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Cancer Research

एक ऊतक चॉपर का उपयोग करके पूर्व विवो रोगी-व्युत्पन्न ग्लियोमा ऑर्गेनोइड की खेती करना

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65952
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2, 3, 4, 1, 2, 2
1Section Experimental Neurosurgery, Department of Neurosurgery, University Hospital Würzburg, 2Department of Neurosurgery, University Hospital Würzburg, 3Department of Hematology, University Hospital Würzburg, 4Department of Neuropathology, Institute of Pathology, University Hospital Würzburg

Summary

यह अध्ययन एक ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग करके रोगी-व्युत्पन्न ग्लियोब्लास्टोमा 3-आयामी ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक स्वचालित विधि का परिचय देता है। विधि चिकित्सीय परीक्षण के लिए ऐसे ऑर्गेनोइड प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त और प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करती है।

Abstract

ग्लियोब्लास्टोमा, आईडीएच-वाइल्ड टाइप, सीएनएस डब्ल्यूएचओ ग्रेड 4 (जीबीएम) एक प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर है जो आक्रामक उपचार के बावजूद खराब रोगी के अस्तित्व से जुड़ा है। यथार्थवादी पूर्व विवो मॉडल विकसित करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। रोगी-व्युत्पन्न 3-आयामी ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) मॉडल अभिनव प्लेटफॉर्म प्रदान करते हैं जो मूल ट्यूमर की प्रमुख विशेषताओं को संरक्षित करते हुए जीबीएम की फेनोटाइपिक और आणविक विविधता को पकड़ते हैं। हालांकि, पीडीओ पीढ़ी के लिए मैनुअल विच्छेदन समय लेने वाली, महंगी है और इसके परिणामस्वरूप कई अनियमित और असमान आकार के पीडीओ हो सकते हैं। यह अध्ययन एक स्वचालित ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग करके पीडीओ उत्पादन के लिए एक अभिनव विधि प्रस्तुत करता है। चार जीबीएम और एक एस्ट्रोसाइटोमा, आईडीएच-म्यूटेंट, सीएनएस डब्ल्यूएचओ ग्रेड 2 रोगियों से ट्यूमर के नमूनों को ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग करने के साथ-साथ मैन्युअल रूप से संसाधित किया गया था। मैनुअल दृष्टिकोण में, ट्यूमर सामग्री सूक्ष्म नियंत्रण के तहत स्केलपेल का उपयोग विच्छेदित किया गया था, जबकि ऊतक हेलिकॉप्टर तीन अलग अलग कोणों पर कार्यरत किया गया था. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर संस्कृति के बाद, रूपात्मक परिवर्तन उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया, जबकि प्रसार (Ki67) और apoptosis (सीसी 3) 6 सप्ताह के बाद immunofluorescence द्वारा मूल्यांकन किया गया. ऊतक हेलिकॉप्टर विधि ने विनिर्माण समय का लगभग 70% कम कर दिया और इसके परिणामस्वरूप दूसरे सप्ताह से मैन्युअल रूप से संसाधित ऊतक की तुलना में काफी अधिक पीडीओ औसत गिनती हुई (सप्ताह 2: 801 बनाम 601, पी = 0.018; सप्ताह 3: 1105 बनाम 771, पी = 0.032; और सप्ताह 4:1195 बनाम 784, पी < 0.01)। गुणवत्ता मूल्यांकन ने दोनों विनिर्माण विधियों के लिए ट्यूमर-सेल एपोप्टोसिस और प्रसार की समान दरों का खुलासा किया। इसलिए, स्वचालित ऊतक हेलिकॉप्टर विधि समय और पीडीओ उपज के मामले में अधिक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करती है। यह विधि जीबीएम रोगियों की दवा- या इम्यूनोथेरेपी-स्क्रीनिंग के लिए वादा करती है।

Introduction

निम्न-श्रेणी के ग्लियोमास (एलजीजी) अपेक्षाकृत दुर्लभ मस्तिष्क ट्यूमर का एक समूह है जो आमतौर पर ग्लियोब्लास्टोमा जैसे उच्च श्रेणी के ग्लियोमास की तुलना में धीमी गति से बढ़ने और कम आक्रामक के रूप में मौजूद होता है। वे वयस्कों और बच्चों दोनों में हो सकते हैं, वयस्कों में थोड़ा अधिक प्रसार के साथ। सटीक प्रसार क्षेत्र और जनसंख्या के अनुसार भिन्न होता है, लेकिन एलजीजी सभी प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर के लगभग 15% -20% के लिए खातेहैं। एलजीजी के लिए उपचार रणनीतियों में अक्सर सर्जरी, विकिरण चिकित्सा और कीमोथेरेपी का संयोजन शामिल होता है, जिसका लक्ष्य न्यूरोलॉजिकल फ़ंक्शन को संरक्षित करते हुए ट्यूमर लकीर को अधिकतम करना है। एलजीजी का प्रबंधन जटिल हो सकता है, और चिकित्सा का विकल्प ट्यूमर स्थान और आणविक विशेषताओं जैसे कारकों पर निर्भर हो सकताहै। एलजीजी के आनुवंशिक और आणविक आधार को समझने में प्रगति ने अधिक लक्षित उपचारों को जन्म दिया है, और उपचार दृष्टिकोणों को परिष्कृत करने के लिए चल रहे शोध जारी हैं।

