Summary
هنا ، نقوم بإنشاء نموذج الفئران لخلل الغدة الدمعية لتوفير أساس لدراسة جفاف العين المائي.
Abstract
جفاف العين المائي (ADDE) هو نوع من أمراض جفاف العين التي يمكن أن تؤدي إلى تقليل كمية ونوعية إفراز الدموع. يمكن أن يؤدي إنتاج الدموع غير الطبيعي لفترات طويلة إلى اضطراب في بيئة سطح العين ، بما في ذلك تلف القرنية والالتهاب. في الحالات الشديدة ، يمكن أن يسبب ADDE فقدان البصر أو حتى العمى. في الوقت الحالي ، يقتصر علاج جفاف العين على قطرات العين أو العلاج الطبيعي ، والذي يمكن أن يخفف فقط من أعراض عدم الراحة في العين ولا يمكنه علاج متلازمة العين الجافة بشكل أساسي. لاستعادة وظيفة الغدة الدمعية في جفاف العين ، أنشأنا نموذجا حيوانيا لخلل الغدة الدمعية في الفئران التي يسببها سكوبولامين. من خلال التقييم الشامل للغدة الدمعية والقرنيات والملتحمة وعوامل أخرى ، نهدف إلى توفير فهم كامل للتغيرات المرضية ل ADDE. بالمقارنة مع نموذج فأر العين الجافة الحالي ، يتضمن نموذج ADDE الحيواني هذا تقييما وظيفيا للغدة الدمعية ، مما يوفر منصة أفضل لدراسة خلل الغدة الدمعية في ADDE.
Introduction
بحلول عام 2021 ، يتأثر ما يقرب من 12٪ من الأشخاص بشكل كبير بجفاف العين1 ، مما يجعله أحد أكثر أمراض العيون المزمنة شيوعا. يمكن تقسيم جفاف العين إلى نوعين: العين الجافة التي تعاني من نقص مائي (ADDE) والعين الجافة التبخيرية (EDE)2 ، اعتمادا على العوامل المختلفة التي تؤثر على المرض. ينقسم ADDE أيضا إلى متلازمة سجوجرن (SS) وغير SS ، ولكن غالبية مرضى جفاف العين هم مرضى غير SS في السريرية3. تؤثر أعراض جفاف العين المزمنة بشكل خطير على الجودة البصرية للمرضى. حاليا ، يتضمن العلاج التقليدي لدائرة التنمية الاقتصادية تطبيق الدموع الاصطناعية لتليين سطح العين والعلاج الطبيعي للجفون. ومع ذلك، قد لا تقدم متلازمة العين الجافة علاجا كاملا في كثير من الحالات. لذلك ، فإن دراسة التسبب في مرض جفاف العين أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات وأدوية جديدة. توفر النماذج الحيوانية لمتلازمة العين الجافة أساسا لمزيد من البحث.
هناك العديد من الطرق لبناء نماذج حيوانية لمتلازمة العين الجافة4 ، بما في ذلك تغيير مستويات إفراز الدموع عن طريق تغيير مستويات الهرمون. على سبيل المثال ، يمكن أن تؤدي إزالة خصيتي الفئران إلى تقليل إفراز الأندروجين ، وزيادة إفراز الدموع ، وتقليل تركيز المكون الإفرازي الحر (SC) و IgA في الدموع 5,6. طريقة أخرى هي الإشارة إلى تفاعلات المناعة الذاتية في الغدة الدمعية عن طريق إزالة أعصاب سطح العين التي تتحكم في الغدة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحقيق الحد المباشر من إفراز الدموع عن طريق إزالة الغدة الدمعية7 جراحيا. يمكن أن تؤدي الظروف البيئية المتغيرة أيضا إلى تسريع تبخر الدموع. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي استزراع في ظروف الرطوبة المنخفضة والتهوية الجافة إلى إنشاء نموذج للعين الجافة التبخيريةالمفرطة 8 ، والتي يمكن دمجها مع طرق أخرى لزيادة شدة جفاف العين. الأدوية الرئيسية المستخدمة للحث على النماذج التجريبية لجفاف العين هي الأتروبين والسكوبولامين9. كمثبطات السمبتاوي ، يمكن لكليهما أن يحفز الحصار الدوائي للمستقبلات الكولينية (المسكارينية) في الغدة الدمعية ويمنع إفراز الدموع. بالمقارنة مع جفاف العين الناجم عن حقن عضلات الأتروبين10 ، فإن سكوبولامين له تأثير مثبط أقوى على غدد الإفراز ، ومدة أطول من عمل الدواء ، وتأثيرات أضعف على عضلات القلب والأمعاء الصغيرة والشعب الهوائية الملساء. إنه أحد أكثر الأدوية نضجا لنماذج الجافة العين.
