Summary
この研究では、組織チョッパーを利用して患者由来の膠芽腫の3次元オルガノイドを自動的に生成する方法を紹介します。この方法は、治療試験のためにそのようなオルガノイドを得るための適切かつ効果的なアプローチを提供する。
Abstract
神経膠芽腫、IDH野生型、CNS WHOグレード4(GBM)は、積極的な治療にもかかわらず患者の生存率が低いことに関連する原発性脳腫瘍です。現実的な ex vivo モデルの開発は依然として困難である。患者由来の3次元オルガノイド(PDO)モデルは、元の腫瘍の主要な特徴を維持しながら、GBMの表現型および分子の不均一性を捉える革新的なプラットフォームを提供します。しかし、PDO生成のための手作業による解剖は、時間と費用がかかり、不規則で不均一なサイズのPDOが多数生成される可能性があります。この研究は、自動組織チョッパーを使用したPDO生産の革新的な方法を提示します。4人のGBM患者と1人の星状細胞腫、IDH変異体、CNS WHOグレード2の患者からの腫瘍サンプルを、組織チョッパーを使用して手動で処理しました。手動アプローチでは、顕微鏡制御下でメスを使用して腫瘍物質を解剖し、組織チョッパーを3つの異なる角度で使用しました。37°Cの軌道振とう機で培養した後、明視野顕微鏡を用いて形態学的変化を評価し、6週間後の増殖(Ki67)およびアポトーシス(CC3)を免疫蛍光法で評価した。組織チョッパー法は、製造時間を約70%短縮し、2週目以降の手作業で処理した組織と比較して、PDOの平均数が有意に増加しました(2週目:801 vs. 601、 P = 0.018、3週目:1105 vs. 771、 P = 0.032、および4:1195 vs. 784、 P < 0.01)。品質評価により、両方の製造方法で腫瘍細胞のアポトーシスと増殖の速度が類似していることが明らかになりました。したがって、自動組織チョッパー法は、時間とPDO収量の点でより効率的なアプローチを提供します。この方法は、膠芽腫患者の薬物療法または免疫療法のスクリーニングに有望です。
Introduction
低悪性度神経膠腫(LGG)は、比較的まれな脳腫瘍のグループであり、通常、神経膠芽腫などの高悪性度神経膠腫と比較して、成長が遅く、攻撃性が低いものとして現れます。それらは大人と子供の両方に発生する可能性があり、成人の有病率はわずかに高くなります。正確な有病率は地域や人口によって異なりますが、LGGはすべての原発性脳腫瘍の約15%〜20%を占めています1。LGGの治療戦略は、手術、放射線療法、化学療法の組み合わせを伴うことが多く、神経機能を維持しながら腫瘍切除を最大化することを目的としています。LGGの管理は複雑になる場合があり、治療法の選択は腫瘍の位置や分子特性などの要因に依存する可能性があります2。LGGの遺伝的および分子的基盤の理解の進歩により、より標的を絞った治療法が開発され、治療アプローチの改良が続けられています。
一方、神経膠芽腫、IDH野生型、CNS WHOグレード4(GBM)は、成人に見られる最も一般的な原発性脳腫瘍であり、発生率は100,000人年あたり3.19〜4.17例です3。膠芽腫は、頭痛、発作、限局性神経障害、人格の変化、頭蓋内圧の上昇などの症状を引き起こします。膠芽腫の標準治療では、可能であれば腫瘍の減量を行い、その後、テモゾロミド4と併用した放射線療法を行う。さらに、テモゾロミドとロムスチンの併用は、O6-メチルグアニン-メチルトランスフェラーゼ(MGMT)-プロモーターメチル化5を有する患者の全生存率中央値を高める可能性がある。しかし、これらの最近の治療アプローチにもかかわらず、膠芽腫は依然として予後不良の不治の病であり、腫瘍治療野(TTフィールド)を追加すると、患者の全生存期間の中央値は16か月から20.9か月です3,6。膠芽腫ではいくつかの免疫療法アプローチが研究されていますが、in vivoでは限られた有効性が実証されています。さらに、臨床的および前臨床的な限界は、治療のブレークスルーを妨げます7。適切で現実的なex vivoモデルの確立は、GBMの8間および腫瘍内9の不均一性のために困難でした。
従来の2次元(2D)患者細胞株は、均質な細胞集団を表し、ハイスループットの薬物スクリーニングに適しています。しかし、患者由来および不死化細胞株は、増殖条件の違い、および複数の継代後の遺伝子型および表現型の特徴の逸脱により、GBMを適切に模倣することができません10,11,12。
