Summary
Denna studie introducerar en automatiserad metod för att generera patienthärledda glioblastom 3-dimensionella organoider med hjälp av en vävnadschopper. Metoden ger ett lämpligt och effektivt tillvägagångssätt för att erhålla sådana organoider för terapeutisk testning.
Abstract
Glioblastom, IDH-vildtyp, CNS WHO grad 4 (GBM) är en primär hjärntumör som är förknippad med dålig patientöverlevnad trots aggressiv behandling. Att utveckla realistiska ex vivo-modeller är fortfarande en utmaning. Patienthärledda 3-dimensionella organoidmodeller (PDO) erbjuder innovativa plattformar som fångar den fenotypiska och molekylära heterogeniteten hos GBM, samtidigt som viktiga egenskaper hos de ursprungliga tumörerna bevaras. Manuell dissektion för generering av skyddade ursprungsbeteckningar är dock tidskrävande, dyr och kan resultera i ett antal oregelbundna och ojämnt stora skyddade ursprungsbeteckningar. Denna studie presenterar en innovativ metod för PDO-produktion med hjälp av en automatiserad vävnadshackare. Tumörprover från fyra GBM- och en astrocytom-, IDH-mutant, CNS WHO grad 2-patienter behandlades manuellt samt med hjälp av vävnadshelikoptern. I det manuella tillvägagångssättet dissekerades tumörmaterialet med skalpeller under mikroskopisk kontroll, medan vävnadshackaren användes i tre olika vinklar. Efter odling på orbital shaker vid 37 °C utvärderades morfologiska förändringar med hjälp av ljusfältsmikroskopi, medan proliferation (Ki67) och apoptos (CC3) bedömdes med immunofluorescens efter 6 veckor. Vävnadschoppermetoden minskade nästan 70 % av tillverkningstiden och resulterade i ett signifikant högre medelvärde för PDO:er jämfört med den manuellt behandlade vävnaden från den andra veckan och framåt (vecka 2: 801 jämfört med 601, P = 0,018; vecka 3: 1105 jämfört med 771, P = 0,032; och vecka 4:1195 jämfört med 784, P < 0,01). Kvalitetsbedömning visade liknande nivåer av tumörcellsapoptos och proliferation för båda tillverkningsmetoderna. Därför erbjuder den automatiserade vävnadschoppermetoden ett mer effektivt tillvägagångssätt när det gäller tid och PDO-utbyte. Denna metod är lovande för läkemedels- eller immunterapiscreening av GBM-patienter.
Introduction
Låggradiga gliom (LGG) är en grupp relativt sällsynta hjärntumörer som vanligtvis uppträder som långsamt växande och mindre aggressiva jämfört med höggradiga gliom som glioblastom. De kan förekomma hos både vuxna och barn, med en något högre prevalens hos vuxna. Den exakta prevalensen varierar beroende på region och befolkning, men LGG står för cirka 15–20 % av alla primära hjärntumörer1. Behandlingsstrategier för LGG involverar ofta en kombination av kirurgi, strålbehandling och kemoterapi, som syftar till att maximera tumörresektion samtidigt som neurologisk funktion bevaras. Behandlingen av LGG kan vara komplex, och valet av behandling kan bero på faktorer som tumörens placering och molekylära egenskaper2. Framsteg i förståelsen av de genetiska och molekylära grunderna för LGG har lett till mer riktade terapier, och pågående forskning fortsätter att förfina behandlingsmetoderna.
Glioblastom, IDH-vildtyp, CNS WHO grad 4 (GBM), å andra sidan, är den vanligaste primära hjärntumören som finns hos vuxna, med en incidens mellan 3,19-4,17 fall per 100 000 personår3. GBM orsakar symtom som huvudvärk, kramper, fokala neurologiska brister, personlighetsförändringar och ökat intrakraniellt tryck. Standardbehandlingen för GBM innebär debulking av tumören, om möjligt, följt av strålbehandling i kombination med Temozolomide4. Dessutom kan en kombination av Temozolomid och Lomustin öka medianöverlevnaden hos patienter med O-6-metylguanin-metyltransferas (MGMT)-promotormetylering 5. Men trots dessa nya terapeutiska tillvägagångssätt är GBM fortfarande en obotlig sjukdom med dålig prognos, som kännetecknas av en medianöverlevnad på 16 månader upp till 20,9 månader när Tumor Treating Fields (TTFields) läggs till 3,6. Flera immunterapeutiska metoder har undersökts vid GBM men visat begränsad effekt in vivo. Dessutom hindrar kliniska och prekliniska begränsningar terapeutiska genombrott7. Etableringen av en lämplig och realistisk ex vivo-modell har varit utmanande på grund av GBM:s inter-8 och intratumorala 9-heterogenitet.