يمكن استخدام طرق مختلفة للحث على جفاف العين باستخدام سكوبولامين ، مثل الحقن تحت الجلد أو مضخة الدواء أو تطبيقالتصحيح 4،11،12. من أجل تقليل وتيرة إعطاء الدواء لحيوانات التجارب ، يطبق العديد من الباحثين بقع عبر الجلد على ذيول الفئران أو يستخدمون مضخات الدواء. ومع ذلك ، فإن كلتا الطريقتين لهما قيود. على سبيل المثال ، يجب أن يأخذ امتصاص البقع عبر الجلد في الاعتبار الامتصاص الفردي للفئران ، مما قد يؤدي إلى جرعة دواء غير متسقة. على الرغم من أن مضخات الدواء يمكنها التحكم بدقة في جرعة كل إدارة ، إلا أنها لا تتوافق دائما مع الدواء الذي يتم تسليمه أو التركيز المستخدم. كما يجب وضعها جراحيا - وهو أكثر توغلا للحيوان ، ويتطلب حدثا مخدرا ، وهناك احتمال حدوث مضاعفات ما بعد الجراحة مثل التفكك. الحقن تحت الجلد ، على الرغم من أنه أكثر تعقيدا ، يمكن أن يضمن جرعة دقيقة لكل إدارة والحفاظ على الاتساق في إدارة الدواء بين الفئران المختلفة. في الوقت نفسه ، لديها تكلفة أقل ومناسبة لإجراء عدد كبير من التجارب على.
تطبق هذه الدراسة الحقن المتكرر تحت الجلد من سكوبولامين لإنشاء نموذج فأر العين الجافة. نقوم بتحليل مؤشرات جفاف العين مثل عيوب القرنية ومستويات إفراز الدموع والتشكل المرضي للقرنية والملتحمة والغدة الدمعية. من خلال الجمع بين تركيز الدواء والمظاهر المرضية وأعراض جفاف العين ، فإننا نوضح بشكل أكبر نموذج فأر العين الجافة بالتفصيل ، مما يوفر بيانات تجريبية أكثر دقة لدراسة علاج جفاف العين والآليات المرضية. كما وصفنا عملية النمذجة بالتفصيل للباحثين في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم إجراء جميع التجارب على التي يتم إجراؤها وفقا لهذا البروتوكول بموجب موافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC).
1. إعداد
- قم بإعداد 12 فئران صحية من نوع SPF Wistar تبلغ من العمر 6 أسابيع تزن 160 جم ± 20 جم.
- استخدم مصباح الشق ومنظار العين لفحص حالات العين لجميع الفئران ، والتأكد من عدم وجود أمراض في الجزء الأمامي أو الشبكية.
- رفع جميع الفئران لمدة 1 أسبوع مع ما يكفي من الغذاء ومصادر المياه.
- قسمت جميع الفئران عشوائيا إلى مجموعات طبيعية ، وتركيز دواء سكوبولامين 2.5 مجم / مل ، وتركيز دواء سكوبولامين 5 مجم / مل ، وتركيز دواء سكوبولامين 7.5 مجم / مل ، مع ثلاثة في كل مجموعة.
2. إعداد الحل
- تحضير هيدروبروميد سكوبولامين عن طريق إذابته في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ لعمل محلول بتركيزات 7.5 ملغم / مل و 5 ملغم / مل و 2.5 ملغم / مل.