दूसरी ओर, ग्लियोब्लास्टोमा, आईडीएच-वाइल्ड टाइप, सीएनएस डब्ल्यूएचओ ग्रेड 4 (जीबीएम), वयस्कों में पाया जाने वाला सबसे प्रचलित प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर है, जिसकी घटना दर प्रति 100,000 व्यक्ति-वर्ष 3.19-4.17 मामलों के बीच है। जीबीएम सिरदर्द, दौरे, फोकल न्यूरोलॉजिकल घाटे, व्यक्तित्व में बदलाव और इंट्राक्रैनील दबाव में वृद्धि जैसे लक्षणों का कारण बनता है। जीबीएम के लिए मानक उपचार में ट्यूमर का डिबल्किंग शामिल है, यदि संभव हो, तो इसके बाद टेमोजोलोमाइड4 के साथ संयुक्त विकिरण चिकित्सा की जाती है। इसके अलावा, Temozolomide और Lomustine के संयोजन से O 6-methylguanine-methyltransferase (MGMT)-प्रमोटर मिथाइलेशन5 वाले रोगियों में औसत समग्र उत्तरजीविता दर में वृद्धि हो सकती है। हालांकि, इन हालिया चिकित्सीय दृष्टिकोणों के बावजूद, जीबीएम खराब पूर्वानुमान के साथ एक लाइलाज बीमारी बनी हुई है, जो रोगियों की औसत समग्र जीवित रहने की दर 16 महीने से 20.9 महीने तक की विशेषता है जब ट्यूमर ट्रीटिंग फील्ड्स (टीटीफिल्ड्स)को 3,6 जोड़ा जाता है। जीबीएम में कई इम्यूनोथेरेप्यूटिक दृष्टिकोणों की जांच की गई है लेकिन विवो में सीमित प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया गया है। इसके अलावा, नैदानिक और प्रीक्लिनिकल सीमाएं चिकित्सीय सफलताओं में बाधाडालती हैं 7. जीबीएम की इंटर-8 और इंट्राट्यूमरल9 विषमता के कारण एक उपयुक्त और यथार्थवादी पूर्व वीवो मॉडल की स्थापना चुनौतीपूर्ण रही है।

पारंपरिक 2-आयामी (2 डी) रोगी सेल लाइनें सजातीय सेल आबादी का प्रतिनिधित्व करती हैं और उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त हैं। हालांकि, रोगी-व्युत्पन्न और अमर सेल लाइनें विकास की स्थिति में अंतर और कई मार्ग10,11,12के बाद जीनोटाइपिक और फेनोटाइपिक विशेषताओं में विचलन के कारण जीबीएम की पर्याप्त रूप से नकल करने में विफल रहती हैं।

दूसरी ओर, 3 डी ऑर्गेनॉइड मॉडल हाल ही में आशाजनक प्रणालियों के रूप में उभरे हैं जो अंग की फेनोटाइपिक और आणविक विविधता और विभिन्न कैंसर प्रकारों 13,14,15,16,17,18को दोहराते हैं। जीबीएम के संदर्भ में, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड आनुवंशिक रूप से ट्यूमर जैसी विशेषताओं 16,17 या ट्यूमर सेल घुसपैठ 18,19प्रेरित करने के लिए जीएससी या स्फेरॉइड के साथ सह-सुसंस्कृत अनुकरण करने के लिए संशोधित किया गया है। जबकि मैट्रिगेल और ईजीएफ/बीएफजीएफ के साथ सुसंस्कृत रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम ऑर्गेनोइड स्टेम सेल विषमता और हाइपोक्सिया20 जैसे जीबीएम हॉलमार्क प्रदर्शित करते हैं, यह अनिश्चित है कि यह मॉडल किस हद तक रोगियों के नियोप्लाज्म के प्रमुख आणविक गुणों का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम ऑर्गेनोइड (पीडीओ) आशाजनक मॉडल हैं जो अपने अनुरूप पैतृक ट्यूमर की प्रमुख विशेषताओं को बनाए रख सकते हैं, जिसमें हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं, सेलुलर विविधता, जीन अभिव्यक्ति और उत्परिवर्ती प्रोफाइल शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, वे तेजी से वयस्क कृंतक दिमाग में आरोपण पर घुसपैठ कर रहे हैं, दवा परीक्षण और व्यक्तिगत चिकित्सा21 के लिए एक यथार्थवादी मॉडल प्रदान करते हैं. हालांकि, पीडीओ उत्पन्न करने के लिए ट्यूमर ऊतक को मैन्युअल रूप से विदारक करना समय लेने वाली और महंगा है। इसलिए, एक तीव्र विधि के लिए एक तत्काल आवश्यकता मौजूद है जो बड़ी संख्या में पीडीओ का उत्पादन कर सकती है, जिससे व्यक्तिगत दवा परीक्षण के लिए वादा करने वाले विभिन्न चिकित्सीय दृष्टिकोणों का व्यापक मूल्यांकन सक्षम हो सकता है। यह अध्ययन एक स्वचालित ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग करके ताजा विच्छेदित ट्यूमर ऊतक से सीधे पीडीओ के निर्माण के लिए एक नई विधि का वर्णन करता है। इसके अलावा, इस विधि द्वारा उत्पन्न पीडीओ की तुलना पीडीओ गिनती, रूपात्मक विशेषताओं, एपोप्टोसिस और ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार के संदर्भ में एक ही रोगियों से मैन्युअल रूप से विच्छेदित पीडीओ के साथ की गई थी।

Protocol

हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार लिखित सूचित सहमति देने के बाद और वुर्जबर्ग विश्वविद्यालय (#22/20-me) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित के रूप में सभी रोगियों का इलाज न्यूरोसर्जरी विभाग, यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल वुर्जबर्ग, जर्मनी में किया गया था। चार जीबीएम रोगियों और एक एस्ट्रोसाइटोमा, आईडीएच-उत्परिवर्ती, सीएनएस डब्ल्यूएचओ ग्रेड 2 रोगियों (निम्न ग्रेड ग्लियोमा, एलजीजी) (तालिका 1) से ट्यूमर ऊतक सामग्री सर्जरी से प्राप्त की गई थी और निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके संसाधित की गई थी। एक ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग पीडीओ उत्पन्न करने की स्वचालित प्रक्रिया को हेलिकॉप्टर (सी) के रूप में संदर्भित किया जाता है और मैनुअल (एम) के रूप में सूक्ष्म नियंत्रण के तहत दो स्केलपेल के साथ ऊतक को मैन्युअल रूप से काटने की प्रक्रिया को संदर्भित किया जाता है। छह समान आकार वर्गों (1-2 सेमी3) ट्यूमर नमूना से विच्छेदित थे, तो प्रत्येक एक आधे में कटौती की गई थी और दो तरीकों का उपयोग homogenously संसाधित किया गया था. उपरोक्त इंट्राट्यूमरल विषमता के कारण, प्रत्येक दृष्टिकोण के लिए एक 6-अच्छी प्लेट प्रत्येक रोगी से उत्पन्न हुई थी, जिसमें प्रत्येक अच्छी तरह से मूल ट्यूमर के भीतर एक अलग साइट से पीडीओ का प्रतिनिधित्व करता था। दोनों प्रक्रियाओं एक लामिना airflow कैबिनेट के तहत जगह ले ली और सभी इस्तेमाल उपकरणों का उपयोग करने से पहले निष्फल थे. दृष्टिकोण का अवलोकन चित्रा 1 में सचित्र है.

