Summary
Denne undersøgelse introducerer en automatiseret metode til at generere patientafledt glioblastom 3-dimensionelle organoider ved hjælp af en vævshelikopter. Metoden giver en passende og effektiv tilgang til opnåelse af sådanne organoider til terapeutisk testning.
Abstract
Glioblastom, IDH-vild type, CNS WHO grad 4 (GBM) er en primær hjernetumor forbundet med dårlig patientoverlevelse på trods af aggressiv behandling. Udvikling af realistiske ex vivo-modeller er fortsat en udfordring. Patientafledte 3-dimensionelle organoidmodeller (PDO) tilbyder innovative platforme, der fanger den fænotypiske og molekylære heterogenitet af GBM, samtidig med at nøgleegenskaberne ved de oprindelige tumorer bevares. Manuel dissektion til generering af BOB er imidlertid tidskrævende, dyr og kan resultere i en række uregelmæssige og ujævne størrelser BOB'er. Denne undersøgelse præsenterer en innovativ metode til BOB-produktion ved hjælp af en automatiseret vævshakker. Tumorprøver fra fire GBM og et astrocytom, IDH-mutant, CNS WHO grad 2 patienter blev behandlet manuelt såvel som ved hjælp af vævshelikopteren. I den manuelle tilgang blev tumormaterialet dissekeret ved hjælp af skalpeller under mikroskopisk kontrol, mens vævshakkeren blev anvendt i tre forskellige vinkler. Efter dyrkning på en orbitalryster ved 37 °C blev morfologiske ændringer evalueret ved hjælp af lysfeltmikroskopi, mens proliferation (Ki67) og apoptose (CC3) blev vurderet ved immunofluorescens efter 6 uger. Vævshakkermetoden reducerede næsten 70% af fremstillingstiden og resulterede i et signifikant højere BOB-gennemsnitsantal sammenlignet med det manuelt behandlede væv fra den anden uge og fremefter (uge 2: 801 vs. 601, P = 0,018; uge 3: 1105 vs. 771, P = 0,032; og uge 4:1195 vs. 784, P < 0,01). Kvalitetsvurdering afslørede lignende satser for tumor-celle apoptose og proliferation for begge fremstillingsmetoder. Derfor giver den automatiserede vævshakkermetode en mere effektiv tilgang med hensyn til tid og BOB-udbytte. Denne metode lover godt for lægemiddel- eller immunterapi-screening af GBM-patienter.
Introduction
Lavkvalitets gliomer (LGG'er) er en gruppe af relativt sjældne hjernetumorer, der typisk præsenterer sig som langsomt voksende og mindre aggressive sammenlignet med højkvalitets gliomer som glioblastom. De kan forekomme hos både voksne og børn, med en lidt højere forekomst hos voksne. Den nøjagtige forekomst varierer efter region og befolkning, men LGG'er tegner sig for ca. 15% -20% af alle primære hjernetumorer1. Behandlingsstrategier for LGG'er involverer ofte en kombination af kirurgi, strålebehandling og kemoterapi, der sigter mod at maksimere tumorresektion og samtidig bevare neurologisk funktion. Håndteringen af LGG'er kan være kompleks, og valget af terapi kan afhænge af faktorer som tumorplacering og molekylære egenskaber2. Fremskridt i forståelsen af LGG's genetiske og molekylære grundlag har ført til mere målrettede terapier, og igangværende forskning fortsætter med at forfine behandlingsmetoder.
Glioblastom, IDH-vild type, CNS WHO grad 4 (GBM) er derimod den mest udbredte primære hjernetumor, der findes hos voksne, med en forekomst mellem 3,19-4,17 tilfælde pr. 100.000 personår3. GBM forårsager symptomer som hovedpine, anfald, fokale neurologiske underskud, ændringer i personlighed og øget intrakranielt tryk. Standardbehandlingen for GBM involverer debulking af tumoren, hvis det er muligt, efterfulgt af strålebehandling kombineret med Temozolomid4. Desuden kan kombination af Temozolomid og Lomustin øge den mediane samlede overlevelsesrate hos patientermed O6-methylguanin-methyltransferase (MGMT)-promotormethylering5. På trods af disse nylige terapeutiske tilgange forbliver GBM imidlertid en uhelbredelig sygdom med dårlig prognose, kendetegnet ved en patients mediane samlede overlevelsesrate på 16 måneder op til 20,9 måneder, når tumorbehandlingsfelter (TTFields) tilføjes 3,6. Flere immunterapeutiske tilgange er blevet undersøgt i GBM, men viste begrænset effekt in vivo. Desuden hindrer kliniske og prækliniske begrænsninger terapeutiske gennembrud7. Etableringen af en passende og realistisk ex vivo-model har været udfordrende på grund af GBM's inter-8 og intratumorale9 heterogenitet.