一方、3Dオルガノイドモデルは、臓器やさまざまながんの表現型と分子の不均一性を再現する有望なシステムとして最近浮上しています13、14、15、16、17、18。膠芽腫の文脈では、大脳オルガノイドは、腫瘍様の特徴をシミュレートするように遺伝子組み換えされているか16,17、または腫瘍細胞浸潤を誘導するためにGSCまたはスフェロイドと共培養されています18,19。マトリゲルとEGF/bFGFで培養した患者由来のGBMオルガノイドは、幹細胞の不均一性や低酸素症などのGBMの特徴を示すが20、このモデルが患者の新生物の主要な分子特性をどの程度表すことができるかは不明のままである。
患者由来のGBMオルガノイド(PDO)は、組織学的特徴、細胞の多様性、遺伝子発現、および突然変異プロファイルなど、類似の親腫瘍の優勢な特徴を維持できる有望なモデルである。さらに、成体のげっ歯類の脳に移植されると急速に浸潤し、薬物検査と個別化治療の現実的なモデルを提供します21。しかし、腫瘍組織を手作業で解剖してPDOを生成するには、時間とコストがかかります。そのため、PDOを大量に生成し、さまざまな治療アプローチを包括的に評価できる迅速な方法が急務であり、個別化薬物試験が期待されています。この研究では、自動組織チョッパーを使用して、新たに切除された腫瘍組織から直接PDOを製造する新しい方法について説明します。さらに、この方法で生成されたPDOを、PDO数、形態学的特徴、アポトーシスおよび腫瘍細胞の増殖の観点から、同じ患者から手動で解剖したPDOと比較した。
Protocol
すべての患者は、ヘルシンキの宣言に従い、ヴュルツブルク大学の治験審査委員会(#22 / 20-me)によって承認された書面によるインフォームドコンセントを行った後、ドイツのヴュルツブルク大学病院の脳神経外科で治療されました。4人のGBM患者と1人の星状細胞腫、IDH変異体、CNS WHOグレード2の患者(低悪性度神経膠腫、LGG)(表1)から腫瘍組織材料を手術から入手し、以下のプロトコルを使用して処理した。組織チョッパーを用いてPDOを生成する自動工程をチョッパー(C)と呼び、顕微鏡制御下で2本のメスで組織を手作業で切断する工程を手動(M)と呼ぶ。6つの等しい大きさの切片(1〜2cm3)を腫瘍サンプルから解剖し、次いでそれぞれを半分に切断し、2つの方法を用いて均質に処理した。前述の腫瘍内不均一性のため、各アプローチに対して1枚の6ウェルプレートを各患者から作製し、各ウェルは元の腫瘍内の異なる部位由来のPDOを表した。どちらの手順も層流キャビネットの下で行われ、使用されたすべての器具は使用前に滅菌されました。このアプローチの概要を 図 1 に示します。
1. アガロースブロックの調製(Cアプローチのみ、オプション)
- 50 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をビーカーに充填し、アガロース1錠( 材料表を参照)を加え、懸濁するまでよく混合します。
- 沸騰を避けながら、混合物を電子レンジで30〜40秒間加熱します。次に、混合物を47°Cに達するまで冷却します。
- アガロース混合物を密閉されたシリンダー状の鋳造型に注ぎ、気泡の形成を避けます。凍結(-20°C)クランプを使用するか、ドライアイス上に30分間置いて、キャストをすぐに冷却します。
2.腫瘍物質の処理
- 手術室から検査室に向かう途中で腫瘍物質を冷却するために、氷の箱を準備します。
- 腫瘍組織(4〜5cm³)を、腫瘍を覆う25 mLのHibernate A( 材料表を参照)を含む滅菌50 mLチューブに移し、チューブをアイスボックスに入れます。
- 層流キャビネットの下で、腫瘍物質をHibernate Aと一緒に滅菌したガラスペトリ皿に移します。
- 壊死組織を除去し、顕微鏡制御下でメスと組織鉗子を使用して血管を慎重に解剖します。出血による茶色がかった色合いを示す出血領域、または隣接する生組織と比較して淡いまたは白色の外観を示す組織によって壊死組織を特定します。組織を圧迫したり破壊したりしないように注意してください。
- 腫瘍材料を約1〜2 cm3のサイズで6つに切ります。3 mLのH-GPSA培地(表2)を事前に充填したプラスチック製のペトリ皿(n = 6)に、それぞれ22個を分配します。ペトリ皿を氷の上に置きます。
3.ティッシュチョッパーのセットアップ
- メーカーのマニュアル23の説明に従ってブレードを配置します。
- スライスの厚さを0.45〜0.50mmに調整します。ブレードの力を中程度に設定します。テーブルリリースノブを「スタート」モードに固定します。