1. agarose ब्लॉक तैयार करना (केवल सी-दृष्टिकोण के लिए, वैकल्पिक)

  1. एक बीकर में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 50 एमएल भरें, अगारोज की एक गोली जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें), और निलंबित होने तक अच्छी तरह मिलाएं।
  2. उबलने से बचते हुए मिश्रण को माइक्रोवेव में 30-40 सेकंड के लिए गर्म करें। फिर मिश्रण को तब तक ठंडा करें जब तक कि यह 47 डिग्री सेल्सियस तक न पहुंच जाए।
  3. अगारोज मिश्रण को एक सीलबंद सिलेंडर के आकार के कास्टिंग मोल्ड में डालें और किसी भी बुलबुला-गठन से बचें। तुरंत एक जमे हुए (-20 डिग्री सेल्सियस) क्लैंप का उपयोग कर या 30 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर रखकर कलाकारों को ठंडा करें।

2. ट्यूमर सामग्री प्रसंस्करण

  1. ऑपरेटिंग कमरे से प्रयोगशाला के रास्ते पर ट्यूमर सामग्री ठंडा रखने के लिए बर्फ का एक बॉक्स तैयार करें.
  2. ट्यूमर ऊतक (4-5 सेमी³) को एक बाँझ 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें ट्यूमर को कवर करने वाले हाइबरनेट ए ( सामग्री की तालिकादेखें) के 25 एमएल होते हैं और ट्यूब को बर्फ बॉक्स में रखते हैं।
  3. एक लामिना एयरफ्लो कैबिनेट के तहत, हाइबरनेट ए के साथ ट्यूमर सामग्री को एक निष्फल ग्लास पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  4. नेक्रोटिक ऊतक को हटा दें और सूक्ष्म नियंत्रण के तहत एक स्केलपेल और ऊतक संदंश का उपयोग करके रक्त वाहिकाओं को ध्यान से काटें। रक्तस्रावी क्षेत्रों द्वारा नेक्रोटिक ऊतक की पहचान करें जो रक्तस्राव के परिणामस्वरूप भूरे रंग का रंग प्रदर्शित करते हैं, या ऊतक आसन्न व्यवहार्य ऊतक के सापेक्ष एक पीला या सफेद उपस्थिति प्रदर्शित करते हैं। ध्यान दें कि ऊतक को निचोड़ें या बाधित न करें।
  5. ट्यूमर सामग्री को 1-2 सेमी3 के अनुमानित आकार के साथ छह टुकड़ों में काटें। प्लास्टिक पेट्री व्यंजन (एन = 6) एच-जीपीएसए माध्यम (तालिका 2) के 3 एमएल के साथ पहले से भरे हुए टुकड़ों को वितरित करें, प्रत्येक22. बर्फ पर पेट्री व्यंजन रखें.

3. ऊतक हेलिकॉप्टर की स्थापना

  1. ब्लेड को निर्माताओं के मैनुअल23 में वर्णित अनुसार रखें।
  2. टुकड़ा मोटाई 0.45-0.50 मिमी के लिए समायोजित करें. ब्लेड बल को मध्यम पर सेट करें। तालिका रिलीज घुंडी को "प्रारंभ" मोड में ठीक करें।

4. ट्यूमर ऊतक के टुकड़ों को संसाधित करना

  1. हेलिकॉप्टर के साथ ट्यूमर ऊतक प्रसंस्करण (सी विधि)
    1. अगारोज ब्लॉकों को 2 सेमी लंबाई के सिलेंडरों में काटें और इनमें से एक सिलेंडर को हिस्टोएक्रिल गोंद ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके हेलिकॉप्टर परिपत्र प्लास्टिक डिश पर गोंद करें।
    2. एक स्केलपेल का उपयोग कर agarose सिलेंडर में एक गहरीकरण बनाएँ, और फिर इस गड्ढे के भीतर पहली अच्छी तरह से (2.5 कदम) से ट्यूमर ऊतक फिट.
      नोट: ट्यूमर सामग्री को सावधानी से संभाला जाना चाहिए और निचोड़ा नहीं जाना चाहिए या अंतराल में धकेल दिया जाना चाहिए। अंतर ट्यूमर को आसानी से फिट करने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए, लेकिन काटने की प्रक्रिया के दौरान ट्यूमर सामग्री को स्थिर रखने के लिए पर्याप्त छोटा होना चाहिए। चरण 4.1.1. और 4.1.2। वैकल्पिक हैं।
    3. प्लास्टिक डिस्क को कटिंग टेबल के माउंटिंग डिस्क पर रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    4. चॉपर को चालू करें और रीसेट बटन दबाएं। हेलिकॉप्टर अब काटना (पहला राउंड) शुरू करता है। तालिका के अंत तक पहुंचने के बाद मशीन स्वचालित रूप से बंद हो जाती है और अगारोज और ट्यूमर ऊतक दोनों वांछित व्यास में कट जाते हैं।
    5. माउंटिंग डिस्क को 90° घुमाएं, और फिर रिलीजिंग टेबल नॉब को स्टार्टिंग मोड में एडजस्ट करें।
    6. रीसेट बटन दबाएं और मशीन को आयताकार आकार के ऊतक (दूसरा दौर) बनाने के लिए ऊतक को फिर से काटने दें।
    7. संसाधित सामग्री के साथ प्लास्टिक डिस्क निकालें और ध्यान से ऊतक स्पैटुला का उपयोग करके केवल ट्यूमर ऊतक को 90 डिग्री तक घुमाएं।
    8. प्लास्टिक डिस्क को कटिंग टेबल पर रखें, फिर रिलीजिंग टेबल नॉब को स्टार्टिंग मोड में एडजस्ट करें और अंतिम कटिंग राउंड (तीसरा राउंड) के लिए रीसेट बटन दबाएं।
    9. चॉपर को बंद कर दें और प्लास्टिक डिस्क को हटा दें। हेलिकॉप्टर और ब्लेड को साफ करें।
    10. 5 एमएल सिंगल चैनल पिपेट का उपयोग करके, प्रोसेस्ड सामग्री को माध्यम के साथ पिपेट में एस्पिरेट करें और निलंबन को डिश में वापस फ्लश करें।
    11. ऊतक को ठीक से अलग करने के लिए पिछले चरण को 2-3 बार दोहराएं।
    12. पेट्री डिश को वापस बर्फ पर रखें और प्रत्येक ट्यूमर के अन्य 5 व्यंजनों के साथ कदम (4.1.1-4.1.12.) दोहराएं।
  2. मैन्युअल रूप से ट्यूमर ऊतक प्रसंस्करण (एम विधि)
    1. एच-जीपीएसए माध्यम (तालिका 2) के 3 एमएल के साथ पहले प्लास्टिक पेट्री डिश (चरण 2.5) से ट्यूमर ऊतक को एक गिलास पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। दो स्केलपेल का उपयोग करके 0.5 मिमी के वर्गों में माइक्रोस्कोप के तहत मैन्युअल रूप से खंड को काटना।
    2. विच्छेदित ऊतक को 2 एमएल विंदुक का उपयोग करके अपने प्लास्टिक पेट्री डिश में वापस स्थानांतरित करें।
    3. दोहराएँ कदम (4.2.1.-4.2.3.) अन्य पांच पेट्री व्यंजन (2.5 कदम) में ट्यूमर वर्गों के लिए.