- تحضير محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ بدون هيدروبروميد سكوبولامين لاستخدامه كحقن لمجموعة التحكم من الفئران.
3. إعداد المعدات والمواد
- تحضير مجهر صغير.
- تحضير المواد للتجربة ، بما في ذلك حقنة 1 مل يمكن التخلص منها بإبرة (26 جم) ؛ شرائط الفلوريسئين الصوديوم للعيون. شريط اختبار المسيل للدموع شيرمر ؛ الإيثانول المطلق 4 ٪ بارافورمالدهيد. زيلين. بلسم محايد الهيماتوكسيلين ، يوزين. ومجموعة تلطيخ حمض شيف الدورية.
4. الحقن تحت الجلد
ملاحظة: يتطلب هذا الإجراء مساعدة من شخص ثان للمساعدة في تأمين الفئران.
- امسك جسم الجرذ بثبات وامسكه وامتد ساقيه الخلفيتين اليسرى (أو اليمنى).
ملاحظة: يمكن أن يساعد المساعد في حمل. - تنظيف موقع الحقن بالكحول.
- أدخل حقنة سعة 1 مل يمكن التخلص منها بإبرة (26 جم) في قاعدة طية الجلد بين الإبهام والإصبع.
- نضح المحقنة عن طريق سحب مكبس المحقنة. أي دم في المحقنة يشير إلى وضع إبرة غير لائق ؛ قم بإزالة الإبرة وإعادة وضعها.
- يتم تطبيق محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ مع أو بدون سكوبولامين هيدروبروميد بحركة سائلة ثابتة.
- حقن جميع الفئران وفقا لتركيزات مختلفة ، مع حقن 0.5 مل في كل مرة وأربع مرات يوميا (في الساعة 9:00 و 12:00 و 15:00 و 18:00) لفترة متتالية مدتها 19 يوما ، بالتناوب بين الأطراف اليسرى واليمنى.
ملاحظة: يتم تسمية المجموعات على النحو التالي:
مجموعة بدون هيدروبروميد سكوبولامين: 0 مجموعة (تحكم)
المجموعة مع سكوبولامين هيدروبروميد 2.5 ملغ/مل: 2.5 مجموعة
المجموعة مع سكوبولامين هيدروبروميد 5 ملغ / مل: 5 مجموعة
المجموعة مع سكوبولامين هيدروبروميد 7.5 ملغم / مل: 7.5 مجموعة - أعد إلى قفصه وراقب التنفس والسلوك لمدة 5-10 دقائق.
5. اختبار إفراز المسيل للدموع (اختبار شيرمر المسيل للدموع ، STT)
- قم بإنشاء شريط ورق ترشيح معدل للفئران11. اقطع نصف شريط ورق الترشيح المستخدم للبشر على طول خط الوسط (1 مم × 15 مم) ، وقم بقص رأس الشريط لجعله ناعما.
ملاحظة: قبل إجراء اختبار إفراز الدموع ، قم بتقييد جسم الجرذ يدويا لمنع الحركة وضمان تعرض عيون الفئران. - ضع شريط ورق الترشيح على 1/3 الخارجي من كيس الملتحمة السفلي للفئران.
- حدد وقت الاختبار لمدة 5 دقائق. السيطرة على إغلاق عيون الفئران طوال العملية.
- بعد القياس ، استخدم الملقط لتثبيت شريط ورق الترشيح في أنبوب طرد مركزي دقيق وتسجيل حجم المسيل للدموع عن طريق وضع علامة على جدار الأنبوب.
- قم بقياس إفراز الدموع في اليوم 0 واليوم 1 واليوم 3 واليوم 5 واليوم 7 واليوم 11 واليوم 15 واليوم 19.
6. تلطيخ القرنية الفلوريسئين
- إسقاط 0.5 ميكرولتر من محلول الصوديوم فلوريسئين 0.5 ٪ في كيس الملتحمة السفلي لكل فئران.
- راقب القرنية تحت الضوء الأزرق لمدة 3 دقائق بعد تقطير الفلوريسين.