4. 腫瘍組織片の処理
- チョッパーによる腫瘍組織の処理(C法)
- アガロースブロックを長さ2cmの円筒に切り、ヒストアクリル接着剤を使用して、これらの円柱の1つをチョッパーの円形プラスチック皿に接着します( 材料表を参照)。
- メスを使用してアガロースシリンダーに深化を作成し、次に、最初のウェル(ステップ2.5)から腫瘍組織をこのピット内に収めます。
注意: 腫瘍材料は慎重に取り扱われ、隙間に押し込まれたり押し込まれたりしないでください。ギャップは、腫瘍に簡単にフィットするのに十分な大きさであるべきですが、切断プロセス中に腫瘍材料を安定させるのに十分な大きさである必要があります。ステップ 4.1.1.および 4.1.2.はオプションです。 - プラスチックディスクをカッティングテーブルの取り付けディスクに配置します( 材料表を参照)。
- チョッパーのスイッチ を入れ 、 リセット ボタンを押します。これで、チョッパーが切断を開始します(第1ラウンド)。テーブルが端に達すると、機械は自動的に停止し、アガロースと腫瘍組織の両方が所望の直径に切断されます。
- 取り付けディスクを90°回転させてから、リリーステーブルノブを開始モードに調整します。
- リセットボタンを押して、機械に組織を再度切断させ、長方形の組織を作成します(2回目のラウンド)。
- 処理された材料でプラスチックディスクを取り外し、組織スパチュラを使用して腫瘍組織のみを慎重に90°回転させます。
- プラスチックディスクをカッティングテーブルに置き、リリーステーブルノブを開始モードに調整し、 リセット ボタンを押して最終カッティングラウンド(第3ラウンド)を行います。
- チョッパー の電源を切り 、プラスチックディスクを取り外します。チョッパーとブレードを清掃します。
- 5 mLのシングルチャンネルピペットを使用して、処理した材料を培地とともにピペットに吸引し、懸濁液をディッシュに戻します。
- 前の手順を2〜3回繰り返して、組織を適切に分離します。
- ペトリ皿を氷の上に戻し、各腫瘍の他の5皿で手順(4.1.1-4.1.12.)を繰り返します。
- 腫瘍組織を手作業で処理する(M法)
- 腫瘍組織を最初のプラスチック製ペトリ皿(ステップ2.5)から3mLのH-GPSA培地(表2)とともにガラス製シャーレに移します。顕微鏡下で、2つのメスを使用してセグメントを0.5mmのセクションに手動で解剖します。
- 解剖した組織を2 mLピペットを使用してプラスチック製のペトリ皿に戻します。
- 他の5つのペトリ皿の腫瘍切片について、手順(4.2.1.-4.2.3.)を繰り返します(ステップ2.5)。
5.腫瘍組織の洗浄
- 各ペトリ皿を45°に上向きに傾け、腫瘍の塊が皿の底に沈むまで30秒待ちます。
- 1 mLのピペットを使用して、2.5 mLのH-GPSA培地(表2)を慎重に吸引し、腫瘍組織を取り込まないように注意してください。
- 各サンプルに 2 mL の RBC 溶解バッファー( 材料表を参照)を添加します。処理された腫瘍片は、溶解緩衝液で完全に覆われている必要があります。
- 6枚の皿を実験室の軌道振とう機に低速で10分間置きます。
- 2 mLの溶解緩衝液を、腫瘍組織を吸い込まないように注意深く吸引します。
- 毎回、溶解緩衝液の代わりに2 mLのH-GPSA培地(表2)を使用して、前の洗浄ステップ(ステップ5.1〜5.5)を2回繰り返します。
6. 腫瘍組織の培養
- 各ディッシュからH-GPSA培地(表2)を吸引し、4 mLのPDO培地(表2)と交換します。
- 各ディッシュの組織塊を、超低アタッチメント6ウェルプレートのそれぞれのウェルに移します( 材料表を参照)。
- プレートをインキュベーター内のオービタルシェーカーに置き、37°C、5%CO2 、150rpmで2〜4週間インキュベートします。
- 各ウェルから 2 mL の培地を吸引し、37 °C に予熱した 2 mL の新鮮な PDO 培地(表 2)と交換することにより、2 日ごとに半培地交換を行います。
- 顕微鏡で組織を観察し(形態、成長、ミディアムカラー)、成長するPDO(>0.7 mm)または接着組織を切断して、組織の低酸素状態を防ぎます。
- これを行うには、PDOを超低アタッチメントウェルから滅菌ガラスシャーレに移し、メスを使用して切断します。あるいは、接着性PDOは、1 mLのピペットで吸引することで分解できます。PDOを絞らないように注意し、優しく取り扱ってください。
- PDOを2日ごとにカウントしてPDOの形成を評価し、目的の円形の形態を徹底的にチェックします(図2)。
