Summary
Cet article décrit une procédure étape par étape pour établir un modèle de souris avec une fistule oronasale. La fistule oronasale a été créée en utilisant un cautérisme ophtalmologique chauffé pour endommager la partie médiane du palais dur, entraînant la formation d’une ouverture entre les cavités buccale et nasale.
Abstract
Cette étude présente une méthode utilisant la cautérisation ophtalmologique chauffée pour développer un modèle viable pour l’étude des fistules oronasales. Des souris C57BL/6 ont été utilisées pour établir le modèle de la fistule oronasale (ONF). Pour créer l’ONF, les souris ont été anesthésiées, immobilisées et leur palais dur a été exposé. Au cours de l’intervention chirurgicale, une lésion de la muqueuse de 2,0 x 1,5 mm sur toute l’épaisseur a été induite sur la ligne médiane du palais dur à l’aide d’un cautéris ophtalmologique. Il était crucial de contrôler la taille de l’ONF et de minimiser les saignements afin d’assurer le succès de l’expérience. La vérification de l’efficacité du modèle ONF a été effectuée le 7e jour après l’opération, englobant à la fois des évaluations anatomiques et fonctionnelles. La présence de la cloison nasale dans la cavité buccale et l’écoulement d’eau stérile des narines lors de l’injection dans la cavité buccale ont confirmé la réussite de la mise en place du modèle ONF. Le modèle a démontré une fistule oronasale pratique et réussie, caractérisée par un faible taux de mortalité, des changements de poids importants et une variation minimale de la taille de l’ONF. Des études futures pourraient envisager d’adopter cette méthodologie pour élucider les mécanismes de cicatrisation des plaies palatines et explorer de nouveaux traitements pour les fistules oronasales.
Introduction
La fistule oronasale (ONF), une ouverture anormale entre les cavités buccale et nasale, se manifeste cliniquement par un défaut dans une zone structurelle allant de l’apophyse alvéolaire à la luette, qui survient généralement comme une complication après la réparation d’une fente palatine1. Les patients atteints d’ONF présentent un reflux alimentaire, des troubles de l’articulation et une altération de la fonction vélopharyngée, ce qui a un impact significatif sur leur qualité de vie 2,3,4. Le taux d’ONF postopératoire varie de 2,4 % à 55 % en raison de facteurs tels que la largeur de la fente, le type de Veau et la méthode chirurgicale 5,6,7,8. De plus, le taux de récidive après la réparation de l’ONF est élevé, allant de 0 % à 43 %9.
Plusieurs nouveaux traitements se sont récemment révélés prometteurs dans le domaine de l’ONF, y compris différents matériaux, médicaments et nouvelles techniques 10,11,12,13,14,15,16,17. Une évaluation précise des effets thérapeutiques est essentielle car elle constitue la base de la sélection et du développement ultérieur des traitements ONF. Cependant, il est difficile d’obtenir une évaluation valide à court terme pour les effets thérapeutiques autres que la chirurgie, car les caractéristiques des ONF varient d’un patient à l’autre. Par conséquent, l’établissement d’un modèle de maladie ONF est nécessaire pour vérifier l’efficacité de ces méthodes de traitement.
Pendant plusieurs décennies, les chercheurs ont généré le modèle de fistule oronasale (ONF) chez diverses espèces animales, notamment les rats18,19, les porcelets20,21, les miniporcs 22 et les chiens 23, car ces espèces possèdent un palais dur substantiel adapté à la manipulation chirurgicale. Cependant, les souris ont une séquence génétique et un génome entier similaires à ceux des humains, ce qui en fait un modèle important pour la recherche et le développement de nouveaux médicaments24,25,26. De plus, les souris offrent peu de variation d’un lot à l’autre, ce qui en fait un choix favorable pour établir le modèle ONF12,13,27.
Cependant, les étapes détaillées de la création de l’ONF n’ont pas été décrites, et la stabilité de la taille de l’ONF n’a pas été prise en considération. De plus, la vérification de la formation de l’ONF reposait uniquement sur l’observation28, sans assurer une communication directe entre les cavités buccales et nasales. Elle n’a pas été démontrée par d’autres moyens, tels que la perte de poids corporel de la souris en raison de difficultés à manger causées par l’ONF. De plus, la variation normale de la taille de la plaie n’a pas été prise en compte, ce qui est crucial pour les études sur les médicaments ou les matériaux qui favorisent ou inhibent la cicatrisation des plaies. Par conséquent, il y a un fort besoin d’établir un modèle ONF stable et validé.