5. ट्यूमर ऊतक धोना

  1. प्रत्येक पेट्री डिश को 45 डिग्री तक ऊपर की ओर झुकाएं और 30 एस तक प्रतीक्षा करें जब तक कि ट्यूमर के टुकड़े डिश के नीचे तक डूब न जाएं।
  2. एच-जीपीएसए माध्यम (तालिका 2) के 2.5 एमएल को ध्यान से 1 एमएल विंदुक का उपयोग करके महाप्राण करें और किसी भी ट्यूमर ऊतक को न लेने के लिए जागरूक रहें।
  3. प्रत्येक नमूने में आरबीसी लाइसिस बफर ( सामग्री की तालिकादेखें) के 2 एमएल जोड़ें। संसाधित ट्यूमर के टुकड़ों को पूरी तरह से लाइसिस बफर द्वारा कवर किया जाना चाहिए।
  4. 10 मिनट के लिए धीमी गति पर एक प्रयोगशाला कक्षीय मिलाते हुए मशीन पर 6 व्यंजन रखें.
  5. किसी भी ट्यूमर ऊतक को नहीं लेने के लिए ध्यान से लाइसिस बफर के 2 एमएल को एस्पिरेट करें।
  6. हर बार lysis बफर के बजाय एच-जीपीएसए माध्यम (तालिका 2) के 2 एमएल का उपयोग करके दो बार पिछले धोने के चरणों (चरण 5.1-5.5) को दोहराएं।

6. ट्यूमर ऊतक संवर्धन

  1. प्रत्येक डिश से एच-जीपीएसए माध्यम (तालिका 2) को एस्पिरेट करें और इसे पीडीओ माध्यम (तालिका 2) के 4 एमएल के साथ बदलें।
  2. प्रत्येक डिश के ऊतक विखंडू को अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 6-वेल प्लेट के संबंधित कुएं में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. एक इनक्यूबेटर के अंदर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर थाली प्लेस और 2-4 सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 150 आरपीएम पर सेते हैं.
  4. प्रत्येक कुएं से माध्यम के 2 एमएल की आकांक्षा करके हर दो दिनों में आधा मध्यम परिवर्तन करें और इसे ताजा पीडीओ माध्यम के 2 एमएल (तालिका 2) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म करें।
  5. माइक्रोस्कोप (आकृति विज्ञान, विकास, मध्यम रंग) के तहत ऊतक का निरीक्षण करें और ऊतक हाइपोक्सिया को रोकने के लिए बढ़ते पीडीओ (>0.7 मिमी) या चिपकने वाला ऊतक काट लें।
    1. ऐसा करने के लिए, अल्ट्रा कम लगाव से पीडीओ अच्छी तरह से एक निष्फल गिलास पेट्री डिश के लिए हस्तांतरण और काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, चिपकने वाला पीडीओ उन्हें 1 एमएल विंदुक के साथ महाप्राण द्वारा हल किया जा सकता है। सावधान रहें कि पीडीओ को निचोड़ें और उन्हें धीरे से न संभालें।
  6. हर दो दिनों में पीडीओ की गिनती करके पीडीओ गठन का मूल्यांकन करें और वांछित दौर आकृति विज्ञान(चित्रा 2)के लिए अच्छी तरह से जांचें।

7. पीडीओ को ठीक करना और एम्बेड करना

  1. संस्कृति के 6 सप्ताह के बाद 24 घंटे के लिए 4% फॉर्मेलिन के साथ प्रत्येक रोगी के प्रत्येक कुएं से दो पीडीओ को ठीक करें।
  2. एम्बेडिंग तक तटस्थ रूप से बफर (सोडियम फॉस्फेट) फॉर्मेलिन में निश्चित पीडीओ को विसर्जित करें।
  3. आगे की प्रक्रिया के लिए प्रत्येक पीडीओ को कैसेट ( सामग्री की तालिकादेखें) में रखें।
  4. नीचे दिए गए नोट में बताए अनुसार निम्नलिखित समाधानों में कैसेट को डुबोकर निर्जलीकरण प्रक्रिया शुरू करें:
    नोट: 20 मिनट के लिए 50% इथेनॉल, 20 मिनट के लिए 70% इथेनॉल, 20 मिनट के लिए 80% इथेनॉल, 20 मिनट के लिए 96% इथेनॉल, 20 मिनट के लिए 100% इथेनॉल, 30 मिनट के लिए 100% इथेनॉल + क्लोरोफॉर्म (1: 1 अनुपात), 30 मिनट के लिए 100% इथेनॉल + क्लोरोफॉर्म (1: 1 अनुपात), 30 मिनट के लिए पूर्ण क्लोरोफॉर्म, 30 मिनट के लिए पूर्ण क्लोरोफॉर्म, 30 मिनट के लिए पैराफिन, एसटीपी 120 का उपयोग करके 30 मिनट के लिए पैराफिन।
  5. 58-60 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन मोम में निर्जलित पीडीओ एम्बेड करें।
  6. 2.5 माइक्रोन मोटाई पर एम्बेडेड पीडीओ स्लाइस और धुंधला हो जाना के लिए स्लाइड पर उन्हें माउंट.

8. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना

  1. 6 सप्ताह की संस्कृति के बाद पीडीओ माउंट करें।
  2. इसके बाद, ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी, कमजोर पड़ने: 1:100) और प्रसार मार्कर Ki67 (कमजोर पड़ने: 1:1000) ( सामग्री की तालिकादेखें) के खिलाफ डबल धुंधला प्रदर्शन करें, जैसा कि पहले22 बताया गया था।
  3. इसी तरह, GFAP और विरोधी caspase-3 (सीसी 3, कमजोर पड़ने: 1:400) ( सामग्री की तालिकादेखें) के खिलाफ डबल धुंधला पीडीओ द्वारा apoptosis का मूल्यांकन.
  4. 40x आवर्धन पर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पीडीओ की छवियों पर कब्जा.
  5. GFAP-, Ki67-, और CC3-पॉजिटिव कोशिकाओं के साथ-साथ GFAP/Ki67 और GFAP/CC3 डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए छवियों का विश्लेषण करें।
  6. छवि विश्लेषण के लिए ओपन-सोर्स प्रोग्राम फिजी (इमेजजे-विन 32) का उपयोग करें।

9. मूल्यांकन और डेटा विश्लेषण

  1. मानक सेटिंग्स और 5x बढ़ाई पर संस्कृति के पहले सप्ताह के दौरान दैनिक सूक्ष्म उज्ज्वल क्षेत्र चित्रों पर कब्जा.
  2. रूपात्मक परिवर्तनों का निरीक्षण करें और मैनुअल और स्वचालित प्रसंस्करण दोनों दृष्टिकोणों में परिपक्व प्रक्रिया को ट्रैक करें।
  3. मानक ब्राइटफील्ड मोड सेटिंग्स में माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रूपात्मक विश्लेषण का संचालन करें।
  4. सभी पांच रोगियों से पीडीओ में संस्कृति के पहले 4 सप्ताह के दौरान पीडीओ संख्या और आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करें।
  5. माध्य (एसईएम) के माध्य और मानक त्रुटि की गणना करने के लिए प्रत्येक रोगी से प्रत्येक पीडीओ गिनती के तीन रीडिंग प्राप्त करें।
  6. तीन रोगियों से पीडीओ में प्रसार और एपोप्टोसिस की जांच करें।
  7. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  8. पीडीओ गिनती, प्रसार और एपोप्टोसिस के संदर्भ में मैनुअल और स्वचालित पीडीओ पीढ़ी के बीच अंतर निर्धारित करने के लिए छात्र-टी और मान-व्हिटनी यू टेस्ट लागू करें।

Representative Results

एक अनुभवी न्यूरोपैथोलॉजिस्ट (सीएमएम) द्वारा पैथोलॉजिकल पुष्टि के बाद जीबीएम के साथ चार रोगियों और एलजीजी के साथ एक को शामिल किया गया था। अधिकांश रोगियों में एक अनमेथिलेटेड एमजीएमटी प्रमोटर था, और सभी जीबीएम रोगी आईडीएच 1 और आईडीएच 2 जंगली प्रकार (तालिका 1) थे। औसतन, निर्माण प्रक्रिया सी दृष्टिकोण में 88.8 मिनट (+/- 6.3 मिनट) और एम दृष्टिकोण में 322 मिनट (+/- 17.2 मिनट) तक चली। मैनुअल में समग्र सफलता दर 87% और 4 सप्ताह की संस्कृति (एन = 5) के बाद हेलिकॉप्टर दृष्टिकोण में 93% थी। इसके अलावा, सी समूह से व्युत्पन्न पीडीओ 1 सप्ताह के भीतर वांछित गोल आकार तक पहुंच गए और इन विट्रो प्रयोगों में इस्तेमाल होने के लिए पर्याप्त परिपक्व थे, जबकि एम समूह के पीडीओ ज्यादातर तेजी से धार वाले और अपरिभाषित (चित्रा 2) बने रहे। सी दृष्टिकोण के साथ संसाधित ट्यूमर ऊतक के परिणामस्वरूप संस्कृति के पहले सप्ताह के बाद कुल मिलाकर 281 पीडीओ (प्रति रोगी मतलब = 56 +/- 43) हुआ, जबकि 250 पीडीओ (प्रति रोगी मतलब = 50 +/- 41) एम दृष्टिकोण के साथ विकसित हुआ। संस्कृति के दूसरे सप्ताह के दौरान, सभी पांच रोगियों के ऊतक ने उच्च पीडीओ संख्या प्राप्त की जब वे सी दृष्टिकोण (801; एम दृष्टिकोण (601; औसत प्रति रोगी = 76 +/- 44; पी = 0.018)। संस्कृति के तीसरे सप्ताह के दौरान, सी दृष्टिकोण ने एम दृष्टिकोण (पी = 0.032) में 771 पीडीओ (प्रति रोगी मतलब = 155 +/- 34) की तुलना में सभी रोगियों (प्रति रोगी = 221 +/- 32) से कुल मिलाकर 1105 पीडीओ जमा किए। इसके अलावा, एम दृष्टिकोण (पी < 0.01) का उपयोग करते हुए 784 (प्रति रोगी औसत = 157 +/- 36) की तुलना में सी दृष्टिकोण के साथ उत्पन्न होने पर चार सप्ताह की संस्कृति के बाद कुल 1195 पीडीओ (औसत प्रति रोगी = 239 +/- 50) का गठन किया गया। इसलिए, सी विधि ने दूसरे सप्ताह(चित्रा 3)से शुरू होने वाली काफी अधिक पीडीओ गिनती दिखाई। इसके अलावा, पीडीओ की गिनती में सापेक्ष उतार-चढ़ाव का मूल्यांकन लगातार हफ्तों के बीच गतिशील रुझानों का पता लगाने के लिए किया गया था। विश्लेषण ने सी दृष्टिकोण (265%) में पहले से दूसरे सप्ताह तक प्रारंभिक संक्रमण के दौरान पीडीओ की गिनती में एक प्रभावशाली उछाल का खुलासा किया, जो तेजी से प्रगति का संकेत था। इसके बाद, तीसरे सप्ताह (75%) के दौरान गिनती में कम वृद्धि हुई, जो एक अस्थायी समायोजन को दर्शाती है। इसके विपरीत, एम दृष्टिकोण ने पीडीओ काउंट में लगातार और स्थिर वृद्धि (दूसरे सप्ताह में 92%, तीसरे सप्ताह में क्रमशः 67%) का प्रदर्शन किया, जिसने चौथे सप्ताह के दौरान गिनती में उल्लेखनीय स्थिरता में योगदान दिया। पीडीओ काउंट में यह लगातार ऊपर की ओर प्रवृत्ति अवलोकन अवधि के दौरान सी दृष्टिकोण की विश्वसनीयता और लचीलापन को रेखांकित करती है।