7. PDOの固定と埋め込み
- 各患者の各ウェルから 2 つの PDO を 4% ホルマリンで 6 週間培養後 24 時間固定します。
- 固定したPDOを中性緩衝液(リン酸ナトリウム)ホルマリンに埋め込むまで浸します。
- 各PDOをカセット( 材料表を参照)に入れて、さらに処理します。
- 以下の注に記載されているように、カセットを次の溶液に浸して脱水プロセスを開始します。
注:50%エタノールで20分、70%エタノールで20分、80%エタノールで20分、96%エタノールで20分、100%エタノールで20分、100%エタノールで30分、100%エタノール+クロロホルム(1:1の比率で30分)、100%エタノール+クロロホルム(1:1の比率で30分)、 無水クロロホルムで30分、 パラフィンを30分間、パラフィンをSTP120を使用して30分間。 - 脱水したPDOを58〜60°Cのパラフィンワックスに埋め込みます。
- 埋め込まれたPDOを2.5μmの厚さにスライスし、スライドに取り付けて染色します。
8. 免疫蛍光染色
- 6週間の培養後にPDOを取り付けます。
- 続いて、グリア線維性酸性蛋白質(GFAP、希釈率:1:100)および増殖マーカーKi67(希釈率:1:1000)( 資料表参照)に対して二重染色を行う(既報22)。
- 同様に、GFAPおよび抗カスパーゼ-3(CC3、希釈率:1:400)に対するPDOの二重染色により、アポトーシスを評価します( 材料表を参照)。
- 蛍光顕微鏡を使用して40倍の倍率でPDOの画像を撮影します。
- GFAP、Ki67、CC3陽性細胞、GFAP/Ki67およびGFAP/CC3二重陽性細胞の画像を解析します。
- 画像解析にはオープンソースのFiji(ImageJ-win 32)を活用。
9. 評価とデータ分析
- 培養の最初の1週間は、標準設定と5倍の倍率で毎日顕微鏡の明視野写真を撮影します。
- 形態学的変化を観察し、手動処理と自動処理の両方のアプローチで成熟プロセスを追跡します。
- 顕微鏡を標準明視野モード設定で使用して形態学的解析を行います。
- 5 人の患者全員の PDO で培養の最初の 4 週間の PDO 数と形態を評価します。
- 各患者から各PDOカウントの3つの読み取り値を取得して、平均と平均の標準誤差(SEM)を計算します。
- 3人の患者のPDOの増殖とアポトーシスを調査します。
- 市販の統計ソフトウェアパッケージ( 材料表を参照)を使用してデータを分析します。
- Students-T検定とMann-Whitney U検定を適用して、PDO数、増殖、およびアポトーシスの観点から、手動と自動のPDO生成の違いを判断します。
Representative Results
膠芽腫の4人の患者とLGGの1人の患者は、経験豊富な神経病理学者(CMM)による病理学的確認の後、含まれました。大多数の患者は非メチル化MGMTプロモーターを有し、すべてのGBM患者はIDH1およびIDH2野生型であった(表1)。平均して、製造プロセスは C アプローチで 88.8 分 (+/- 6.3 分)、M アプローチで 322 分 (+/- 17.2 分) 続きました。4週間の培養後、全体的な成功率は手動アプローチで87%、チョッパーアプローチで93%でした(n = 5)。さらに、C群由来のPDOは1週間以内に所望の丸みを帯びた形状に達し、 in vitro 実験で使用できるほど成熟していましたが、M群のPDOはほとんどが鋭利で未定義のままでした(図2)。Cアプローチで処理された腫瘍組織は、培養の最初の週後に全体で281のPDO(患者あたりの平均= 56 +/- 43)をもたらし、Mアプローチで250のPDO(患者あたりの平均= 50 +/- 41)が発現しました。培養の2週目に、5人の患者すべての組織は、Cアプローチで生成されたときにより高いPDO値をもたらしました(801;患者あたりの平均= 130 +/- 38)とMアプローチ(601;患者あたりの平均= 76 +/- 44; P = 0.018)です。培養の3週目に、Cアプローチでは全患者から全体で1105個のPDO(患者あたりの平均= 221 +/- 32)が蓄積されたのに対し、Mアプローチでは771個のPDO(患者あたりの平均= 155 +/- 34)(P = 0.032)が蓄積されました。さらに、Cアプローチで生成した場合、4週間の培養後に合計1195個のPDO(患者あたりの平均= 239 +/- 50)が形成されたのに対し、Mアプローチ(P < 0.01)では784個(患者あたりの平均= 157 +/- 36)が形成されました。