L’objectif de cette étude était de développer un modèle pratique d’ONF qui répond aux problèmes susmentionnés, dans l’espoir que ce protocole servira de base à de futures recherches sur les mécanismes de cicatrisation des plaies palatines et à de nouveaux traitements pour l’ONF.
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Protocol
Toutes les procédures animales de cette étude ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique de l’École de stomatologie de la Chine occidentale de l’Université du Sichuan. Des souris C57BL/6 adultes (femelles) ont été utilisées pour la présente étude.
1. Préparation chirurgicale
- Rassemblez les instruments chirurgicaux nécessaires à l’intervention : germoir, cautérisation ophtalmologique, ciseaux microchirurgicaux, pinces à épiler microchirurgicales, seringues et aiguilles (26 g x 0,63 pouce) (Figure 1A,B) (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : Avant l’intervention chirurgicale, autoclaver les instruments chirurgicaux, y compris le cautérier ophtalmologique, la pince à épiler microchirurgicale et les ciseaux microchirurgicaux, à 102,9 kPa (1,05 kg/cm2) et 121 °C pendant 20 min. - Rassemblez les fournitures chirurgicales nécessaires : champs opératoires, gants en latex, coton stérile, feuilles stériles, papier d’aluminium stérile, carton de mousse comme plate-forme chirurgicale, élastiques (qui peuvent être obtenus en déchirant un gant en latex médical) et ruban adhésif (figure 1C) (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : Utilisez un ensemble de fournitures séparé pour chaque souris, y compris des seringues et des feuilles stériles pour le champ chirurgical. - Nettoyez la zone et l’appareil chirurgical (source lumineuse, panneau de mousse et dispositif de maintien de la température, voir le tableau des matériaux) à l’aide de lingettes imbibées d’alcool. Couvrez les boutons et les poignées des instruments qui peuvent être nécessaires pendant la procédure avec du papier d’aluminium stérile.
- Ouvrez les différents instruments de manière aseptique et positionnez-les soigneusement dans la zone chirurgicale. Activez le germoir (voir le tableau des matériaux) et les lumières pour les utiliser pendant la procédure. Placez le cautéris ophtalmologique dans le germoir et chauffez-le à 250 °C pendant 20 min.
2. Intervention chirurgicale
- Effectuez la fixation de la souris et ouvrez la cavité buccale en suivant les étapes ci-dessous.
- Sélectionnez une souris femelle C57BL/6J pesant entre 20 et 25 g et âgée de 8 à 12 semaines. Hébergez la souris pendant 7 jours avant d’effectuer toute procédure.
- Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de Zoletil50 (80 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg) (voir tableau des matériaux). Appliquez une pommade ophtalmique pour les yeux sur l’œil de la souris. Attendez qu’il n’y ait plus de réponse de pincement des orteils.
REMARQUE : La souris est prête pour la procédure lorsqu’elle ne peut pas se retourner indépendamment. - Fixez la souris à un panneau de mousse recouvert de feuilles stériles. Utilisez du ruban adhésif pour attacher la souris à la plate-forme chirurgicale en position couchée sur le dos (Figure 2A).
- Ouvrez la cavité buccale de la souris. Placez deux aiguilles (26 g x 0,63 pouce) devant le plan de l’oreille orbitale et deux autres derrière. Placez un élastique autour des aiguilles et croisez les incisives pour maintenir la bouche ouverte. Utilisez une pince à épiler microchirurgicale pour maintenir les coins de la bouche ouverts (Figure 2B).
REMARQUE : Assurez-vous que le palais dur est clairement exposé. Fixez la languette sous l’élastique pour éviter d’obstruer le champ de vision et de brûler lors des expériences ultérieures.
- Créer la fistule oronasale (ONF) sur le palais dur (Figure 3A-F).
- Récupérez le cautérier ophtalmologique, qui a été chauffé à 250 °C pendant 20 min. Placez l’extrémité de la cautérisation à 1 mm de l’intersection de la ligne médiane du palais et de la ligne de la première prémolaire, créant une lésion de la muqueuse sur toute l’épaisseur du palais dur sur la ligne médiane.
REMARQUE : Évitez d’ébouillanter la langue de la souris. - Après quelques secondes, retirez le cautéris ophtalmologique lorsque la muqueuse autour de l’extrémité du cautérisation devient blanche.
- Placez le cautéris ophtalmologique dans le germoir et continuez à le chauffer à 250 °C pendant 10 min. Répétez l’étape précédente pour agrandir la plaie sur les bords jusqu’à ce qu’elle atteigne une longueur de 2,0 mm et une largeur de 1,5 mm.