Konventionella 2-dimensionella (2D) patientcellinjer representerar homogena cellpopulationer och är lämpliga för läkemedelsscreening med hög genomströmning. Patienthärledda och immortaliserade cellinjer kan dock inte efterlikna GBM på ett adekvat sätt på grund av skillnader i tillväxtbetingelser och avvikelser i genotypiska och fenotypiska egenskaper efter flera passager 10,11,12.
Å andra sidan har 3D-organoidmodeller nyligen dykt upp som lovande system som replikerar den fenotypiska och molekylära heterogeniteten hos organ och olika cancertyper 13,14,15,16,17,18. I samband med GBM har cerebrala organoider modifierats genetiskt för att simulera tumörliknande egenskaper16,17 eller samodlats med GSC eller sfäroider för att inducera tumörcellsinfiltration18,19. Även om GBM-organoider från patienter odlade med Matrigel och EGF/bFGF uppvisar GBM-kännetecken som stamcellsheterogenitet och hypoxi20, är det fortfarande osäkert i vilken utsträckning denna modell kan representera de viktigaste molekylära egenskaperna hos patienternas neoplasmer.
Patient-deriverade GBM-organoider (PDO) är lovande modeller som kan bibehålla de dominerande egenskaperna hos sina analoga modertumörer, inklusive histologiska egenskaper, cellulär mångfald, genuttryck och mutationsprofiler. Dessutom infiltreras de snabbt vid implantation i vuxna gnagarhjärnor, vilket ger en realistisk modell för drogtestning och personlig terapi21. Att manuellt dissekera tumörvävnad för att generera SUB är dock tidskrävande och kostsamt. Därför finns det ett akut behov av en snabb metod som kan producera ett stort antal SUB, vilket möjliggör omfattande utvärdering av olika terapeutiska tillvägagångssätt som är lovande för individualiserad läkemedelstestning. Denna studie beskriver en ny metod för att tillverka SUB direkt från nydissekerad tumörvävnad med hjälp av en automatisk vävnadshackare. Dessutom jämfördes PDO:er som genererats med denna metod med manuellt dissekerade SUB:er från samma patienter med avseende på PDO-antal, morfologiska egenskaper, apoptos och proliferation av tumörceller.
Protocol
Alla patienter behandlades vid avdelningen för neurokirurgi, universitetssjukhuset i Würzburg, Tyskland, efter att ha gett skriftligt informerat samtycke i enlighet med Helsingforsdeklarationen och som godkänts av Institutional Review Board vid universitetet i Würzburg (#22/20-me). Tumörvävnadsmaterial från fyra GBM-patienter och ett astrocytom, IDH-mutant, CNS WHO grad 2-patienter (låggradigt gliom, LGG) (tabell 1) erhölls från kirurgi och bearbetades med hjälp av följande protokoll. Den automatiserade processen att generera SUB med hjälp av en vävnadshackare kallas chopper (C) och processen att manuellt skära vävnaden med två skalpeller under mikroskopisk kontroll som manuell (M). Sex lika stora sektioner (1-2 cm3) dissekerades från tumörprovet, sedan delades var och en på mitten och bearbetades homogent med de två metoderna. På grund av den tidigare nämnda intratumorala heterogeniteten genererades en 6-brunnsplatta för varje metod från varje patient där varje brunn representerade PDO:er från en annan plats i den ursprungliga tumören. Båda procedurerna ägde rum under ett skåp med laminärt luftflöde och alla instrument som användes steriliserades före användning. Översikten över tillvägagångssättet illustreras i figur 1.
1. Förberedelse av agarosblock (endast för C-inflygning, frivilligt)
- Fyll 50 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i en bägare, tillsätt en tablett agaros (se Materialförteckning) och blanda väl tills den är suspenderad.
- Värm blandningen i mikrovågsugnen i 30-40 s, undvik kokning. Kyl sedan ner blandningen tills den når 47 °C.
- Häll agarosblandningen i en förseglad cylinderformad gjutform och undvik bubbelbildning. Kyl omedelbart gipset med en frusen (-20 °C) klämma eller genom att lägga det på torris i 30 minuter.
2. Bearbetning av tumörmaterialet
- Förbered en låda med is för att hålla tumörmaterialet kylt på vägen från operationssalen till laboratoriet.
- Överför tumörvävnaden (4-5 cm³) till ett sterilt 50 ml rör som innehåller 25 ml viloläge A (se materialtabell) som täcker tumören och placera röret i islådan.
- Under ett skåp med laminärt luftflöde överför du tumörmaterialet tillsammans med Hibernate A till en steriliserad petriskål av glas.
- Eliminera den nekrotiska vävnaden och dissekera blodkärlen försiktigt med en skalpell och vävnadstång under mikroskopisk kontroll. Identifiera nekrotisk vävnad genom hemorragiska områden som uppvisar en brunaktig nyans till följd av blödning, eller vävnad som uppvisar ett blekare eller vitare utseende i förhållande till den intilliggande viabla vävnaden. Var uppmärksam på att inte klämma eller störa vävnaden.