Konventionelle 2-dimensionelle (2D) patientcellelinjer repræsenterer homogene cellepopulationer og er velegnede til lægemiddelscreening med høj kapacitet. Imidlertid undlader patientafledte og udødeliggjorte cellelinjer at efterligne GBM tilstrækkeligt på grund af forskelle i vækstbetingelser og afvigelser i genotypiske og fænotypiske træk efter flere passager 10,11,12.
På den anden side er 3D-organoidmodeller for nylig opstået som lovende systemer, der replikerer fænotypisk og molekylær heterogenitet af organ og forskellige kræfttyper 13,14,15,16,17,18. I forbindelse med GBM er cerebrale organoider blevet genetisk modificeret til at simulere tumorlignende egenskaber16,17 eller co-dyrket med GSC'er eller sfæroider for at inducere tumorcelleinfiltration18,19. Mens patientafledte GBM-organoider dyrket med Matrigel og EGF / bFGF udviser GBM-kendetegn såsom stamcelleheterogenitet og hypoxi20, er det fortsat usikkert, i hvilket omfang denne model kan repræsentere de vigtigste molekylære egenskaber hos patienters neoplasmer.
Patientafledte GBM-organoider (PDO'er) er lovende modeller, der kan opretholde de fremherskende træk ved deres analoge forældretumorer, herunder histologiske egenskaber, cellulær mangfoldighed, genekspression og mutationsprofiler. Derudover infiltreres de hurtigt ved implantation i voksne gnaverhjerner, hvilket giver en realistisk model for lægemiddeltest og personlig terapi21. Imidlertid er manuel dissekering af tumorvæv for at generere PDO'er tidskrævende og dyrt. Derfor er der et presserende behov for en hurtig metode, der kan producere et stort antal BDO'er, hvilket muliggør omfattende vurdering af forskellige terapeutiske tilgange, der giver løfte om individualiseret lægemiddeltestning. Denne undersøgelse beskriver en ny metode til fremstilling af BDO'er direkte fra frisk dissekeret tumorvæv ved hjælp af en automatisk vævshakker. Desuden blev BOB'er genereret ved denne metode sammenlignet med manuelt dissekerede BOB'er fra de samme patienter med hensyn til BOB-tal, morfologiske egenskaber, apoptose og proliferation af tumorceller.
Protocol
Alle patienter blev behandlet på neurokirurgisk afdeling, universitetshospitalet Würzburg, Tyskland, efter at have givet skriftligt informeret samtykke i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen og som godkendt af Institutional Review Board ved universitetet i Würzburg (#22/20-me). Tumorvævsmateriale fra fire GBM-patienter og et astrocytom, IDH-mutant, CNS WHO grad 2-patienter (lavgradig gliom, LGG) (tabel 1) blev opnået ved operation og behandlet ved hjælp af følgende protokol. Den automatiserede proces med generering af BDO'er ved hjælp af en vævshakker kaldes chopper (C) og processen med manuelt at skære vævet med to skalpeller under mikroskopisk kontrol som manuel (M). Seks lige store sektioner (1-2 cm3) blev dissekeret fra tumorprøven, derefter blev hver enkelt skåret i halve og behandlet homogent ved hjælp af de to metoder. På grund af den førnævnte intratumorale heterogenitet blev der genereret en 6-brøndplade for hver tilgang fra hver patient, hvor hver brønd repræsenterede BDO'er fra et andet sted inden for den oprindelige tumor. Begge procedurer fandt sted under et laminært luftstrømsskab, og alle brugte instrumenter blev steriliseret før brug. Oversigten over tilgangen er illustreret i figur 1.
1. Klargøring af agaroseblokke (kun til C-metoden, valgfrit)
- Fyld 50 ml fosfatbufret saltvand (PBS) i et bægerglas, tilsæt en tablet agarose (se materialetabel), og bland godt, indtil den er suspenderet.
- Opvarm blandingen i mikrobølgeovnen i 30-40 s, samtidig med at kogning undgås. Derefter afkøles blandingen, indtil den når 47 °C.
- Hæld agaroseblandingen i en forseglet cylinderformet støbeform, og undgå bobledannelse. Afstøbningen afkøles straks ved hjælp af en frossen klemme (-20 °C) eller ved at lægge den på tøris i 30 minutter.
2. Behandling af tumormaterialet
- Forbered en kasse is for at holde tumormaterialet afkølet på vej fra operationsstuen til laboratoriet.
- Overfør tumorvævet (4-5 cm³) til et sterilt 50 ml rør indeholdende 25 ml dvale A (se materialetabel), der dækker tumoren, og læg røret i isboksen.
- Under et laminært luftstrømsskab overføres tumormaterialet sammen med Hibernate A til en steriliseret glas petriskål.