REMARQUE : Chaque extension doit suivre le bord de la dernière blessure. Utilisez un pied à coulisse pour mesurer la longueur et la largeur de la blessure. La blessure doit couvrir 10% du palais. - Utilisez des ciseaux microchirurgicaux pour enlever tout excès de tissu mou dénaturé autour de la plaie. Utilisez un coton stérile pour arrêter le saignement et éviter l’asphyxie par inhalation de la souris. Mesurez la plaie pour vous assurer qu’elle forme une lésion de la muqueuse du palais dur sur toute l’épaisseur mesurant 2,0 x 1,5 mm sur la ligne médiane.
- Récupérez le cautérier ophtalmologique, qui a été chauffé à 250 °C pendant 20 min. Placez l’extrémité de la cautérisation à 1 mm de l’intersection de la ligne médiane du palais et de la ligne de la première prémolaire, créant une lésion de la muqueuse sur toute l’épaisseur du palais dur sur la ligne médiane.
3. Soins post-opératoires
- Administrer du méloxicam à la souris au moment du réveil postopératoire, à une dose de 5 mg/kg/j pendant 3 jours, par voie sous-cutanée29.
- Placez la souris sur un dispositif de maintien de la température jusqu’à ce qu’elle reprenne complètement conscience.
REMARQUE : Assurez-vous que la souris est positionnée de manière à faciliter la respiration. Faites pivoter les souris toutes les 10 à 15 minutes pour éviter l’accumulation de sang ou l’effondrement des lobes pulmonaires. Une fois que la souris s’est réchauffée, remettez-la dans sa cage. Fournissez de la gelée stérile et de la nourriture irradiée au fond de la cage pour que les souris puissent les consommer.
4. Vérification de la création de la fistule oronasale
REMARQUE : Le succès de la création de la fistule oronasale (ONF) est évalué le 7e jour suivant l’intervention chirurgicale.
- Préparez le matériel chirurgical nécessaire : élastique, ruban adhésif, seringues, champs chirurgicaux, gants en latex, feuilles stériles, papier d’aluminium stérile et carton mousse.
- Portez des champs chirurgicaux et des gants stériles pour maintenir des conditions d’asepsie. Désinfectez le panneau de mousse, la source lumineuse et le dispositif de maintien de la température avec de l’alcool.
- Induire une anesthésie générale par injection intrapéritonéale de Zoletil50 (80 mg/kg). Attendez qu’il n’y ait plus de réponse de pincement des orteils. Utilisez la même méthode que celle décrite aux étapes 2.1.3 et 2.1.4 pour immobiliser la souris et exposer le palais dur.
- Effectuer une vérification anatomique de la structure en s’assurant que le septum est toujours visible au site de la plaie, ce qui indique que la création d’une ONF a réussi (Figure 4A,B).
- Effectuer une vérification fonctionnelle : fermer la cavité buccale de la souris et injecter de l’eau stérile dans sa cavité buccale à l’aide d’une seringue stérile. La création réussie de l’ONF est confirmée lorsque du liquide s’écoule des narines de la souris.
- Placez la souris sur le dispositif de maintien de la température (37 °C) jusqu’à ce qu’elle reprenne complètement conscience. Faites pivoter les souris toutes les 10 à 15 minutes pour éviter l’accumulation de sang ou l’effondrement des lobes pulmonaires.
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Representative Results
Pour évaluer la faisabilité et la stabilité de cette méthode expérimentale, la même procédure a été effectuée sur dix souris, et des observations ont été faites concernant la mortalité, les changements dans la taille de la plaie, le poids corporel et l’analyse histologique. Les souris ont été euthanasiées le 7e jour.
La procédure a montré un faible taux de mortalité. Le cautérier ophtalmologique et le germoir, représentés à la figure 1A-C, ont été les principaux instruments utilisés dans cette expérience. Le modèle ONF a été créé selon le protocole fourni. Sur les dix souris opérées, une seule a expiré le 7e jour après l’opération. Le taux de mortalité global tout au long de l’expérience était d’environ 10 %.
Les résultats ont révélé une variabilité notable dans la taille de l’ONF généré à l’aide de la méthode décrite. Le jour de l’opération, toutes les souris présentaient des plaies de forme ovale mesurant 2,0 mm de longueur et 1,5 mm de largeur. Lors de l’évaluation de la formation d’ONF le 7e jour après la chirurgie, une variation significative de la taille de l’ONF a été observée (P = 0,0085) (Figure 5A,B).