したがって、C法は2週目以降、PDO数が有意に多くなりました(図3)。さらに、PDO数の相対的な変動を評価して、連続する週間の動的傾向を調査しました。この分析では、Cアプローチの1週目から2週目への移行期(265%)にPDO数が目覚ましい急増を示しており、これは急速な進歩を示しています。その後、3週目は一時的な調整を反映して、カウントの増加が鈍化しました(75%)。対照的に、MアプローチではPDO数が一貫して着実に増加し(2週目は92%、3週目は67%)、4週目のPDO数の著しい安定に貢献しました。PDO数のこの一貫した増加傾向は、観察期間を通じてCアプローチの信頼性と回復力を強調しています。
PDO内のアストロサイト数(GFAP)、PDO細胞増殖(Ki67)、およびアポトーシス(CC3)の分析のために、2人のGBM患者と1人のLGG患者を組み入れました。測定されたアストロサイト数は、Cアプローチで平均43%、Mアプローチで45%と、2つの処理方法の間に有意差を示さなかった(図4 および 図5、 補足図1 および 補足図2)。同様に、PDO内の増殖率は、Cアプローチ(3%)とMアプローチ(1%)で同等でした。患者 5 から C アプローチで生成された PDO のみが、M アプローチの 1% と比較して 26% の増殖率を示しました (P = 0.001; 図4C)。Cアプローチで処理されたPDOでは全体的に低いアポトーシス率(3%)が検出されたのに対し、Mアプローチでは2%でした(全患者)。さらに、アポトーシスを起こすアストロサイトの数に関して、2つの方法の間に有意差はありませんでした(図5D)。
図1:自動チョッパーと手動アプローチを使用した患者由来オルガノイド(PDO)製造プロセスのグラフィカルな概要。 この図は、(A)サンプル採取、(B)腫瘍物質の解剖、(C)洗浄、(D)インキュベーションなど、関連するさまざまなステップを示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:培養開始1週間のPDO形態。 自動チョッパーと手動法の両方を使用した解剖後のPDO形成の比較。スケールバー = 1000 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:培養の最初の4週間のPDO数。 x 軸は週単位の時間 (W) を表示し、y 軸は C (青) と M (赤) アプローチ (n = 5) の PDO の数を示します。各データポイントは平均度数を表し、エラーバーは平均の標準誤差を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:PDO内の細胞増殖率。 (A)患者3、4、5のPDOにおけるGFAP陽性細胞(緑)、Ki67陽性細胞(赤)、およびDAPI(青)の代表的な免疫蛍光画像(n = 3)。すべてのPDOは、チョッパー(C)および手動(M)の方法を使用して処理されました。スケールバー = 100 μm。 (B)GFAP陽性細胞の相対数に関する2つの方法の比較、(C)Ki67陽性細胞、および(D)Ki67/GFAP二重陽性細胞。有意な結果は「ns」で示されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:PDO内のアポトーシス率。 (A)患者3、4、5のPDOにおけるGFAP陽性細胞(緑)、CC3陽性細胞(赤)、DAPI(青)の代表的な免疫蛍光画像(n = 3)。すべてのPDOは、チョッパー(C)および手動(M)の方法を使用して処理されました。スケールバー = 100 μm。 (B)GFAP陽性細胞の相対数に関する2つの方法の比較、(C)CC3陽性細胞、および(D)CC3/GFAP二重陽性細胞。有意な結果は「ns」で示されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:患者の特徴と臨床パラメータ。 GBM = 神経膠芽腫、IDH野生型、CNS WHOグレード4;LGG = 低悪性度神経膠腫;KPS = Karnofsky パフォーマンス スコア;MGMT =O 6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ;IDH1 = イソクエン酸デヒドロゲナーゼ 1、IDH2 = イソクエン酸デヒドロゲナーゼ 2、ATRX = αサラセミア/精神遅滞、X 連鎖遺伝子;M =形態学;CC = 細胞数;p =増殖;A =アポトーシス。