré-clínicos preventivos ou de tratamento para a doença periodontal.
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Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho contou com o apoio da Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Prova de conceito 2020), do Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, cofinanciado pelo FSE Fundo Social Europeu e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional do FEDER (contrato com M.M.B; FI18/00104) e pela Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (contrato com a M.M.F.C; FPI/040/2020). Os autores agradecem à Dra. Anna Tomás e Maria Tortosa pela ajuda na cirurgia experimental e plataforma do IdISBa. Finalmente, obrigado à Faculdade de Odontologia da ADEMA pelo acesso ao scanner CBCT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
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