La présence d’ONF peut entraîner des complications telles que des reflux alimentaires et des difficultés alimentaires, pouvant entraîner des changements de poids. Par conséquent, le poids corporel des souris a également été pris en compte. Les souris ont été pesées le jour de l’opération (jour 1) et le 7ème jour (jour 7) lors de l’examen de la formation de l’ONF. Une réduction significative du poids a été observée au jour 7 par rapport au jour 1 (P < 0,001) (Figure 6A,B). La perte de poids corporel était de 25,16 %.
Pour l’analyse histologique, la plaie et le tissu normal ont été prélevés sur les souris au jour 7. Des palais isolés ont été utilisés comme échantillons pour la coupe histologique. Ils ont été placés dans des boîtes d’enrobage tissulaire et fixés à l’aide d’un réactif de décalcification à 4 % de paraformaldéhyde et à 10 % d’acide formique. Les tissus ont ensuite été incorporés dans de la paraffine, sectionnés en tranches de 7 μm le long des plans coronaux et colorés avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E). L’analyse histologique de l’ONF a révélé une perte de la muqueuse palatine dure, une dénudation osseuse et la formation d’ONF (Figure 7). Une histologie des poumons a été réalisée et aucune anomalie n’a été détectée entre les souris normales et les souris ONF.
Figure 1 : Instruments et fournitures chirurgicaux. (A) Le germoir utilisé pour chauffer le cautéris ophtalmologique. (B) Instruments chirurgicaux : cautérisation ophtalmologique, ciseaux microchirurgicaux, pinces à épiler microchirurgicales, seringues et aiguilles (26 g x 0,63 pouce). (C) Fournitures chirurgicales : champs chirurgicaux, gants stériles, coton stérile, feuilles stériles, feuilles métalliques stériles, carton mousse, élastiques et rubans. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Fixation de la souris et ouverture de la cavité buccale. (A) Les membres antérieurs de la souris ont été fixés avec du ruban adhésif pour la fixer. (B) Des aiguilles de seringue ont été insérées dans le panneau de mousse et un élastique a été placé sur les aiguilles. La cavité buccale de la souris a été ouverte à l’aide d’un élastique et d’une pince à épiler microchirurgicale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Création de la fistule oronasale. (A) Exposition de la cavité buccale. (B) Placer l’extrémité du cautérisme ophtalmologique sur la partie médiane du palais dur. (C) Retrait de la cautérisation ophtalmologique. (D) Enlever l’excès de tissus mous autour de la plaie à l’aide de ciseaux microchirurgicaux. (E) Arrêter le saignement à l’aide d’un coton stérile. (F) Plaie palatine formée définitivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Examen de la plaie palatine le 7ème jour après l’intervention. (A) Plaie palatine le jour 1. (B) Plaie palatine au 7e jour. Les flèches blanches indiquent la fistule oronasale (ONF). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Taille de la plaie palatine au jour 1 et au jour 7. (A) Valeurs moyennes pour les souris aux jours 1 et 7. (B) Différence significative vérifiée à l’aide d’échantillons appariés test t. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Poids des souris au jour 1 et au jour 7. (A) Valeurs moyennes pour les souris au jour 1 et au jour 7. (B) Différence significative vérifiée à l’aide d’échantillons appariés test t. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Observation histologique. L’analyse histologique de l’ONF montre une perte de la muqueuse palatine dure, une dénudation osseuse et la formation d’ONF. (A) Fistule oronasale au jour 7, grossissement : 4x. (B) Fistule oronasale au jour 7, grossissement : 10x. (C) Contrôle sans blessure, grossissement : 4x. (D) Contrôle sans blessure, grossissement : 10x. La flèche noire indique l’emplacement de l’ONF. Barres d’échelle : A,C = 200 μm ; B,D = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les chercheurs ont exploré divers matériaux, médicaments et nouvelles techniques pour traiter l’ONF 10,11,12,13,14,15,16,17. Grâce aux progrès des procédures chirurgicales, l’incidence et la récurrence de l’ONF ont été réduites. Cependant, en raison des caractéristiques uniques de la maladie, le nombre de patients atteints d’ONF dans la clinique est limité, ce qui nécessite un modèle standardisé pour étudier les traitements potentiels. Bien que plusieurs méthodes de création de modèles ONF aient été décrites 18,19,20,21,22,23, elles étaient souvent brèves et manquaient d’une discussion détaillée de la méthode expérimentale. La formation de l’ONF a été vérifiée par des études microscopiques et histologiques qui décrivent les caractéristiques histopathologiques12,13,27. Ce protocole visait à établir un modèle murin reproductible d’ONF pour faciliter la recherche.