- Skär tumörmaterialet i sex bitar med en ungefärlig storlek på 1-2 cm3. Fördela bitarna i petriskålar av plast (n = 6) som är förfyllda med 3 ml H-GPSA-medium (tabell 2), vardera22. Lägg petriskålarna på is.
3. Ställa in vävnadshackaren
- Placera kniven enligt beskrivningen i tillverkarens bruksanvisning23.
- Justera skivtjockleken till 0,45-0,50 mm. Ställ in bladkraften på medium. Fäst bordets frigöringsknapp till "start"-läge.
4. Bearbetning av tumörvävnadsbitarna
- Bearbetning av tumörvävnad med hackaren (C-metoden)
- Skär agarosblocken i cylindrar med en längd på 2 cm och limma fast en av dessa cylindrar på hackarens runda plastskål med hjälp av histoakryllimmet (se Materialtabell).
- Skapa en fördjupning i agaroscylindern med hjälp av en skalpell och passa sedan in tumörvävnaden från den första brunnen (steg 2.5) i denna grop.
OBS: Tumörmaterialet ska hanteras försiktigt och inte klämmas eller tryckas in i springan. Gapet ska vara tillräckligt stort för att lätt passa tumören, men tillräckligt litet för att hålla tumörmaterialet stabilt under skärprocessen. Steg 4.1.1. och 4.1.2. är frivilliga. - Placera plastskivan på skärbordets monteringsskiva (se materialförteckning).
- Slå på hackaren och tryck på återställningsknappen. Hackaren börjar nu skära (första omgången). Maskinen stannar automatiskt efter att bordet når slutet och både agaros och tumörvävnad skärs till önskad diameter.
- Vrid monteringsskivan 90° och justera sedan frigöringsbordsratten till startläget.
- Tryck på återställningsknappen och låt maskinen skära vävnaden igen och skapa rektangulär formad vävnad (andra omgången).
- Ta bort plastskivan med det bearbetade materialet och rotera försiktigt endast tumörvävnaden 90° med hjälp av vävnadsspatel.
- Placera plastskivan på skärbordet, justera sedan frigöringsbordsratten till startläget och tryck på återställningsknappen för en sista skäromgång (tredje omgången).
- Stäng av hackaren och ta bort plastskivan. Rengör hackaren och knivarna.
- Använd en 5 ml enkanalspipett, aspirera det bearbetade materialet tillsammans med mediet i pipetten och spola tillbaka suspensionen i skålen.
- Upprepa föregående steg 2-3 gånger för att separera vävnaden ordentligt.
- Lägg tillbaka petriskålen på is och upprepa steg (4.1.1-4.1.12.) med de andra 5 skålarna i varje tumör.
- Manuell bearbetning av tumörvävnad (M-metoden)
- Överför tumörvävnaden från den första petriskålen av plast (steg 2.5) tillsammans med 3 ml H-GPSA-medium (tabell 2) till en petriskål av glas. Dela upp segmentet manuellt under mikroskopet i sektioner på 0,5 mm med hjälp av två skalpeller.
- Överför den dissekerade vävnaden tillbaka till sin petriskål av plast med hjälp av en 2 ml pipett.
- Upprepa steg (4.2.1.-4.2.3.) för tumörsnitten i de övriga fem petriskålarna (steg 2.5).
5. Tvätta tumörvävnaden
- Luta varje petriskål uppåt till 45° och vänta i 30 sekunder tills tumörbitarna sjunker till botten av skålen.
- Aspirera 2.5 ml av H-GPSA-mediet (tabell 2) försiktigt med en 1 ml pipett och var uppmärksam på att inte ta upp någon tumörvävnad.
- Tillsätt 2 ml RBC-lysbuffert (se materialförteckning) till varje prov. De bearbetade tumörbitarna måste täckas helt av lysbuffert.
- Placera de 6 skålarna på en laboratorieorbitalskakmaskin på låg hastighet i 10 minuter.
- Sug upp 2 ml av lyseringsbufferten försiktigt så att den inte tar upp någon tumörvävnad.
- Upprepa de föregående tvättstegen (steg 5.1-5.5) två gånger med 2 ml H-GPSA-medium (tabell 2) istället för lysbuffert varje gång.
6. Odling av tumörvävnaden
- Aspirera H-GPSA-mediet (tabell 2) från varje skål och ersätt det med 4 ml SUB-medium (tabell 2).
- Överför vävnadsbitarna från varje skål till en respektive brunn på en ultralåg tillbehörsplatta med 6 brunnar (se materialförteckning).
- Placera plattan på en orbital shaker inuti en inkubator och inkubera vid 37 °C, 5 % CO2 och 150 rpm i 2-4 veckor.