- سجل تلطيخ مضان قرنية كل فأر ولاحظ ما إذا كان هناك عيب في القرنية.
- قم بإجراء تلطيخ فلوريسئين القرنية في اليوم 0 واليوم 1 واليوم 3 واليوم 5 واليوم 7 واليوم 11 واليوم 15 واليوم 19.
7. الملاحظة النسيجية لأنسجة الملتحمة
- بعد الانتهاء من تطوير النموذج ، قم بتخدير الفئران بعمق بحقن داخل الصفاق يبلغ 0.4 مل / 100 جم من 10٪ هيدرات الكلورال المائية لتخفيف توتر. ثم القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
- خذ الملتحمة البصلية من نفس المناطق لكل فأر ، بحجم حوالي 2 مم × 2 مم.
- ثبت الأنسجة على الفور في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة وقم بتضمينها في البارافين13.
- قطع أقسام سمك 5 ميكرومتر وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين (HE)14 وحمض شيف الدوري (PAS) وصمة عار (اتبع تعليمات الشركة المصنعة).
8. الملاحظة النسيجية لأنسجة القرنية والغدة الدمعية
- بعد الانتهاء من تطوير النموذج ، القتل الرحيم للفأر كما هو موضح في الخطوة 7.1.
- خذ القرنية على الجانب الأيمن من كل فأر وقم بإصلاحه على الفور في محلول بارافورمالدهايد 4٪.
- قطع البشرة الرأسية والأنسجة تحت الجلد على طول الخط الذي يربط الأذن والزاوية الخارجية للعين ، وتوسيع شق لكلا الجانبين وزيادة عزل الغدة المدارية الصفراء الزائدة.
- قم بإزالة فراء الفئران تماما وفصل الغدة خارج الحجاج بمحلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪.
- ضع الغدد خارج الحجاج المعزولة في محلول بارافورمالدهايد 4٪ لمدة 24 ساعة وقم بتضمينها في البارافين.
- قطع المقاطع المستمرة بسمك ~ 5 ميكرومتر وتلطيخها ب HE لعينات أنسجة القرنية والغدة خارج الحجاج.
9. التحليل الإحصائي
- استخدام البرامج المناسبة للتحليل الإحصائي للبيانات.
- إجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لتحليل البيانات واختبار الفرق الأقل أهمية (LSD) للمقارنة بين المجموعات. اضبط مستوى الدلالة الإحصائية على α = 0.05 ، مع P < 0.05 للإشارة إلى الأهمية الإحصائية.
ملاحظة: تم استخدام برنامج SPSS 20 للتحليل الإحصائي للبيانات التجريبية.
- إجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لتحليل البيانات واختبار الفرق الأقل أهمية (LSD) للمقارنة بين المجموعات. اضبط مستوى الدلالة الإحصائية على α = 0.05 ، مع P < 0.05 للإشارة إلى الأهمية الإحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اختبار شيرمر الأول ، SIT I
تم قياس حجم دموع الفئران في الأيام 0 و 3 و 5 و 7 و 11 و 15 و 19 بعد بدء التجربة. أظهرت النتائج التجريبية أن إفراز الدموع لمجموعة سكوبولامين (مجموعة 2.5 ، مجموعة 5 ، مجموعة 7.5) ، مقارنة مع المجموعة الضابطة (مجموعة 0) ، انخفض بشكل ملحوظ ، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (P < 0.01). لا توجد دلالة إحصائية بين المجموعة 2.5 والمجموعة 5 والمجموعة 7.5 (P > 0.05). لم يلاحظ وجود فرق كبير بين المجموعات المختلفة من حيث عدد الأيام (P > 0.05) (الشكل 1 ، الجدول 1).
تلطيخ القرنية الفلوريسئين
تم إجراء تلطيخ فلوريسئين القرنية في الأيام 0 و 3 و 5 و 7 و 11 و 15 و 19 من التجربة. أظهرت النتائج أنه لم يكن هناك تلطيخ فلوريسئين القرنية في أي مجموعة ، مما يشير إلى أنه لم يتم تشكيل عيوب ظهارية واضحة في القرنية خلال التجربة التي استمرت 20 يوما بتركيزات مختلفة من أدوية سكوبولامين (الشكل 2).