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:中程度の組成。 H-GPSA = Hibernate A-Glutamax Pencillin Streptomycin amphotericin B. PDO = 患者由来オルガノイド DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium.NEAA:非必須アミノ酸。ペン性連鎖球菌:ペニシリン/ストレプトマイシン この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:細胞培養モデルを生成するために使用される技術の概要。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:PDOの増殖染色の個々のチャネル。 (A)患者3、4、5のPDOにおけるDAPI(青)、(B)GFAP陽性細胞(緑)、(C)Ki67陽性細胞(赤)、(D)オーバーレイチャネル。スケールバー = 100 μm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:PDOのアポトーシス染色の個々のチャネル。 (A)患者3、4、5のPDOにおけるDAPI(青)、(B)GFAP陽性細胞(緑)、(C)CC3陽性細胞(赤)、(D)オーバーレイチャネル。スケールバー = 100 μm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
この研究は、PDOを生成するための迅速かつ効率的な方法を提示します。膠芽腫は依然として治療が困難な腫瘍であり、しばしば再発と高い疾患負担を特徴としています3,6。in vitroで観察された有望な結果が、第I相試験ではin vivoで有効性を実証できないことが多いため、革新的な治療アプローチが緊急に必要とされています。この不一致の理由の1つは、単層培養で増殖した患者由来の不死化細胞株が、親腫瘍の複雑な細胞間相互作用および遺伝的特性を反映する能力が限られていることである可能性がある。GBM 8,9の腫瘍間および腫瘍内の不均一性が高いことを考えると、個別化された標的療法が好まれ、将来の用途に有望である可能性があります。2D接着細胞株とは対照的に、オルガノイドは親組織の特性を保持する能力を有する21が、腫瘍と正常な脳との間の複雑な細胞間相互作用が最も重要であり、このモデルでは見落とされる可能性がある。しかし、PDOを手作業で生成するのは時間のかかるプロセスであり、切断中にメスで絞ることによって引き起こされる組織の損傷は、PDOの成長をうまく妨げる可能性があります。そこで、組織チョッパーを使用して自動化された方法を最適化し、時間と労力を抑えてより多くのPDOを生成しました。さらに、全体的な増殖率とアポトーシス率が2つのアプローチ間で差ないことを示しました。
Cアプローチは単純で実装が容易で、より多くのPDOを生成できます(図3)。2回目と3回目のチョッピングの間の組織の回転は、プロトコルの重要なステップとして特定されました。この段階では、組織はすでに完全性を失っており、簡単にバラバラになり、その結果、顕微鏡下で追加の切断または手動解剖を必要とする大きな破片になる可能性があります。自動チョッパー法では、あらかじめ設定された切断サイズをより正確に行うことができますが、手動法ではPDOのサイズを決定する精度が低く、PDOの形状やサイズが不均一になり、比較薬物スクリーニングの欠点となります(図2)。しかし、提案手法ではPDOごとの細胞数の標準化が達成されておらず、標準化された薬物スクリーニングプロトコルの欠点となる可能性があります。異なるオルガノイド生成技術の長所と短所18、19、20、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、
37、38、39、40、41、42 およびそれらのアプリケーションを 表3にまとめます。