- Utför ett halvt mediumbyte varannan dag genom att aspirera 2 ml medium från varje brunn och ersätta det med 2 ml färskt sub-medium (tabell 2) förvärmt till 37 °C.
- Observera vävnaden under mikroskopet (morfologi, tillväxt, mediumfärg) och klipp växande SUB (>0,7 mm) eller adhesiv vävnad för att förhindra vävnadshypoxi.
- För att göra det, överför SUB:erna från den ultralåga fästbrunnen till en steriliserad petriskål av glas och använd en skalpell för skärning. Alternativt kan adhesiva SUB lösas genom att aspirera dem med en 1 ml pipett. Var försiktig så att du inte klämmer ihop de skyddade ursprungsbeteckningarna och hantera dem försiktigt.
- Utvärdera bildandet av den skyddade ursprungsbeteckningen genom att räkna den avtalade avgränsningen varannan dag och kontrollera noggrant den önskade runda morfologin (figur 2).
7. Fastställande och inbäddning av skyddade ursprungsbeteckningar
- Fixera två PDO:er från varje brunn hos varje patient med 4 % formalin i 24 timmar efter 6 veckors odling.
- Sänk ned de fasta skyddade ursprungsbeteckningarna i neutralt buffrat formalin (natriumfosfat) tills de bäddas in.
- Placera varje PDO i en kassett (se Materialförteckning) för vidare bearbetning.
- Starta en uttorkningsprocess genom att sänka ner kassetten i följande lösningar som nämns i ANMÄRKNINGEN nedan:
OBS: 50 % etanol i 20 min, 70 % etanol i 20 min, 80 % etanol i 20 min, 96 % etanol i 20 min, 100 % etanol i 20 min, 100 % etanol i 30 min, 100 % etanol + kloroform (1:1-förhållande) i 30 min, 100 % etanol + kloroform (1:1-förhållande) i 30 minuter, Absolut kloroform i 30 min, Absolut kloroform i 30 min, Paraffin i 30 min, Paraffin i 30 min med STP 120. - Bädda in de dehydrerade skyddade ursprungsbeteckningarna i paraffinvax vid 58–60 °C.
- Skär de inbäddade SUB:erna med en tjocklek på 2,5 μm och montera dem på objektglas för färgning.
8. Immunofluorescensfärgning
- Montera SUB efter 6 veckors odling.
- Utför därefter dubbelfärgning mot gliafibrillärt surt protein (GFAP, spädning: 1:100) och proliferationsmarkören Ki67 (utspädning: 1:1000) (se Materialförteckning), som tidigare rapporterats22.
- På samma sätt utvärderas apoptos genom dubbelfärgning av SUB mot GFAP och anti-kaspas-3 (CC3, utspädning: 1:400) (se materialförteckning).
- Ta bilder av SUB:erna med ett fluorescensmikroskop vid 40x förstoring.
- Analysera bilderna för GFAP-, Ki67- och CC3-positiva celler, samt GFAP/Ki67 och GFAP/CC3 dubbelpositiva celler.
- Använd programmet Fiji med öppen källkod (ImageJ-win 32) för bildanalys.
9. Utvärdering och dataanalys
- Ta dagliga mikroskopiska ljusfältsbilder under den första odlingsveckan med standardinställningar och 5x förstoring.
- Observera de morfologiska förändringarna och spåra mognadsprocessen i både manuella och automatiserade bearbetningsmetoder.
- Utför morfologisk analys med hjälp av mikroskopet i standardinställningar för ljusfältsläge.
- Utvärdera PDO-nummer och morfologi under de första 4 veckorna av odling i SUB från alla fem patienterna.
- Få tre avläsningar av varje PDO-antal från varje patient för att beräkna medelvärdet och standardfelet för medelvärdet (SEM).
- Undersöka proliferation och apoptos i SUB från tre patienter.
- Analysera data med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt statistiskt programpaket (se Materialförteckning).
- Tillämpa Students-T- och Mann-Whitney U-tester för att bestämma skillnader mellan manuell och automatiserad PDO-generering när det gäller PDO-antal, proliferation och apoptos.