दो जीबीएम रोगियों और एक एलजीजी रोगी को पीडीओ, पीडीओ सेल प्रसार (केआई 67), और एपोप्टोसिस (सीसी 3) के भीतर एस्ट्रोसाइट-संख्या (जीएफएपी) के विश्लेषण के लिए शामिल किया गया था। निर्धारित एस्ट्रोसाइट गिनती ने सी दृष्टिकोण में औसतन 43% और एम दृष्टिकोण में 45% (चित्रा 4 और चित्रा 5, पूरक चित्रा 1 और पूरक चित्रा 2) के साथ दो प्रसंस्करण विधियों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। इसी प्रकार, पीडीओ के भीतर प्रसार दर सी (3%) और एम दृष्टिकोण (1%) के बीच तुलनीय थी। रोगी 5 से सी दृष्टिकोण के साथ उत्पन्न केवल पीडीओ ने एम दृष्टिकोण के साथ 1% की तुलना में 26% की प्रसार दर प्रदर्शित की (पी = 0.001; चित्रा 4 सी)। सभी रोगियों के लिए एम दृष्टिकोण से 2% की तुलना में सी दृष्टिकोण (3%) के साथ संसाधित पीडीओ में कुल मिलाकर कम एपोप्टोसिस दरों का पता चला था, जो काफी अलग नहीं थे (चित्रा 5सी)। इसके अलावा, एपोप्टोसिस (चित्रा 5 डी) से गुजरने वाले एस्ट्रोसाइट्स की संख्या के बारे में दो तरीकों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।

Figure 1
चित्रा 1: एक मैनुअल दृष्टिकोण बनाम एक स्वचालित हेलिकॉप्टर का उपयोग कर रोगी व्युत्पन्न organoid (पीडीओ) विनिर्माण प्रक्रिया के ग्राफिकल अवलोकन. चित्रण में शामिल विभिन्न चरणों को दर्शाया गया है, जिसमें (ए) नमूना संग्रह, (बी) ट्यूमर सामग्री विच्छेदन, (सी) धुलाई, और (डी) इनक्यूबेशन शामिल हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: संस्कृति के पहले सप्ताह के दौरान पीडीओ आकृति विज्ञान। स्वचालित हेलिकॉप्टर और मैनुअल विधि दोनों का उपयोग करके विच्छेदन के बाद पीडीओ गठन की तुलना। स्केल सलाखों = 1000 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: संस्कृति के पहले चार हफ्तों के दौरान पीडीओ गिनती। x-अक्ष सप्ताह (W) में समय प्रदर्शित करता है, और y-अक्ष C (नीला) और M (लाल) दृष्टिकोण (n = 5) के PDOs की संख्या प्रदर्शित करता है। प्रत्येक डेटा बिंदु माध्य गणना का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि को दर्शाती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पीडीओ के भीतर सेल प्रसार दर। (ए) जीपीएपी पॉजिटिव कोशिकाओं (हरा), Ki67 पॉजिटिव कोशिकाओं (लाल), और डीएपीआई (नीला) के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों (एन = 3) रोगियों 3, 4 और 5 (तालिका 1) से पीडीओ में। सभी पीडीओ को हेलिकॉप्टर (सी) और मैनुअल (एम) विधियों का उपयोग करके संसाधित किया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (बी) जीएफएपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की सापेक्ष संख्या के संबंध में दो तरीकों की तुलना, (सी) कि67-पॉजिटिव कोशिकाएं, और (डी) कि67/जीएफएपी-डबल पॉजिटिव सेल। महत्वपूर्ण परिणाम "एनएस" द्वारा इंगित नहीं किए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: पीडीओ के भीतर एपोप्टोसिस दर। (ए) जीपीएपी पॉजिटिव कोशिकाओं (हरा), सीसी 3 पॉजिटिव कोशिकाओं (लाल), और डीएपीआई (नीला) के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां (एन = 3) पीडीओ में रोगियों 3, 4 और 5 (तालिका 1) से पीडीओ में। सभी पीडीओ को हेलिकॉप्टर (सी) और मैनुअल (एम) विधियों का उपयोग करके संसाधित किया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (बी) जीएफएपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की सापेक्ष संख्या के संबंध में दो तरीकों की तुलना, (सी) सीसी 3-पॉजिटिव कोशिकाएं, और (डी) सीसी 3 / जीएफएपी-डबल पॉजिटिव कोशिकाएं। महत्वपूर्ण परिणाम "एनएस" द्वारा इंगित नहीं किए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: मरीजों की विशेषताओं और नैदानिक पैरामीटर। जीबीएम = ग्लियोब्लास्टोमा, आईडीएच-जंगली प्रकार, सीएनएस डब्ल्यूएचओ ग्रेड 4; एलजीजी = निम्न ग्रेड ग्लियोमा; KPS = Karnofsky प्रदर्शन स्कोर; एमजीएमटी = ओ 6-मिथाइलगुआनिन-डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़; IDH1 = आइसोसिट्रेट डिहाइड्रोजनेज 1, IDH2 = आइसोसिट्रेट डिहाइड्रोजनेज 2, ATRX = α-थैलेसीमिया/मानसिक मंदता, X-लिंक्ड जीन; एम = आकृति विज्ञान; सीसी = सेल गिनती; पी = प्रसार; ए = एपोप्टोसिस। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: मध्यम रचनाएँ। H-GPSA = हाइबरनेट A-Glutamax पेंसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन amphotericin B. PDO = रोगी व्युत्पन्न organoids DMEM: Dulbecco के संशोधित ईगल का माध्यम। एनईएए: गैर-आवश्यक अमीनो एसिड। पेन स्ट्रेप: पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3: सेल संस्कृति मॉडल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल की तकनीकों का अवलोकन. कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: पीडीओ के प्रसार धुंधला के व्यक्तिगत चैनल। (ए) डीएपीआई (नीला), (बी) जीएफएपी-पॉजिटिव कोशिकाएं (हरा), (सी) Ki67-पॉजिटिव कोशिकाएं (लाल) और (डी) रोगियों 3, 4 और 5 से पीडीओ में ओवरले चैनल। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: पीडीओ के एपोप्टोसिस धुंधला के व्यक्तिगत चैनल। (ए) डीएपीआई (नीला), (बी) जीएफएपी-पॉजिटिव कोशिकाओं (हरा), (सी) सीसी 3-पॉजिटिव कोशिकाओं (लाल) और (डी) रोगियों 3, 4 और 5 से पीडीओ में ओवरले चैनल। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह अध्ययन पीडीओ उत्पन्न करने के लिए एक त्वरित और कुशल तरीका प्रस्तुत करता है। जीबीएम इलाज के लिए एक चुनौतीपूर्ण ट्यूमर बनी हुई है, अक्सर रिलेप्स और एक उच्च रोगबोझ 3,6 की विशेषता है। अभिनव चिकित्सीय दृष्टिकोण की तत्काल आवश्यकता है, क्योंकि इन विट्रो में देखे गए आशाजनक परिणाम अक्सर चरण- I परीक्षणों के दौरान विवो में प्रभावकारिता प्रदर्शित करने में विफल होते हैं। इस विसंगति के कारणों में से एक रोगी व्युत्पन्न अमर सेल लाइनों की सीमित क्षमता हो सकती है, जो मोनोलेयर संस्कृतियों में उगाई जाती है, जटिल सेल-सेल इंटरैक्शन और माता-पिता के ट्यूमर के आनुवंशिक गुणों को प्रतिबिंबित करने के लिए। जीबीएम 8,9 की उच्च अंतर- और इंट्राट्यूमरल विविधता को देखते हुए, व्यक्तिगत लक्षित उपचारों को प्राथमिकता दी जाती है और भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए वादा कर सकते हैं। 2 डी पक्षपाती सेल लाइनों के विपरीत, organoids माता पिता के ऊतकों21 के गुणों को बनाए रखने की क्षमता है, अभी तक ट्यूमर और सामान्य मस्तिष्क के बीच जटिल सेल सेल बातचीत सर्वोपरि महत्व के हैं और संभावित रूप से इस मॉडल द्वारा अनदेखी की जा सकती है. हालांकि, पीडीओ की मैनुअल पीढ़ी एक समय लेने वाली प्रक्रिया है, और काटने के दौरान स्केलपेल के साथ निचोड़ने के कारण ऊतक क्षति सफल पीडीओ विकास में बाधा डाल सकती है। इसलिए, कम समय और प्रयास के साथ पीडीओ की अधिक संख्या उत्पन्न करने के लिए एक ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग करके एक स्वचालित विधि को अनुकूलित किया गया था। इसके अतिरिक्त, हमने प्रदर्शित किया कि समग्र प्रसार और एपोप्टोसिस दर दो दृष्टिकोणों के बीच भिन्न नहीं थी।