- Fjern det nekrotiske væv og disseker blodkarrene omhyggeligt ved hjælp af en skalpel og vævspilet under mikroskopisk kontrol. Identificer nekrotisk væv ved hæmoragiske områder, der udviser en brunlig nuance som følge af blødning, eller væv, der udviser et lysere eller hvidere udseende i forhold til det tilstødende levedygtige væv. Vær opmærksom på ikke at klemme eller forstyrre vævet.
- Skær tumormaterialet i seks stykker med en omtrentlig størrelse på 1-2 cm3. Stykkerne fordeles på petriskåle af plast (n = 6), der er fyldt på forhånd med 3 ml H-GPSA-substrat (tabel 2), hver 22. Læg petriskålene på is.
3. Opsætning af vævshakkeren
- Klingen placeres som beskrevet i producentens instruktionsbog23.
- Juster skivetykkelsen til 0,45-0,50 mm. Indstil knivkraften til medium. Fastgør bordudløserknappen til "start" -tilstand.
4. Behandling af tumorvævsstykkerne
- Behandling af tumorvæv med helikopteren (C-metoden)
- Skær agaroseblokkene i cylindre på 2 cm længde og lim en af disse cylindre på chopperens cirkulære plastskål ved hjælp af histoacryllim (se materialetabel).
- Opret en uddybning i agarosecylinderen ved hjælp af en skalpel, og tilpas derefter tumorvævet fra den første brønd (trin 2.5) i denne pit.
BEMÆRK: Tumormaterialet skal håndteres forsigtigt og ikke presses eller skubbes ind i mellemrummet. Spalten skal være stor nok til let at passe til tumoren, men lille nok til at holde tumormaterialet stabilt under skæreprocessen. Trin 4.1.1. og 4.1.2. er valgfrie. - Placer plastskiven på skærebordets monteringsskive (se Materialetabel).
- Tænd for hakkeren, og tryk på nulstillingsknappen. Chopperen begynder nu at skære (første runde). Maskinen stopper automatisk, når bordet når enden, og både agarose og tumorvæv skæres i den ønskede diameter.
- Drej monteringsskiven 90°, og juster derefter udløserbordknappen til starttilstand.
- Tryk på nulstillingsknappen , og lad maskinen skære vævet igen og skabe rektangulært formet væv (anden runde).
- Fjern plastskiven med det forarbejdede materiale, og drej forsigtigt kun tumorvævet 90 ° ved hjælp af vævspatel.
- Placer plastskiven på skærebordet, juster derefter udløserbordsknappen til starttilstand, og tryk på nulstillingsknappen for en sidste skærerunde (tredje runde).
- Sluk for hakkeren, og fjern plastikskiven. Rengør hakkeren og knivene.
- Brug en 5 ml enkeltkanalpipette til at aspirere det forarbejdede materiale sammen med mediet ind i pipetten og skylle suspensionen tilbage i skålen.
- Gentag det forrige trin 2-3 gange for at adskille vævet korrekt.
- Placer petriskålen tilbage på is og gentag trin (4.1.1-4.1.12.) med de andre 5 retter i hver tumor.
- Behandling af tumorvæv manuelt (M-metode)
- Overfør tumorvævet fra den første petriskål af plast (trin 2.5) sammen med 3 ml H-GPSA-medium (tabel 2) til en petriskål af glas. Disseker segmentet manuelt under mikroskopet i sektioner på 0,5 mm ved hjælp af to skalpeller.
- Overfør det dissekerede væv tilbage til dets plastik petriskål ved hjælp af en 2 ml pipette.
- Gentag trin (4.2.1.-4.2.3.) for tumorsektionerne i de øvrige fem petriskåle (trin 2.5).
5. Vask tumorvævet
- Vip hver petriskål opad til 45 ° og vent i 30 s, indtil tumorstykkerne synker til bunden af skålen.
- Opsug 2,5 ml af H-GPSA-mediet (tabel 2) forsigtigt ved hjælp af en 1 ml pipette, og vær opmærksom på ikke at optage tumorvæv.
- Der tilsættes 2 ml RBCs lysisbuffer (se materialetabellen) til hver prøve. De forarbejdede tumorstykker skal dækkes fuldstændigt af lysisbuffer.
- Placer de 6 skåle på en laboratorieorbital rystemaskine ved langsom hastighed i 10 min.
- Opsug 2 ml af lysisbufferen omhyggeligt for ikke at optage noget tumorvæv.
- Gentag de foregående vasketrin (trin 5.1-5.5) to gange med 2 ml H-GPSA-medium (tabel 2) i stedet for lysisbuffer hver gang.
6. Dyrkning af tumorvævet
- H-GPSA-substratet (tabel 2) suges ud af hver skål, og det erstattes med 4 ml BOB-medium (tabel 2).
- Overfør vævsstykkerne i hver skål til en respektive brønd i en 6-brøndplade med ultralav fastgørelse (se materialetabel).