Representative Results
Fyra patienter med GBM och en med LGG inkluderades efter patologisk bekräftelse av en erfaren neuropatolog (CMM). Majoriteten av patienterna hade en ometylerad MGMT-promotor och alla GBM-patienter var av vildtyp IDH1 och IDH2 (tabell 1). I genomsnitt varade tillverkningsprocessen 88,8 minuter (+/- 6,3 min) i C-inflygningen och 322 min (+/- 17,2 min) i M-inflygningen. Den totala framgångsfrekvensen var 87 % i den manuella och 93 % i chopper-metoden efter 4 veckors odling (n = 5). Dessutom nådde SUB från C-gruppen den önskade rundade formen inom 1 vecka och var tillräckligt mogna för att användas i in vitro-experiment , medan SUB i M-gruppen för det mesta förblev skarpkantade och odefinierade (figur 2). Tumörvävnaden som bearbetades med C-metoden resulterade i totalt 281 SUB (medelvärde per patient = 56 +/- 43) efter den första odlingsveckan, medan 250 SUB (medelvärde per patient = 50 +/- 41) utvecklades med M-metoden. Under den andra odlingsveckan gav vävnaden från alla fem patienterna högre PDO-tal när de genererades med C-metoden (801; Medelvärde per patient = 130 +/- 38) jämfört med M-metoden (601; Medelvärde per patient = 76 +/- 44; P = 0,018). Under den tredje odlingsveckan ackumulerade C-metoden totalt 1105 SUB från alla patienter (medelvärde per patient = 221 +/- 32) jämfört med 771 SUB (medelvärde per patient = 155 +/- 34) i M-metoden (P = 0,032). Dessutom bildades totalt 1195 SUB (medelvärde per patient = 239 +/- 50) efter fyra veckors odling när de genererades med C-metoden jämfört med 784 (medelvärde per patient = 157 +/- 36) med M-metoden (P < 0,01). Därför visade C-metoden ett signifikant högre antal SUB:er från och med den andra veckan (Figur 3). Dessutom utvärderades de relativa fluktuationerna i antalet skyddade ursprungsbeteckningar för att utforska de dynamiska trenderna mellan på varandra följande veckor. Analysen avslöjade en imponerande ökning av antalet skyddade ursprungsbeteckningar under den inledande övergången från den första till den andra veckan i C-metoden (265 %), vilket tyder på snabba framsteg. Därefter skedde en lägre ökning av antalet under den tredje veckan (75 %), vilket återspeglar en tillfällig justering. Däremot visade M-metoden en konsekvent och stadig ökning av antalet skyddade ursprungsbeteckningar (92 % under den andra veckan, respektive 67 % under den tredje veckan), vilket bidrog till en anmärkningsvärd stabilitet i räkningarna under den fjärde veckan. Denna konsekventa uppåtgående trend i antalet skyddade ursprungsbeteckningar understryker tillförlitligheten och motståndskraften hos C-metoden under hela observationsperioden.
Två GBM-patienter och en LGG-patient inkluderades för analys av astrocyttal (GFAP) inom PDO, PDO-cellsproliferation (Ki67) och apoptos (CC3). Det bestämda astrocytantalet visade inga signifikanta skillnader mellan de två bearbetningsmetoderna med ett genomsnitt på 43 % i C-metoden och 45 % i M-metoden (Figur 4 och Figur 5, Kompletterande Figur 1 och Kompletterande Figur 2). På samma sätt var spridningstakten inom de skyddade ursprungsbeteckningarna jämförbar mellan C-metoden (3 %) och M-metoden (1 %). Endast PDO:er som genererats med C-metoden från patient 5 uppvisade en proliferationshastighet på 26 % jämfört med 1 % med M-metoden (P = 0,001; Figur 4C). Generellt sett upptäcktes låga apoptosfrekvenser i SUB som behandlades med C-metoden (3 %) jämfört med 2 % från M-metoden för alla patienter, som inte skilde sig signifikant (figur 5C). Det fanns inte heller någon signifikant skillnad mellan de två metoderna när det gäller antalet astrocyter som genomgår apoptos (Figur 5D).