التحليل المرضي لظهارة القرنية
بعد التجربة ، تم جمع أنسجة القرنية من كل فأر لتلطيخ HE لمراقبة مورفولوجيا ظهارة القرنية وقياس سمك الطبقة الظهارية للقرنية. تتكون ظهارة القرنية للمجموعة الضابطة من 4-6 طبقات من الخلايا الظهارية المرتبة بشكل منظم ، من بينها الطبقة القاعدية تتكون من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية العمودية مرتبة بدقة وعن كثب. كانت ظهارة القرنية لمجموعات سكوبولامين 2.5 و 5 و 7 أرق بكثير من المجموعة الضابطة ، مع مورفولوجيا الخلايا المسطحة والضامرة وبنية الخلية المضطربة. في المجموعة 7.5 ، كان هناك اتصال فضفاض بين الخلايا وبنية فراغية في الطبقة القاعدية (يشار إليها بالسهم الأحمر في الشكل 3). بالمقارنة مع ظهارة القرنية لمجموعات سكوبولامين ، أظهرت ظهارة القرنية لمجموعة التحكم الطبيعية اختلافات إحصائية في سمك الطبقة الظهارية القرنية (الشكل 4).
التحليل المرضي للغدة الدمعية
الغدة الرئيسية لإفراز المسيل للدموع في الفئران هي الغدة الدمعية الحجاجية15. عند مراقبة شرائح الغدة الدمعية ، لوحظت تغيرات في مورفولوجيا الخلايا الظهارية للغدة الدمعية مع زيادة تركيز سكوبولامين ، مصحوبة بالتهاب وذمة أنسجة. لم يلاحظ مثل هذه التغييرات في المجموعة الضابطة. تشير نتائج علم الأمراض إلى أنه يمكن استخدام التغيرات الالتهابية في الغدة الدمعية ، وذمة الخلية ، وضمور الخلايا الظهارية الغدية كمؤشرات للتلف الوظيفي للغدة الدمعية16 (الجدول 2). يمكن استخدام هذه المؤشرات لقياس شدة جفاف العين فيما يتعلق بكمية إفراز الدموع (الشكل 5).
تحليل نتائج تلطيخ الملتحمة
اكتمل هيكل الملتحمة في المجموعة الضابطة ، ويتكون بشكل أساسي من الطبقة السطحية والصفيحة المخصوطة. الطبقة السطحية عبارة عن خلايا ظهارية عمودية مغلفة ، ناعمة وكاملة ، مع وجود الزغابات الدقيقة على سطح الخلية. كانت الخلايا الكأسية المتناثرة موجودة بين الخلايا الظهارية ، مع حجم خلية كبير وحبيبات مخاطية في سيتوبلازم الخلية. كانت الطبقة السطحية لظهارة الملتحمة في مجموعات أدوية سكوبولامين الثلاث أرق بشكل ملحوظ ، وتم تقليل عدد الزغابات الدقيقة والخلايا الكأسية ، وكان هيكل ترتيب الخلية غير مكتمل ، مصحوبا بالوذمة ، وكمية صغيرة من الخلايا الالتهابية كما لوحظ في تلطيخ HE (الشكل 6).
من خلال تلطيخ الملتحمة باستخدام PAS ، تم حساب متوسط عدد الخلايا الكأسية لكل حقل مجهري 40x في ثلاث عينات مستقلة من كل فأر والتعبير عنها كمتوسط ± SD (الشكل 7).