- Pladen anbringes på en orbitalryster inde i en inkubator og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 og 150 o / min i 2-4 uger.
- Der foretages et halvt mediumskift hver anden dag ved at opsuge 2 ml substrat fra hvert hul og erstatte det med 2 ml frisk BOB-substrat (tabel 2), der er forvarmet til 37 °C.
- Overhold vævet under mikroskopet (morfologi, vækst, mellemfarve) og skær voksende BDO'er (>0,7 mm) eller klæbende væv for at forhindre vævshypoxi.
- For at gøre det skal du overføre BDO'erne fra den ultralave fastgørelsesbrønd til en steriliseret petriskål af glas og bruge en skalpel til skæring. Alternativt kan klæbende BDO'er opløses ved at opsuge dem med en 1 ml pipette. Pas på ikke at klemme PDO'erne og håndtere dem forsigtigt.
- Evaluer BOB-dannelsen ved at tælle BOB'en hver anden dag, og kontroller grundigt for den ønskede runde morfologi (figur 2).
7. Fastgørelse og indlejring af BOB'erne
- Fastgør to BDO'er fra hver brønd hos hver patient med 4% formalin i 24 timer efter 6 ugers dyrkning.
- De faste BOB'er nedsænkes i neutralt bufret (natriumphosphat) formalin, indtil de er indlejret.
- Hver BOB anbringes i en kassette (se materialetabellen) til videre forarbejdning.
- Start en dehydreringsproces ved at nedsænke kassetten i følgende opløsninger som nævnt i nedenstående note:
BEMÆRK: 50% ethanol i 20 min, 70% ethanol i 20 min, 80% ethanol i 20 min, 96% ethanol i 20 min, 100% ethanol i 20 min, 100% ethanol i 30 min, 100% ethanol + chloroform (1:1 forhold) i 30 min, 100% ethanol + chloroform (1:1 forhold) i 30 minutter, absolut chloroform i 30 min, absolut chloroform i 30 min, Paraffin i 30 min, Paraffin i 30 min ved hjælp af STP 120. - De dehydrerede BOB'er anbringes i paraffinvoks ved 58-60 °C.
- Skær de indlejrede BDO'er i en tykkelse på 2,5 μm, og monter dem på dias til farvning.
8. Immunofluorescensfarvning
- Monter BDO'erne efter 6 ugers kultur.
- Udfør derefter dobbeltfarvning mod glialfibrillært surt protein (GFAP, fortynding: 1:100) og proliferationsmarkøren Ki67 (fortynding: 1:1000) (se materialetabel), som tidligere rapporteret22.
- På samme måde skal du evaluere apoptose ved dobbeltfarvning af BDO'er mod GFAP og anti-caspase-3 (CC3, fortynding: 1:400) (se materialetabel).
- Tag billeder af BDO'erne ved hjælp af et fluorescensmikroskop ved 40x forstørrelse.
- Analysér billederne for GFAP-, Ki67- og CC3-positive celler samt GFAP/Ki67- og GFAP/CC3-dobbeltpositive celler.
- Brug open source-programmet Fiji (ImageJ-win 32) til billedanalyse.
9. Evaluering og dataanalyse
- Tag daglige mikroskopiske lyse feltbilleder i løbet af den første uge af kulturen ved standardindstillinger og 5x forstørrelse.
- Overhold de morfologiske ændringer og spor modningsprocessen i både manuelle og automatiserede behandlingsmetoder.
- Udfør morfologisk analyse ved hjælp af mikroskopet i standard brightfield-tilstandsindstillinger.
- Evaluer BOB-nummer og morfologi i løbet af de første 4 ugers dyrkning i BOB'er fra alle fem patienter.
- Få tre aflæsninger af hver BOB-tælling fra hver patient for at beregne middel- og standardfejlen for middelværdien (SEM).
- Undersøg proliferation og apoptose i BDO'er fra tre patienter.
- Analyser dataene ved hjælp af en kommercielt tilgængelig statistisk softwarepakke (se materialetabel).
- Anvend Students-T- og Mann-Whitney U-tests for at bestemme forskelle mellem manuel og automatiseret BOB-generering med hensyn til BOB-antal, spredning og apoptose.