Figur 1: Grafisk översikt över tillverkningsprocessen för patienthärledd organoid (PDO) med hjälp av en automatiserad hackare jämfört med en manuell metod. Illustrationen visar de olika stegen som är inblandade, inklusive (A) provtagning, (B) dissektion av tumörmaterial, (C) tvättning och (D) inkubation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: SUB-morfologi under den första odlingsveckan. Jämförelse av SUB-bildning efter dissektion med både den automatiserade choppern och den manuella metoden. Skalstreck = 1000 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Antal skyddade ursprungsbeteckningar under de första fyra veckorna av odlingen. X-axeln visar tiden i veckor (W) och y-axeln antalet SUB för C (blå) och M (röd) inflygning (n = 5). Varje datapunkt representerar medelvärdet, med felstaplar som anger medelvärdets standardfel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Cellproliferationshastigheter inom SUB. (A) Representativa immunofluorescensbilder (n = 3) av GFAP-positiva celler (gröna), Ki67-positiva celler (röda) och DAPI (blå) i SUB från patienter 3, 4 och 5 (tabell 1). Alla SUB:er bearbetades med hjälp av choppermetoden (C) och den manuella metoden (M). Skalstreck = 100 μm. (B) Jämförelse av de två metoderna med avseende på det relativa antalet GFAP-positiva celler, (C) Ki67-positiva celler och (D) Ki67/GFAP-dubbelpositiva celler. Icke-signifikanta resultat indikeras med "ns". Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Apoptosfrekvens inom SUB. (A) Representativa immunofluorescensbilder (n = 3) av GFAP-positiva celler (gröna), CC3-positiva celler (röda) och DAPI (blå) i SUB från patienter 3, 4 och 5 (tabell 1). Alla SUB:er bearbetades med hjälp av choppermetoden (C) och den manuella metoden (M). Skalstreck = 100 μm. (B) Jämförelse av de två metoderna med avseende på det relativa antalet GFAP-positiva celler, (C) CC3-positiva celler och (D) CC3/GFAP-dubbelpositiva celler. Icke-signifikanta resultat indikeras med "ns". Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Patientkarakteristika och kliniska parametrar. GBM = glioblastom, IDH-vildtyp, CNS WHO grad 4; LGG = låggradigt gliom; KPS = Karnofskys prestationspoäng; MGMT = O 6-metylguanin-DNA-metyltransferas, IDH1 = isocitratdehydrogenas 1, IDH2 = isocitratdehydrogenas 2, ATRX = α-talassemi/mental retardation, X-bunden gen; M = morfologi; CC = antal celler; p = spridning, A = apoptos. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Medelstora sammansättningar. H-GPSA = Hibernate A-Glutamax pencillin streptomycin amfotericin B. PDO = Patient-derived organoids DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium. NEAA: icke-essentiella aminosyror. Pen-streptokocker: Penicillin/Streptomycin Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Översikt över de tekniker som används för att generera cellodlingsmodeller. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande figur 1: Individuella spridningskanaler för färgning av skyddade ursprungsbeteckningar. (A) DAPI (blå), (B) GFAP-positiva celler (gröna), (C) Ki67-positiva celler (röda) och (D) överlagringskanal i SUB från patienter 3, 4 och 5. Skalstaplar = 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Individuella kanaler för apoptosfärgning av skyddade ursprungsbeteckningar. (A) DAPI (blå), (B) GFAP-positiva celler (gröna), (C) CC3-positiva celler (röda) och (D) överlagringskanal i SUB från patienter 3, 4 och 5. Skalstaplar = 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Denna studie presenterar en snabb och effektiv metod för att generera SUB. GBM är fortfarande en utmanande tumör att behandla, ofta kännetecknad av återfall och en hög sjukdomsbörda 3,6. Det finns ett akut behov av innovativa behandlingsmetoder, eftersom lovande resultat som observerats in vitro ofta inte visar effekt in vivo under fas I-prövningar. En av orsakerna till denna diskrepans kan vara den begränsade förmågan hos odödliga cellinjer från patienter, odlade i monolagerkulturer, att återspegla de komplexa cell-cellinteraktionerna och genetiska egenskaperna hos föräldratumören. Med tanke på den höga inter- och intratumorala heterogeniteten hos GBM 8,9 är individanpassade riktade terapier att föredra och kan vara lovande för framtida tillämpningar. Till skillnad från 2D-vidhäftande cellinjer har organoider förmågan att behålla föräldravävnadens egenskaper21, men komplexa cell-cellinteraktioner mellan tumören och den normala hjärnan är av största vikt och kan potentiellt förbises av denna modell. Manuell generering av SUB är dock en tidskrävande process, och vävnadsskador orsakade av klämning med skalpeller under skärning kan hindra framgångsrik SUB-tillväxt. Därför optimerades en automatiserad metod med hjälp av en vävnadshackare för att generera ett högre antal SUB med minskad tid och ansträngning. Dessutom visade vi att den totala spridnings- och apoptosfrekvensen inte skilde sig åt mellan de två metoderna.
C-metoden är enkel, enkel att genomföra och gör det möjligt att generera ett större antal skyddade ursprungsbeteckningar (figur 3). Rotationen av vävnaden mellan den andra och tredje omgången av hackning identifierades som ett kritiskt steg i protokollet. I detta skede har vävnaden redan förlorat sin integritet och kan lätt falla isär, vilket resulterar i större bitar som kräver ytterligare skärning eller manuell dissektion under mikroskopet. Medan den automatiserade chopper-metoden möjliggör en förinställd skärstorlek med större noggrannhet, saknar den manuella metoden precision när det gäller att bestämma storleken på PDO, vilket leder till ojämnt formade och dimensionerade PDO:er, vilket är en nackdel för jämförande läkemedelsscreening (figur 2). Med den föreslagna metoden uppnås dock inte standardiseringen av cellantal per PDO, vilket kan utgöra en nackdel för standardiserade läkemedelsscreeningprotokoll. Fördelar och nackdelar med olika organoidgenereringstekniker 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42 och deras tillämpningar sammanfattas i tabell 3.