सी दृष्टिकोण सीधा, लागू करने में आसान है, और पीडीओ (चित्रा 3) की एक बड़ी संख्या की पीढ़ी को सक्षम बनाता है। चॉपिंग के दूसरे और तीसरे दौर के बीच ऊतक के रोटेशन को प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में पहचाना गया था। इस स्तर पर, ऊतक पहले से ही अपनी अखंडता खो चुका है और आसानी से अलग हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बड़े टुकड़े होते हैं जिन्हें माइक्रोस्कोप के नीचे अतिरिक्त काटने या मैनुअल विच्छेदन की आवश्यकता होती है। जबकि स्वचालित हेलिकॉप्टर दृष्टिकोण अधिक सटीकता के साथ एक पूर्व निर्धारित काटने के आकार के लिए अनुमति देता है, मैनुअल दृष्टिकोण पीडीओ के आकार का निर्धारण करने में सटीकता का अभाव है, असमान आकार और आकार पीडीओ, जो तुलनात्मक दवा स्क्रीनिंग (चित्रा 2) के लिए एक नुकसान है करने के लिए अग्रणी. बहरहाल, प्रस्तावित विधि के साथ, पीडीओ प्रति सेल नंबरों का मानकीकरण हासिल नहीं किया जाता है, संभावित रूप से मानकीकृत दवा स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के लिए एक खामी पेश करता है। विभिन्न ऑर्गेनॉइड पीढ़ी तकनीकों के फायदे और नुकसान 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42 और उनके आवेदनों को तालिका 3 में संक्षेपित किया गया है।

जीबीएम ऊतक स्थिरता में भिन्न हो सकते हैं, कठिन (घुसपैठ क्षेत्र) से लेकर नरम (नेक्रोटिक कोर) तक, जो स्वचालित हेलिकॉप्टर दृष्टिकोण के लिए चुनौतियां पैदा कर सकते हैं। यदि ऊतक बहुत सख्त है, तो हेलिकॉप्टर निचोड़ सकता है और इसे नुकसान पहुंचा सकता है, जबकि बहुत नरम ऊतक को कुचल दिया जा सकता है। चुने हुए ऊतक ने विशिष्ट विशेषताओं को प्रदर्शित किया, जिसमें दृढ़ता का एक मध्यवर्ती स्तर शामिल है, छिटपुट रूप से भूरे या पीले रंग के मलिनकिरण को प्रकट करने के बजाय गुलाबी-भूरे रंग के रंग की विशेषता है। एक स्पंजी और आसानी से crumbly बनावट रखने ऊतक agarose ब्लॉकों के भीतर बेहतर संरक्षण का प्रदर्शन किया, जबकि अत्यधिक नाजुक और तरलीकृत ट्यूमर ऊतक नमूना प्रक्रिया से छोड़ दिया गया था. हालांकि, हेलिकॉप्टर दृष्टिकोण ने मैनुअल दृष्टिकोण की तुलना में पीडीओ की अधिक संख्या की सफल पीढ़ी को सक्षम किया, यहां तक कि उप-इष्टतम स्थिरता के ऊतक के साथ भी। मुख्य समाधान ट्यूमर के विभिन्न क्षेत्रों से ऊतक को संसाधित करने के लिए ट्यूमर लकीर करने वाले सर्जन के साथ घनिष्ठ संपर्क बनाए रखना है। सबॉप्टिमल ऊतक स्थिरता के मामलों में, माइक्रोस्कोप के तहत ऊतक को मैन्युअल रूप से फिर से काम करना काटने के बाद एक सहायक जोड़ था। विषमता के लिए खाते में, ट्यूमर ऊतक को शुरू में छह खंडों में विभाजित किया गया था, प्रत्येक बाद में सी या एम दृष्टिकोण के लिए आधा हो गया था। इन छह अलग-अलग वर्गों के भीतर, विविधता की एक बड़ी डिग्री का अनुमान है। इसके अलावा, एक ही खंड या अच्छी तरह से पीडीओ के भीतर भी, अलग-अलग उप-जनसंख्या की उपस्थिति प्रशंसनीय है।