Representative Results
Fire patienter med GBM og en med LGG blev inkluderet efter patologisk bekræftelse af en erfaren neuropatolog (CMM). Størstedelen af patienterne havde en umethyleret MGMT-promotor, og alle GBM-patienter var IDH1 og IDH2 vildtype (tabel 1). I gennemsnit varede fremstillingsprocessen 88,8 min (+/- 6,3 min) i C-metoden og 322 min (+/- 17,2 min) i M-metoden. Den samlede succesrate var 87% i manualen og 93% i chopper-tilgangen efter 4 ugers kultur (n = 5). Desuden nåede BOB'er afledt af C-gruppen den ønskede afrundede form inden for 1 uge og var modne nok til at blive anvendt i in vitro-forsøg , mens BOB'erne i M-gruppen for det meste forblev skarpkantede og udefinerede (figur 2). Tumorvævet behandlet med C-metoden resulterede i i alt 281 PDO'er (gennemsnit pr. patient = 56 +/- 43) efter den første dyrkningsuge, mens 250 PDO'er (gennemsnit pr. patient = 50 +/- 41) udviklede sig med M-metoden. I løbet af den anden dyrkningsuge gav vævet hos alle fem patienter højere BOB-tal, når de blev genereret med C-metoden (801; Gennemsnit pr. patient = 130 +/- 38) sammenlignet med M-metoden (601; Gennemsnit pr. patient= 76 +/- 44; P = 0,018). I løbet af den tredje dyrkningsuge akkumulerede C-metoden samlet 1105 BDO'er fra alle patienter (gennemsnit pr. patient = 221 +/- 32) sammenlignet med 771 BDO'er (gennemsnit pr. patient = 155 +/- 34) i M-metoden (P = 0,032). Desuden blev i alt 1195 BDO'er (gennemsnit pr. patient = 239 +/- 50) dannet efter fire ugers dyrkning, når de blev genereret med C-metoden sammenlignet med 784 (gennemsnit pr. patient = 157 +/- 36) ved hjælp af M-metoden (P < 0,01). C-metoden viste derfor et signifikant højere BOB-tal fra og med den anden uge (figur 3). Desuden blev de relative udsving i BOB-tallene evalueret for at undersøge de dynamiske tendenser mellem de på hinanden følgende uger. Analysen afslørede en imponerende stigning i antallet af BOB i den indledende overgang fra første til anden uge i C-metoden (265 %), hvilket var tegn på hurtige fremskridt. Efterfølgende var der en lavere stigning i antallet i den tredje uge (75%), hvilket afspejler en midlertidig justering. I modsætning hertil viste M-metoden en konsekvent og støt stigning i BOB-tallene (92% i anden uge, henholdsvis 67% i den tredje uge), hvilket bidrog til en bemærkelsesværdig stabilitet i tællingerne i den fjerde uge. Denne konstante opadgående tendens i antallet af BOB understreger C-metodens pålidelighed og modstandsdygtighed i hele observationsperioden.
To GBM-patienter og en LGG-patient blev inkluderet til analyse af astrocyttal (GFAP) inden for BOB'er, BOB-celleproliferation (Ki67) og apoptose (CC3). Det bestemte astrocyttal afslørede ingen signifikante forskelle mellem de to behandlingsmetoder med et gennemsnit på 43% i C-metoden og 45% i M-metoden (figur 4 og figur 5, supplerende figur 1 og supplerende figur 2). På samme måde var spredningsraterne inden for BOB'erne sammenlignelige mellem C (3%) og M-tilgangen (1%). Kun BOB'er genereret med C-metoden fra patient 5 viste en spredningshastighed på 26% sammenlignet med 1% med M-metoden (P = 0,001; Figur 4C). Samlet lave apoptoserater blev påvist hos BDO'er behandlet med C-metoden (3 %) sammenlignet med 2 % fra M-tilgangen for alle patienter, som ikke var signifikant forskellige (figur 5C). Desuden var der ingen signifikant forskel mellem de to metoder med hensyn til antallet af astrocytter, der gennemgik apoptose (figur 5D).