GBM-vävnad kan variera i konsistens, allt från seg (infiltrationszon) till mjuk (nekrotisk kärna), vilket kan innebära utmaningar för den automatiserade hackningsmetoden. Om vävnaden är för hård kan hackaren klämma och skada den, medan för mjuk vävnad kan klämmas. Den valda vävnaden uppvisade distinkta egenskaper, inklusive en mellanliggande nivå av fasthet, sporadiskt med en rosa-gråaktig färgning snarare än att manifestera brun eller gul missfärgning. Vävnad med en svampig och lätt smulig konsistens uppvisade överlägsen konservering i agarosblocken, medan ytterst ömtålig och flytande tumörvävnad utelämnades från provtagningsproceduren. Chopper-metoden möjliggjorde dock en framgångsrik generering av ett högre antal SUB:er jämfört med den manuella metoden, även med vävnad med suboptimal konsistens. Den viktigaste lösningen är att upprätthålla en nära interaktion med kirurgen som utför tumörresektionen för att bearbeta vävnad från olika delar av tumören. I fall av suboptimal vävnadskonsistens var manuell omarbetning av vävnaden under mikroskopet ett användbart tillägg efter hackning. För att ta hänsyn till heterogeniteten delades tumörvävnaden initialt in i sex segment, som vart och ett därefter halverades för antingen C- eller M-metoden. Inom dessa sex olika sektioner förväntas en betydande grad av heterogenitet. Till och med inom de skyddade ursprungsbeteckningarna från samma sektion eller brunn är det dessutom troligt att det finns distinkta subpopulationer.
Som proof of concept rapporterades proliferations- och apoptosdata från två patienter med GBM och en patient med LGG, vilka inte visar några signifikanta skillnader mellan de två metoderna. Genereringen av SUB är inte begränsad till mycket maligna hjärntumörer utan kan även tillämpas på LGG. Denna studie belyser att LGG sällan uppvisar tillväxt i 2D-kulturen, vilket gör utvecklingen av en korrekt modell för deras studie mycket värdefull. Detta protokoll syftar till att demonstrera mångsidigheten i detta tillvägagångssätt när det gäller att generera SUB från GBM såväl som LGG snabbt och effektivt.
Sammantaget skulle PDO:er kunna användas i framtiden för patientorienterad preterapeutisk testning av riktade terapier i maligna hjärntumörer. Att tillhandahålla en snabb och effektiv metod för individualiserad läkemedelsscreening är avgörande, eftersom tumörprogression sker snabbt och det finns ett desperat behov av behandlingsalternativ. Som ett nästa steg kan PDO-modellen utvärderas med olika immunterapeutiska metoder för att bättre efterlikna verkliga behandlingssvar. I framtiden kan SUB användas för att dra sofistikerade slutsatser om behovet av ytterligare utforskning och utvärdering av terapier i en klinisk miljö.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Interdisciplinary Center of Clinical Research (IZKF, B-450) Würzburg, Bayerskt centrum för cancerforskning (BZKF) och publikationen som stöds av Open Access Publishing Fund vid universitetet i Würzburg. Vi vill tacka Dagmar Hemmerich och Siglinde Kühnel, båda sektionsavdelningen för experimentell neurokirurgi, avdelningen för neurokirurgi, universitetssjukhuset i Würzburg, för tekniskt stöd. Figur 1 skapades med hjälp av www.biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
| 30% formaldehyde methanol-free | Carl Roth | 4235.1 | Used in 4% concentration |
| 70% ethanol solution | For sterilisation | ||
| Agarose tablets 0.5 g | Carl Roth | HP67.7 | |
| Amphotericin B 250 µg/mL | Gibco | 15290018 | |
| Anatomical forceps | Hartstein | N/A | |
| Anatomical spatula | Hartstein | N/A | |
| B-27 Supplement without vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | |
| Biopsy cassette with cover | Resolab | 37001-b | |
| Blades for McIlwain Tissue Chopper | Campden instruments | Model TC752-1 | |
| CC3 antibody (Asp 175) | Cells signaling technology | 9661 | |
| Disposable scalpel | Feather | 0200130015 | |
| Distilled water | Gibco | 15230089 | To dilute the formaldehyd |
| Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) | Gibco | 11330032 | Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Sciences | D8537-500ML | Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 433357 | |
| Falcon tube 50 ml Cellstar | Greiner Bio-One | 227261 | |
| GFAP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc33673 | |
| Glass beaker | N/A | N/A | |
| Glass petri dish | N/A | N/A | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050061 | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo scientific | 51032875 | |
| Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet | Thermo scientific | 5016643 | |
| Hibernate-A | Gibco | A1247501 | |
| Histoacryl glue | B. Braun surgical | 1050052 | |
| Human Insulin, Solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-360248 | |
| Ice box | N/A | N/A | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Cavey Laboratory Engineering | 51350V | |
| Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B | Leica | DMI6000B | For brightfield and immunofluorescence pictures |
| Microscope stereozoom S9D | Leica | W841832 | For manual cutting and to organoids monitoring |
| Microwave | Bosch | N/A | To heat the agarose solution |
| Mounting plastic discs | Cavey Laboratory Engineering | 51354 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) | Gibco | 11140050 | |
| Neurobasal (1x) | Gibco | 21103049 | |
| Orbital shaking machine Rotamax120 | Heidolph | 10304491 | |
| Penicilin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic petri dishes Cellstar | greiner bio-one | 628160 | n = 12 |
| Single channel pipette 1000 µm | Eppendorf | 4924000010 | |
| Single channel pipette 5000 µm | Eppendorf | EP3123000276 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 | IBM | ||
| Surgipath Paraplast | Leica | 39601006 | Embedding medium |
| Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate | Thermo Scientific | 174932 |
References
- Gatto, L., et al. IDH inhibitors and beyond: the cornerstone targeted glioma treatment. Mol Diagn Ther. 25 (4), 457-473 (2021).