الشكل 1: إحصائيات قيمة اختبار شيرمر في كل مجموعة (مم) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تلطيخ فلوريسئين الصوديوم لقرنية الفئران. في التجربة التي استمرت 20 يوما مع فلوريسئين الصوديوم ، لم تلاحظ أي نتائج إيجابية في قرنيات جميع الفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تلطيخ ظهارة القرنية وقياس سمكها. في المجموعة 7.5 ، كان هناك اتصال فضفاض بين الخلايا وبنية فراغية في الطبقة القاعدية (يشار إليها بالسهم الأحمر) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: إحصائيات سمك القرنية الطلائية في كل مجموعة. بالمقارنة مع ظهارة القرنية لمجموعات سكوبولامين ، أظهرت ظهارة القرنية لمجموعة التحكم الطبيعية اختلافات إحصائية في سمك الطبقة الظهارية للقرنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: نتائج تلطيخ سعادة للغدة الدمعية الخارجية الحجاجية للفئران. (أ) المجموعة 0: في المجال البصري، أظهرت الغدد الدمعية تركيبا مفصصا وتتكون من قنوات وغدد أنبوبية، مع عدم وجود تشوهات واضحة في مورفولوجيا القنوات، بينما تتكون الغدد الأنبوبية من خلايا غدية مخروطية الشكل تحتوي على مواد مخاطية وفيرة في السيتوبلازم لا توجد وذمة واضحة في الأنسجة الضامة ، ولا تشوهات واضحة في الأوعية الدموية الخلالية ، ولا نخر واضح وتسلل الخلايا الالتهابية. (ب) المجموعة 2.5: في المجال البصري، لوحظ ضمور عرضي للخلايا الطلائية للغدة الدمعية، مع انخفاض الحجم، وتجاويف غدية متوسعة غير منتظمة الشكل، وانخفاض المادة المخاطية داخل التجويف (يشار إليها بالسهم الأحمر). هناك أيضا تسلل عرضي للخلايا الليمفاوية الحرة في السدى (المشار إليه بالسهم الأزرق) ، ولكن لم يلاحظ أي تشوهات واضحة في مورفولوجيا القناة أو علامات الوذمة. (ج) المجموعة 5: في المجال البصري، كانت الخلايا الظهارية الدمعية ضمور وأقل حجما من حين لآخر، وتضخم التجويف الغدي، واختزلت المادة المخاطية في التجويف (السهم الأحمر)، ولوحظ أحيانا ارتشاح الخلايا الليمفاوية الحرة في السدى (السهم الأزرق)، ولم يلاحظ أي تشوهات واضحة في مورفولوجيا القناة أو وذمة النسيج الضام بين فصيصات الغدة الدمعية. (د) المجموعة 7-5: يمكن رؤية الوذمة في المجال البصري؛ يتم توسيع التباعد بين الغدد الدمعية ، والترتيب غير منتظم (السهم الأخضر) ، وغالبا ما يتم ضمور الخلايا الظهارية للغدد الدمعية ، ويصبح الحجم أصغر ، والشكل غير منتظم (السهم الأصفر) ، وأحيانا يتم توسيع تجويف الغدة ، يتم تقليل المادة المخاطية في التجويف (السهم الأحمر) ، وأحيانا يتم تسلل الخلايا الليمفاوية الحرة (السهم الأزرق) ، مع عدم وجود تشوهات واضحة في مورفولوجيا القناة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تلطيخ ملتحمة الفئران. بالمقارنة مع ظهارة الملتحمة للمجموعة الضابطة ، أظهرت جميع المجموعات الثلاث من ظهارة الملتحمة الطبية بسكوبولامين درجات متفاوتة من الضرر الهيكلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تلطيخ الملتحمة PAS. (أ) فئران السيطرة العادية. ب: فئران مجموعة سكوبولامين. ج: كثافة الخلايا الكأسية في كل مجموعة (20x). شريط أسود = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اختبار شيرمر الأول ، SIT (متوسط القيمة ، الوحدة [مم]) | |||||||
| مجموعة | 0 أيام | 3 أيام | 5 أيام | 7 أيام | 11 أيام | 15 يوما | 19 يوما |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
الجدول 1: اختبار شيرمر للفئران في المجموعات الأربع في نقاط زمنية مختلفة (مم). بعد تطبيق الدواء ، انخفض إفراز الدموع في الفئران بشكل ملحوظ.