Figur 1: Grafisk oversigt over den patientafledte organoidfremstillingsproces (BOB) ved hjælp af en automatiseret chopper versus en manuel tilgang. Illustrationen viser de forskellige involverede trin, herunder (A) prøveindsamling, (B) tumormaterialedissektion, (C) vask og (D) inkubation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: BOB-morfologi i den første uge af kulturen. Sammenligning af BDO'ers dannelse efter dissektion ved hjælp af både den automatiserede chopper og manuel metode. Skalastænger = 1000 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Antal BOB i de første fire uger af kulturen. X-aksen viser tiden i uger (W), og y-aksen antallet af BOB'er i C (blå) og M (rød) tilgang (n = 5). Hvert datapunkt repræsenterer det gennemsnitlige antal med fejllinjer, der angiver standardfejlen for middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Celleproliferation inden for BOB'er. (A) Repræsentative immunfluorescensbilleder (n = 3) af GFAP-positive celler (grøn), Ki67-positive celler (rød) og DAPI (blå) i BOB'er fra patient 3, 4 og 5 (tabel 1). Alle BOB'er blev behandlet ved hjælp af chopperen (C) og manuel (M) metoderne. Skalastænger = 100 μm. (B) Sammenligning af de to metoder vedrørende det relative antal GFAP-positive celler, (C) Ki67-positive celler og (D) Ki67/GFAP-dobbeltpositive celler. Ikke signifikante resultater er angivet med "ns". Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Apoptoserater inden for BOB'er. (A) Repræsentative immunfluorescensbilleder (n = 3) af GFAP-positive celler (grønne), CC3-positive celler (rød) og DAPI (blå) i BOB'er fra patient 3, 4 og 5 (tabel 1). Alle BOB'er blev behandlet ved hjælp af chopperen (C) og manuel (M) metoderne. Skalasøjler = 100 μm. (B) Sammenligning af de to metoder vedrørende det relative antal GFAP-positive celler, (C) CC3-positive celler og (D) CC3/GFAP-dobbeltpositive celler. Ikke signifikante resultater er angivet med "ns". Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Patienters karakteristika og kliniske parametre. GBM = glioblastom, IDH-vild type, CNS WHO klasse 4; LGG = lav kvalitet gliom; KPS = Karnofsky performance score; MGMT = O6-methylguanin-DNA-methyltransferase; IDH1 = isocitratdehydrogenase 1, IDH2 = isocitratdehydrogenase 2, ATRX = α-thalassæmi/mental retardering, X-bundet gen; M = morfologi; CC = celletal; p = spredning A = apoptose. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Mellemstore sammensætninger. H-GPSA = Dvale A-glutamax pencillin streptomycin amphotericin B. BOB = Patientafledte organoider DMEM: Dulbeccos modificerede ørnemedium. NEAA: ikke-essentielle aminosyrer. Pen Strep: Penicillin/ Streptomycin Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Oversigt over de anvendte teknikker til generering af cellekulturmodeller. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende figur 1: Individuelle kanaler for spredningsfarvning af BOB'er. (A) DAPI (blå), (B) GFAP-positive celler (grønne), (C) Ki67-positive celler (rød) og (D) overlejringskanal i BDO'er fra patienter 3, 4 og 5. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Individuelle kanaler for apoptosefarvning af BOB'er. (A) DAPI (blå), (B) GFAP-positive celler (grønne), (C) CC3-positive celler (rød) og (D) overlejringskanal i BOB'er fra patient 3, 4 og 5. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Denne undersøgelse præsenterer en hurtig og effektiv metode til generering af BOB'er. GBM er fortsat en udfordrende tumor at behandle, ofte karakteriseret ved tilbagefald og en høj sygdomsbyrde 3,6. Der er et presserende behov for innovative terapeutiske tilgange, da lovende resultater observeret in vitro ofte ikke viser effektivitet in vivo under fase I-forsøg. En af grundene til denne uoverensstemmelse kan være den begrænsede evne hos patientafledte udødeliggjorte cellelinjer, dyrket i enkeltlagskulturer, til at afspejle de komplekse celle-celleinteraktioner og genetiske egenskaber af forældretumoren. I betragtning af den høje inter- og intratumorale heterogenitet af GBM 8,9 foretrækkes personaliserede målrettede terapier og kan være lovende for fremtidige applikationer. I modsætning til 2D-klæbende cellelinjer har organoider evnen til at bevare forældrevævets egenskaber21, men komplekse celle-celleinteraktioner mellem tumoren og den normale hjerne er af afgørende betydning og kan potentielt overses af denne model. Manuel generering af BOB'er er imidlertid en tidskrævende proces, og vævsskader forårsaget af klemning med skalpeller under skæring kan hindre vellykket BOB-vækst. Derfor blev en automatiseret metode optimeret ved hjælp af en vævshakker til at generere et højere antal BDO'er med reduceret tid og kræfter. Derudover demonstrerede vi, at de samlede sprednings- og apoptoserater ikke adskilte sig mellem de to tilgange.
C-tilgangen er ligetil, let at gennemføre og gør det muligt at generere et større antal BOB'er (figur 3). Rotationen af vævet mellem anden og tredje runde af hakning blev identificeret som et kritisk trin i protokollen. På dette stadium har vævet allerede mistet sin integritet og kan let falde fra hinanden, hvilket resulterer i større stykker, der kræver yderligere skæring eller manuel dissektion under mikroskopet. Mens den automatiserede chopper-tilgang giver mulighed for en forudindstillet skærestørrelse med større nøjagtighed, mangler den manuelle tilgang præcision til bestemmelse af BOB'ernes størrelse, hvilket fører til ujævnt formede og store BOB'er, hvilket er en ulempe for sammenlignende lægemiddelscreening (figur 2). Ikke desto mindre opnås standardiseringen af celleantal pr. BOB ikke med den foreslåede metode, hvilket potentielt udgør en ulempe for standardiserede lægemiddelscreeningsprotokoller. Fordele og ulemper ved forskellige organoidgenereringsteknikker 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42 og deres anvendelser er opsummeret i tabel 3.