La création d’un ONF uniforme a posé un défi. Pour assurer la reproductibilité, il était crucial d’endommager uniformément le palais des souris. Le contrôle du diamètre de l’ONF, la minimisation de la cicatrisation des plaies et l’arrêt efficace des saignements ont été des étapes clés dans la création de l’ONF. Des ciseaux microchirurgicaux ont été utilisés pour enlever l’excès de tissus mous autour de la plaie après l’utilisation de la cautérisation ophtalmologique, minimisant ainsi les changements de diamètre de la plaie pendant la phase de cicatrisation. Cependant, l’utilisation de ciseaux microchirurgicaux pour enlever l’excès de tissu comportait un risque de saignement important et même de mort des souris, contribuant à des taux de mortalité plus élevés observés dans d’autres expériences12,13,27. Dans ce protocole, la combinaison de ciseaux microchirurgicaux et d’un cautéris ophtalmique hémostatique a été utilisée pour dénaturer et éliminer l’excès de tissu, tandis que du coton stérile a été utilisé pour contrôler les saignements. Cette méthode a permis de réduire considérablement les saignements ou même d’obtenir une hémostase complète en raison de l’effet cautérisant de la cautérisation ophtalmique chauffée.
Une méthode alternative pour créer le modèle ONF chez la souris a été rapportée, impliquant l’utilisation d’un poinçon de biopsie13,27. Bien que cette méthode ait permis un meilleur contrôle du diamètre de la plaie en raison de la taille constante du poinçon, elle présentait un taux d’échec élevé et posait des problèmes de gestion de la force requise, ce qui pouvait entraîner la mort des souris. Il était difficile de contrôler la profondeur et la force de la création d’ONF avec cette méthode, et il était difficile de déterminer si la cloison nasale avait été atteinte. De plus, le contrôle des saignements était problématique et les souris risquaient d’être étouffées en raison d’un saignement sévère pendant l’expérience.
Cependant, il y a des limites à cette méthode expérimentale. Tout d’abord, la taille de la plaie ne peut pas être contrôlée par la même taille de fistule chez chaque souris par rapport à un poinçon de biopsie de taille à diamètre fixe. Et des outils de mesure doivent être utilisés pour maximiser la taille de chaque fistule. La taille de la plaie palatine est essentielle à l’expérience, car la cicatrisation retardée de la plaie est essentielle à la formation de l’ONF. Par conséquent, il est important de déterminer une taille appropriée pour la plaie palatine. Si la plaie est trop petite, elle peut guérir rapidement, ne répondant pas aux exigences de temps pour les expériences ultérieures. À l’inverse, s’il est trop gros, les souris peuvent mourir d’une perte de sang excessive pendant la chirurgie ou éprouver des difficultés à manger après la chirurgie, entraînant la famine. Par conséquent, l’exploration de la taille optimale de la plaie palatine est justifiée. Néanmoins, la taille (2,0 mm x 1,5 mm) utilisée dans la présente expérience a été jugée appropriée. Dans ce protocole, nous n’utilisons que des souris femelles, mais des souris femelles ou mâles peuvent être choisies en fonction du plan d’étude.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le programme de recherche et développement de l’hôpital de stomatologie de Chine occidentale de l’Université du Sichuan (RD-02-202107), le programme de soutien scientifique et technologique de la province du Sichuan (2022NSFSC0743) et la subvention de la Fondation des sciences postdoctorales du Sichuan (TB2022005) à H. Huang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Germinator | Electron Microscopy Sciences | 66118-20 | Heating and disinfection equipment |
| Latex gloves | Allmed | or similar | |
| Lights | Olympus | A1813 | |
| Meloxicam | MedChemExpress | HY-B0261 | crushed; 5 mg/kg |
| Microsurgical instruments (scissors and tweezers) | Jiangsu Tonghui Medical Devices Co. | M-Y-0087 | Surgical instrument |
| Ophthalmologic cautery | Suqian Wenchong Medical Equipment Co. | 1.00234E+13 | Surgical instrument |
| Sterile cotton, | Yancheng Begu Technology Co. | or similar | |
| Sterile metal foil | Biosharp | or similar | |
| Sterile sheets | 3M | XH003801129 | or similar |
| Surgical drapes | Yancheng Begu Technology Co. | or similar | |
| Syringes | Yancheng Begu Technology Co. | S-015301 | or similar |
| Tape | Bkmamlab | or similar | |
| Temperature maintenance device | Harvard Apparatus | LE-13-2104 | |
| Zoletil50 | Virbac | 80 mg/kg |
References
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