膠芽腫組織は、硬い組織(浸潤ゾーン)から柔らかい組織(壊死コア)まで、粘稠度が異なるため、自動チョッパーアプローチに課題が生じる可能性があります。組織が強すぎると、チョッパーが絞って損傷する可能性があり、柔らかすぎる組織は押しつぶされる可能性があります。選択された組織は、褐色または黄色の変色を呈するのではなく、散発的にピンクがかった灰色がかった色を特徴とする、中間レベルの硬さを含む独特の属性を示しました。海綿状で砕けやすいテクスチャーを有する組織は、アガロースブロック内で優れた保存性を示しましたが、非常に繊細で液化した腫瘍組織はサンプリング手順から除外されました。しかし、チョッパーアプローチでは、最適な一貫性の組織であっても、手動アプローチと比較して、より多くのPDOの生成に成功しました。重要な解決策は、腫瘍切除を行う外科医との緊密な相互作用を維持して、腫瘍のさまざまな領域から組織を処理することです。組織の一貫性が最適でない場合は、チョッピング後に顕微鏡下で組織を手動で作り直すことが役に立ちました。不均一性を考慮するために、腫瘍組織は最初に6つのセグメントに分割され、その後、CまたはMアプローチのいずれかで各セグメントが半分に分割されました。これら 6 つの異なるセクション内では、かなりのレベルの異質性が予想されます。さらに、同じセクションまたは井戸からのPDO内でさえ、異なる亜集団の存在はもっともらしいです。
概念実証として、増殖とアポトーシスのデータは、膠芽腫の患者2人とLGGの患者1人から報告され、2つの方法の間に有意差は見られませんでした。PDOの生成は、悪性度の高い脳腫瘍に限らず、LGGにも適用できます。この研究は、LGGが2D培養で成長を示すことはめったにないことを強調しており、彼らの研究のための正確なモデルの開発は非常に価値があります。このプロトコルは、GBMとLGGからPDOを迅速かつ効果的に生成する上で、このアプローチの汎用性を実証することを目的としています。
全体として、PDOは将来、悪性脳腫瘍における標的療法の患者指向の治療前試験に利用される可能性があります。腫瘍の進行が急速に進行し、救助治療の選択肢が切実に必要とされているため、個別化された薬物スクリーニングのための迅速かつ効率的な方法を提供することは非常に重要です。次のステップとして、PDOモデルをさまざまな免疫療法アプローチで評価し、実際の治療反応をよりよく模倣することができます。将来的には、PDOを利用して、臨床現場での治療法のさらなる探求と評価の必要性に関する高度な結論を導き出すことができます。
Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、学際的臨床研究センター(IZKF、B-450)ヴュルツブルク、バイエルンがん研究センター(BZKF)から資金提供を受け、出版物はヴュルツブルク大学のオープンアクセス出版基金の支援を受けました。技術サポートをしてくれたヴュルツブルク大学病院脳神経外科実験脳神経外科のDagmar Hemmerich氏とSiglinde Kühnel氏に感謝します。図 1 は www.biorender.com を使用して作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
| 30% formaldehyde methanol-free | Carl Roth | 4235.1 | Used in 4% concentration |
| 70% ethanol solution | For sterilisation | ||
| Agarose tablets 0.5 g | Carl Roth | HP67.7 | |
| Amphotericin B 250 µg/mL | Gibco | 15290018 | |
| Anatomical forceps | Hartstein | N/A | |
| Anatomical spatula | Hartstein | N/A | |
| B-27 Supplement without vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | |
| Biopsy cassette with cover | Resolab | 37001-b | |
| Blades for McIlwain Tissue Chopper | Campden instruments | Model TC752-1 | |
| CC3 antibody (Asp 175) | Cells signaling technology | 9661 | |
| Disposable scalpel | Feather | 0200130015 | |
| Distilled water | Gibco | 15230089 | To dilute the formaldehyd |
| Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) | Gibco | 11330032 | Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Sciences | D8537-500ML | Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 433357 | |
| Falcon tube 50 ml Cellstar | Greiner Bio-One | 227261 | |
| GFAP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc33673 | |
| Glass beaker | N/A | N/A | |
| Glass petri dish | N/A | N/A | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050061 | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo scientific | 51032875 | |
| Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet | Thermo scientific | 5016643 | |
| Hibernate-A | Gibco | A1247501 | |
| Histoacryl glue | B. Braun surgical | 1050052 | |
| Human Insulin, Solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-360248 | |
| Ice box | N/A | N/A | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Cavey Laboratory Engineering | 51350V | |
| Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B | Leica | DMI6000B | For brightfield and immunofluorescence pictures |
| Microscope stereozoom S9D | Leica | W841832 | For manual cutting and to organoids monitoring |
| Microwave | Bosch | N/A | To heat the agarose solution |
| Mounting plastic discs | Cavey Laboratory Engineering | 51354 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) | Gibco | 11140050 | |
| Neurobasal (1x) | Gibco | 21103049 | |
| Orbital shaking machine Rotamax120 | Heidolph | 10304491 | |
| Penicilin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic petri dishes Cellstar | greiner bio-one | 628160 | n = 12 |
| Single channel pipette 1000 µm | Eppendorf | 4924000010 | |
| Single channel pipette 5000 µm | Eppendorf | EP3123000276 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 | IBM | ||
| Surgipath Paraplast | Leica | 39601006 | Embedding medium |
| Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate | Thermo Scientific | 174932 |
References
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