GBM-væv kan variere i konsistens, lige fra hård (infiltrationszone) til blød (nekrotisk kerne), hvilket kan udgøre udfordringer for den automatiserede chopper-tilgang. Hvis vævet er for hårdt, kan helikopteren klemme og beskadige det, mens for blødt væv kan blive mast. Det valgte væv viste karakteristiske egenskaber, herunder et mellemliggende niveau af fasthed, sporadisk med en lyserød-grålig farve snarere end at manifestere brun eller gul misfarvning. Væv med en svampet og let smuldrende tekstur viste overlegen konservering inden for agaroseblokkene, mens yderst delikat og flydende tumorvæv blev udeladt fra prøveudtagningsproceduren. Chopper-tilgangen muliggjorde imidlertid en vellykket generering af et større antal BOB'er sammenlignet med den manuelle tilgang, selv med væv med suboptimal konsistens. Den vigtigste løsning er at opretholde tæt interaktion med kirurgen, der udfører tumorresektionen for at behandle væv fra forskellige områder af tumoren. I tilfælde af suboptimal vævskonsistens var manuel omarbejdning af vævet under mikroskopet en nyttig tilføjelse efter hakning. For at tage højde for heterogenitet blev tumorvævet oprindeligt opdelt i seks segmenter, hver efterfølgende halveret for enten C- eller M-tilgangen. Inden for disse seks forskellige sektioner forventes en betydelig grad af heterogenitet. Selv inden for BOB'erne fra samme afsnit eller brønd er tilstedeværelsen af særskilte delpopulationer desuden plausibel.
Som bevis på konceptet blev proliferation og apoptose data rapporteret fra to patienter med GBM og en patient med LGG, som ikke viser nogen signifikante forskelle mellem de to metoder. Genereringen af BDO'er er ikke begrænset til meget ondartede hjernetumorer, men kan også anvendes på LGG'er. Denne undersøgelse fremhæver, at LGG sjældent udviser vækst i 2D-kultur, hvilket gør udviklingen af en nøjagtig model til deres undersøgelse meget værdifuld. Denne protokol har til formål at demonstrere alsidigheden af denne tilgang til at generere BOB'er fra GBM såvel som LGG hurtigt og effektivt.
Samlet set kan BDO'er bruges i fremtiden til patientorienteret præterapeutisk test af målrettede terapier i maligne hjernetumorer. Tilvejebringelse af en hurtig og effektiv metode til individualiseret lægemiddelscreening er afgørende, da tumorprogression sker hurtigt, og bjærgningsbehandlingsmuligheder er desperat nødvendige. Som et næste skridt kunne BOB-modellen evalueres med forskellige immunterapeutiske tilgange for bedre at efterligne reelle behandlingsresponser. I fremtiden kan BDO'er bruges til at drage sofistikerede konklusioner vedrørende behovet for yderligere udforskning og evaluering af terapier i kliniske omgivelser.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Interdisciplinary Center of Clinical Research (IZKF, B-450) Würzburg, Bavarian Center of Cancer Research (BZKF) og publikationen støttet af Open Access Publishing Fund ved universitetet i Würzburg. Vi vil gerne takke Dagmar Hemmerich og Siglinde Kühnel, begge Sektion Eksperimentel Neurokirurgi, Neurokirurgisk Afdeling, Universitetshospitalet Würzburg, for teknisk support. Figur 1 blev oprettet ved hjælp af www.biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
| 30% formaldehyde methanol-free | Carl Roth | 4235.1 | Used in 4% concentration |
| 70% ethanol solution | For sterilisation | ||
| Agarose tablets 0.5 g | Carl Roth | HP67.7 | |
| Amphotericin B 250 µg/mL | Gibco | 15290018 | |
| Anatomical forceps | Hartstein | N/A | |
| Anatomical spatula | Hartstein | N/A | |
| B-27 Supplement without vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | |
| Biopsy cassette with cover | Resolab | 37001-b | |
| Blades for McIlwain Tissue Chopper | Campden instruments | Model TC752-1 | |
| CC3 antibody (Asp 175) | Cells signaling technology | 9661 | |
| Disposable scalpel | Feather | 0200130015 | |
| Distilled water | Gibco | 15230089 | To dilute the formaldehyd |
| Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) | Gibco | 11330032 | Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Sciences | D8537-500ML | Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 433357 | |
| Falcon tube 50 ml Cellstar | Greiner Bio-One | 227261 | |
| GFAP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc33673 | |
| Glass beaker | N/A | N/A | |
| Glass petri dish | N/A | N/A | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050061 | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo scientific | 51032875 | |
| Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet | Thermo scientific | 5016643 | |
| Hibernate-A | Gibco | A1247501 | |
| Histoacryl glue | B. Braun surgical | 1050052 | |
| Human Insulin, Solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-360248 | |
| Ice box | N/A | N/A | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Cavey Laboratory Engineering | 51350V | |
| Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B | Leica | DMI6000B | For brightfield and immunofluorescence pictures |
| Microscope stereozoom S9D | Leica | W841832 | For manual cutting and to organoids monitoring |
| Microwave | Bosch | N/A | To heat the agarose solution |
| Mounting plastic discs | Cavey Laboratory Engineering | 51354 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) | Gibco | 11140050 | |
| Neurobasal (1x) | Gibco | 21103049 | |
| Orbital shaking machine Rotamax120 | Heidolph | 10304491 | |
| Penicilin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic petri dishes Cellstar | greiner bio-one | 628160 | n = 12 |
| Single channel pipette 1000 µm | Eppendorf | 4924000010 | |
| Single channel pipette 5000 µm | Eppendorf | EP3123000276 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 | IBM | ||
| Surgipath Paraplast | Leica | 39601006 | Embedding medium |
| Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate | Thermo Scientific | 174932 |
References
- Gatto, L., et al. IDH inhibitors and beyond: the cornerstone targeted glioma treatment. Mol Diagn Ther. 25 (4), 457-473 (2021).