अवधारणा के प्रमाण के रूप में, प्रसार और एपोप्टोसिस डेटा जीबीएम के साथ दो रोगियों और एलजीजी के साथ एक रोगी से रिपोर्ट किया गया था, जो दो तरीकों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाते हैं। पीडीओ की पीढ़ी अत्यधिक घातक मस्तिष्क ट्यूमर तक सीमित नहीं है, बल्कि एलजीजी पर भी लागू की जा सकती है। यह अध्ययन इस बात पर प्रकाश डालता है कि एलजीजी शायद ही कभी 2 डी संस्कृति में वृद्धि का प्रदर्शन करता है, जिससे उनके अध्ययन के लिए एक सटीक मॉडल का विकास अत्यधिक मूल्यवान हो जाता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य जीबीएम के साथ-साथ एलजीजी से पीडीओ उत्पन्न करने में इस दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा को जल्दी और प्रभावी ढंग से प्रदर्शित करना है।

कुल मिलाकर, पीडीओ का उपयोग भविष्य में घातक मस्तिष्क ट्यूमर में लक्षित उपचारों के रोगी-उन्मुख पूर्व-चिकित्सीय परीक्षण के लिए किया जा सकता है। व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग के लिए एक त्वरित और कुशल तरीका प्रदान करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ट्यूमर की प्रगति तेजी से होती है, और बचाव उपचार के विकल्पों की सख्त जरूरत होती है। अगले चरण के रूप में, पीडीओ मॉडल का मूल्यांकन वास्तविक उपचार प्रतिक्रियाओं की बेहतर नकल करने के लिए विभिन्न इम्यूनोथेरेप्यूटिक दृष्टिकोणों के साथ किया जा सकता है। भविष्य में, पीडीओ का उपयोग नैदानिक सेटिंग में उपचारों की आगे की खोज और मूल्यांकन की आवश्यकता के बारे में परिष्कृत निष्कर्ष निकालने के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर ऑफ क्लिनिकल रिसर्च (IZKF, B-450) वुर्जबर्ग, बवेरियन सेंटर ऑफ कैंसर रिसर्च (BZKF) और वुर्जबर्ग विश्वविद्यालय के ओपन एक्सेस पब्लिशिंग फंड द्वारा समर्थित प्रकाशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम तकनीकी सहायता के लिए डागमार हेमेरिच और सिग्लिंडे कुहनेल, दोनों सेक्शन एक्सपेरिमेंटल न्यूरोसर्जरी, न्यूरोसर्जरी विभाग, यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल वुर्जबर्ग को धन्यवाद देना चाहते हैं। चित्रा 1 www.biorender.com का उपयोग कर बनाया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol (1000x) Gibco 21985023
30% formaldehyde methanol-free Carl Roth 4235.1 Used in 4% concentration
70% ethanol solution For sterilisation 
Agarose tablets 0.5 g Carl Roth HP67.7
Amphotericin B 250 µg/mL Gibco 15290018
Anatomical forceps  Hartstein  N/A
Anatomical spatula  Hartstein  N/A
B-27 Supplement without vitamin A (50x) Gibco 12587010
Biopsy cassette with cover Resolab 37001-b
Blades for McIlwain Tissue Chopper Campden instruments Model TC752-1
CC3 antibody (Asp 175) Cells signaling technology 9661
Disposable scalpel  Feather  0200130015
Distilled water Gibco 15230089 To dilute the formaldehyd
Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) Gibco 11330032 Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma Life Sciences D8537-500ML Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer Invitrogen 433357
Falcon tube 50 ml Cellstar Greiner Bio-One 227261
GFAP antibody Santa Cruz Biotechnology sc33673
Glass beaker  N/A  N/A
Glass petri dish N/A N/A
GlutaMAX (100x) Gibco 35050061
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo scientific 51032875
Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet Thermo scientific 5016643
Hibernate-A Gibco A1247501
Histoacryl glue B. Braun surgical 1050052
Human Insulin, Solution Santa Cruz Biotechnology sc-360248
Ice box  N/A  N/A
Ki67 antibody Abcam ab16667
McIlwain Tissue Chopper Cavey Laboratory Engineering 51350V
Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B Leica DMI6000B For brightfield and immunofluorescence pictures
Microscope stereozoom S9D Leica W841832 For manual cutting and to organoids monitoring
Microwave Bosch N/A To heat the agarose solution
Mounting plastic discs Cavey Laboratory Engineering 51354
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) Gibco 11140050
Neurobasal (1x) Gibco 21103049
Orbital shaking machine Rotamax120 Heidolph 10304491
Penicilin Streptomycin Gibco 15140122
Plastic petri dishes Cellstar greiner bio-one 628160 n = 12
Single channel pipette 1000 µm Eppendorf 4924000010
Single channel pipette 5000 µm Eppendorf EP3123000276
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 IBM
Surgipath Paraplast Leica 39601006 Embedding medium
Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate Thermo Scientific 174932

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एक ऊतक चॉपर का उपयोग करके पूर्व विवो रोगी-व्युत्पन्न ग्लियोमा ऑर्गेनोइड की खेती करना
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Alsalkini, M., Cibulková, V., Breun, M., Kessler, A. F., Schulz, T., Cattaneo, A., Wipplinger, C., Hübner, J., Ernestus, R. I., Nerreter, T., Monoranu, C. M., Hagemann, C., Löhr, M., Nickl, V. Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper. J. Vis. Exp. (203), e65952, doi:10.3791/65952 (2024).

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