- Buckner, J. C., et al. Radiation plus Procarbazine, CCNU, and Vincristine in low-grade glioma. N Engl J Med. 374 (14), 1344-1355 (2016).
- Grochans, S., et al.
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma). N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Herrlinger, U., et al. Lomustine-temozolomide combination therapy versus standard temozolomide therapy in patients with newly diagnosed glioblastoma with methylated MGMT promoter (CeTeG/NOA-09): a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 393 (10172), 678-688 (2019).
- Stupp, R., et al. Effect of tumor-treating fields plus maintenance temozolomide vs maintenance temozolomide alone on survival in patients with glioblastoma: a randomized clinical trial. Jama. 318 (23), 2306-2316 (2017).
- Desbaillets, N., Hottinger, A. F. Immunotherapy in glioblastoma: a clinical perspective. Cancers (Basel). 13 (15), 3721 (2021).
- Gularyan, S. K., et al. Investigation of inter- and intratumoral heterogeneity of glioblastoma using TOF-SIMS). Mol Cell Proteomics. 19 (6), 960-970 (2020).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N.
- Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
- Timerman, D., Yeung, C. M. Identity confusion of glioma cell lines. Gene. 536 (1), 221-222 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
- Ogawa, J., Pao, G. M., Shokhirev, M. N., Verma, I. M. Glioblastoma model using human cerebral organoids. Cell Rep. 23 (4), 1220-1229 (2018).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Rep. 26 (12), 3203-3211 (2019).
- da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discov. 23 (8), 862-868 (2018).
- Hubert, C. G., et al. A three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Res. 76 (8), 2465-2477 (2016).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Nickl, V., et al. Glioblastoma-derived three-dimensional ex vivo models to evaluate effects and efficacy of tumor treating fields (TTFields). Cancers (Basel). 14 (21), 5177 (2022).
- Tissue Chopper. Lafayette Instrument. , Available from: http://lafayetteinstrument.com (2023).
- Klein, E., Hau, A. C., Oudin, A., Golebiewska, A., Niclou, S. P. Glioblastoma organoids: pre-clinical applications and challenges in the context of immunotherapy. Front Oncol. 10, 604121 (2020).
- Golebiewska, A., et al. Patient-derived organoids and orthotopic xenografts of primary and recurrent gliomas represent relevant patient avatars for precision oncology. Acta Neuropathol. 140 (6), 919-949 (2020).
- Bougnaud, S., et al. Molecular crosstalk between tumour and brain parenchyma instructs histopathological features in glioblastoma. Oncotarget. 7 (22), 31955-31971 (2016).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nat Cell Biol. 16 (10), 951-954 (2014).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. J Neurosci Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
- Kato, H., Ogawa, T. A technique for preparing in vitro slices of cat's visual cortex for electrophysiological experiments. J Neurosci Methods. 4 (1), 33-38 (1981).
- Teyler, T. J.
- Schulz, E., et al. Preparation and culture of organotypic hippocampal slices for the analysis of brain metastasis and primary brain tumor growth. Methods Mol Biol. 2294, 59-77 (2021).
- Driehuis, E., Gracanin, A., Vries, R. G. J., Clevers, H., Boj, S. F. Establishment of pancreatic organoids from normal tissue and tumors. STAR Protoc. 1 (3), 100192 (2020).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Neal, J. T., et al. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Li, X., et al. Oncogenic transformation of diverse gastrointestinal tissues in primary organoid culture. Nat Med. 20 (7), 769-777 (2014).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
- Zhao, Z., et al.
- Toh, Y. C., et al. A novel 3D mammalian cell perfusion-culture system in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (3), 302-309 (2007).
- Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., van Noort, D., Yu, H. Towards a human-on-chip: culturing multiple cell types on a chip with compartmentalized microenvironments. Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kengla, C., Atala, A., Sang Jin, L.