| رقم | نخر | إلتهاب | ذمه | ضمور الظهارة |
| 0 جرب -1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 GRP -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 GRP -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 GRP -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2.5 GRP -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 GRP -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 GRP -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 GRP -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 GRP -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7.5 GRP -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7.5 GRP -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7.5 GRP -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
الجدول 2: درجة الأنسجة المرضية للغدة الدمعية للفئران. معايير التسجيل: 0: في ظل الظروف العادية ، مع الأخذ في الاعتبار عوامل مثل عمر والجنس والإجهاد ، تعتبر الأنسجة طبيعية ؛
1: التغييرات المرصودة تجاوزت للتو المعدل الطبيعي ؛ 2: يمكن ملاحظة الآفات ، لكنها ليست شديدة بعد ؛ 3: الآفات واضحة وتستمر في التفاقم. 4: الآفات شديدة للغاية وقد أثرت على الأنسجة بأكملها16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العين الجافة التي تعاني من نقص مائي (ADDE) هي نوع مهم من جفاف العين ، حيث تمثل حوالي 1/3 من إجمالي عدد سكان العين الجافة17 ، والسبب الرئيسي ل ADDE هو الضرر المرضي للغدة الدمعيةوالالتهاب 13. بالنسبة لهذا النوع من جفاف العين ، فإن طرق العلاج السريري الأكثر شيوعا هي الدموع الاصطناعية لتخفيف الأعراض أو التطبيق الموضعي للستيرويدات أو السيكلوسبورين18 ، في حين أن هناك خيارات علاج قليلة لتلف الغدة الدمعية. لذلك ، من المهم جدا استكشاف تأثير إعادة بناء وظيفة الغدة الدمعية على جفاف العين وإنشاء نموذج حيواني لخلل الغدة الدمعية. استخدمنا طريقة التطبيق المتكرر للدواء لقمع إفراز الغدة الدمعية في الفئران وأنشأنا نموذجا حيوانيا مزمنا لخلل الغدة الدمعية للعين الجافة.
اخترنا الفئران لبناء نموذج العين الجافة هذا ، والذي يتمتع بمزايا أكثر مقارنة بالنماذج الحيوانية الأخرى19. على سبيل المثال ، الأرانب لديها حجم جسم أكبر وتتطلب جرعات أكثر من الدواء أو حقن أكثر تواترا لتحقيق التأثير المطلوب. علاوة على ذلك ، فإن الأرانب أغلى قليلا ، مما يعني المزيد من تكاليف التجربة. تستخدم الفئران أيضا بشكل شائع في أبحاث طب العيون ، ولكنها تستخدم بشكل عام لبناء نماذج متلازمة سجوجرن20. تركز هذه النماذج على مقارنة التهاب الأعضاء وتسلل الخلايا الليمفاوية لاستكشاف الآليات المناعية. الفئران لديها أحجام جسم صغيرة ، وتشريح الغدة الدمعية المعقدة ، وإفراز منخفض للدموع ، مما يجعل من الصعب عكس إنتاج الدموع بدقة. نموذج الفئران هو نموذج أكثر ملاءمة للعين الجافة لأنه يسمح بحقن الأدوية المريحة ، وله ظروف تغذية بسيطة نسبيا ، ومناسب لكل من الدراسات السريرية والتجريبية ، وله أيضا مزايا من حيث التكلفة. إنه نموذج حيواني جيد ل ADDE.
قمنا بتطبيق حاصرات مستقبلات الكوليني سكوبولامين لتثبيط المستقبلات الكولينية في جسم الفئران ، مما يقلل من إفراز الغدة الدمعية ويغير البنية المرضية لخلايا الغدة الدمعية ، والتي تحاكي بشكل أساسي حالة الغدد الدمعية في مرضى جفاف العين. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، فإن هذا النهج يحاكي بشكل أفضل الحالة التالفة للغدد الدمعية في حالة طبيعية. طرق أخرى ، مثل استخدام قطرات العين كلوريد البنزالكونيوم21 أو تغيير الظروف الخارجية مثل تقليل الرطوبة وزيادة تبخر سطح العين 4,8 ، تعطل فقط بيئة سطح العين ولا تغير الحالة الوظيفية للغدة الدمعية. لذلك ، فهي ليست مناسبة لحالات جفاف العين المزمنة على المدى الطويل.