- Buckner, J. C., et al. Radiation plus Procarbazine, CCNU, and Vincristine in low-grade glioma. N Engl J Med. 374 (14), 1344-1355 (2016).
- Grochans, S., et al.
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma). N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Herrlinger, U., et al. Lomustine-temozolomide combination therapy versus standard temozolomide therapy in patients with newly diagnosed glioblastoma with methylated MGMT promoter (CeTeG/NOA-09): a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 393 (10172), 678-688 (2019).
- Stupp, R., et al. Effect of tumor-treating fields plus maintenance temozolomide vs maintenance temozolomide alone on survival in patients with glioblastoma: a randomized clinical trial. Jama. 318 (23), 2306-2316 (2017).
- Desbaillets, N., Hottinger, A. F. Immunotherapy in glioblastoma: a clinical perspective. Cancers (Basel). 13 (15), 3721 (2021).
- Gularyan, S. K., et al. Investigation of inter- and intratumoral heterogeneity of glioblastoma using TOF-SIMS). Mol Cell Proteomics. 19 (6), 960-970 (2020).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N.
- Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
- Timerman, D., Yeung, C. M. Identity confusion of glioma cell lines. Gene. 536 (1), 221-222 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
- Ogawa, J., Pao, G. M., Shokhirev, M. N., Verma, I. M. Glioblastoma model using human cerebral organoids. Cell Rep. 23 (4), 1220-1229 (2018).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Rep. 26 (12), 3203-3211 (2019).
- da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discov. 23 (8), 862-868 (2018).
- Hubert, C. G., et al. A three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Res. 76 (8), 2465-2477 (2016).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Nickl, V., et al. Glioblastoma-derived three-dimensional ex vivo models to evaluate effects and efficacy of tumor treating fields (TTFields). Cancers (Basel). 14 (21), 5177 (2022).
- Tissue Chopper. Lafayette Instrument. , Available from: http://lafayetteinstrument.com (2023).
- Klein, E., Hau, A. C., Oudin, A., Golebiewska, A., Niclou, S. P. Glioblastoma organoids: pre-clinical applications and challenges in the context of immunotherapy. Front Oncol. 10, 604121 (2020).
- Golebiewska, A., et al. Patient-derived organoids and orthotopic xenografts of primary and recurrent gliomas represent relevant patient avatars for precision oncology. Acta Neuropathol. 140 (6), 919-949 (2020).
- Bougnaud, S., et al. Molecular crosstalk between tumour and brain parenchyma instructs histopathological features in glioblastoma. Oncotarget. 7 (22), 31955-31971 (2016).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nat Cell Biol. 16 (10), 951-954 (2014).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. J Neurosci Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
- Kato, H., Ogawa, T. A technique for preparing in vitro slices of cat's visual cortex for electrophysiological experiments. J Neurosci Methods. 4 (1), 33-38 (1981).
- Teyler, T. J.
- Schulz, E., et al. Preparation and culture of organotypic hippocampal slices for the analysis of brain metastasis and primary brain tumor growth. Methods Mol Biol. 2294, 59-77 (2021).
- Driehuis, E., Gracanin, A., Vries, R. G. J., Clevers, H., Boj, S. F. Establishment of pancreatic organoids from normal tissue and tumors. STAR Protoc. 1 (3), 100192 (2020).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Neal, J. T., et al. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Li, X., et al. Oncogenic transformation of diverse gastrointestinal tissues in primary organoid culture. Nat Med. 20 (7), 769-777 (2014).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
- Zhao, Z., et al.
- Toh, Y. C., et al. A novel 3D mammalian cell perfusion-culture system in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (3), 302-309 (2007).
- Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., van Noort, D., Yu, H. Towards a human-on-chip: culturing multiple cell types on a chip with compartmentalized microenvironments. Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kengla, C., Atala, A., Sang Jin, L.