في قياس حجم إفراز الدموع في الفئران ، قمنا بتحسين شرائط اختبار شيرمر المسيل للدموع. أولا ، قمنا بقطع شريط اختبار التمزق الذي يستخدمه البشر على طول خط الوسط. بعد ذلك ، قمنا بقص الجزء العلوي إلى شكل قوس دائري وقمنا بطيه برفق في الأعلى لتسهيل إدخاله بسهولة في كيس الملتحمة السفلي للفئران. تجدر الإشارة إلى أن الفئران نشطة ، ويصعب قياس الدموع لمدة 5 دقائق. بعد إدخال شريط اختبار الدموع شيرمر في كيس الملتحمة السفلي للفأر ، أغلقنا عيون الفئران يدويا لزيادة راحتهم وتجنب النضال أثناء القياس الطويل للدموع ، مما قد يؤثر على نتائج القياس.
أثناء استخراج الغدة الدمعية ، من الضروري أولا تحديد موقعها. نقطة توطين الغدة الدمعية هي نقطة المنتصف بين مقدمة الأذن والكانثوس الداخلي. بعد ذلك ، قم بقطع أنسجة الجلد تحت الفراء ، مما يقلل من دخول الفراء المجزأ ويقلل من عملية المناولة في المرحلة اللاحقة. أثناء عملية الاستخراج ، من المهم أيضا تنظيف الفراء المجزأ في الوقت المناسب. خاصة عند فصل الغدة الدمعية ، استخدم محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو محلول ملحي للشطف المتكرر وتجنب الاختلاط بالأنسجة الأخرى التي قد تؤثر على نتائج التقسيم.
ميزة النموذج الحيواني للعين الجافة التي تم تطويرها هي أن البروتوكول ربط تركيزات الدواء المختلفة بدرجات مختلفة من إصابة الغدة الدمعية. هذا يوفر أساسا تجريبيا لدراسة علاج ضعف الغدة الدمعية. لقد قمنا بتحسين بعض الخطوات التشغيلية في عملية النمذجة لتوفير مواد مرجعية أكثر تفصيلا للباحث. بالإضافة إلى ذلك ، أضفنا مؤشرات تحليل لنموذج العين الجافة ، مع دمج المؤشرات المورفولوجية للقرنية والملتحمة والغدة الدمعية ، وحساب خلايا الملتحمة ، وتسجيل درجة إصابة الغدة الدمعية. قمنا بتقييم وظيفة الغدة الدمعية من الالتهاب والوذمة والضمور. لقد اخترنا طرق التحليل الأكثر شمولا وفعالية من حيث التكلفة والدقة لتعكس درجة جفاف العين واختلال وظائف الغدة الدمعية.
ومع ذلك ، فإن طريقتنا لها أيضا قيود معينة. بسبب العملية الطويلة لبناء النماذج الحيوانية ، يحتاج المجربون إلى الحقن بشكل متكرر. على الرغم من وجود بعض الطرق حاليا لاستبدال الحقن اليدوية ، مثل مضخات الأدوية أو البقع عبر الجلد ، لا تزال هناك بعض المضاعفات في استخدامها. كيفية تطبيق طرق أفضل لتقليل وتيرة الدواء ، وتجنب حدوث مضاعفات ، وضمان دقة الجرعة هو هدفنا التالي. في الختام ، قمنا بتحسين نموذج حيواني لجفاف العين ناتج عن حقن سكوبولامين ، مما يوفر أساسا تجريبيا للبحث في خلل الغدة الدمعية في ADDE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب محتمل في المصالح يتعلق بالأدوية والمواد المستخدمة في هذا الإجراء.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل التخصصات السريرية الرئيسية رفيعة المستوى لمقاطعة قوانغدونغ (SZGSP014) ومؤسسة شنتشن للعلوم الطبيعية (JCYJ20210324125805012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | SJZ No.4 Pharmaceutical | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoxylin and eosin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D006 | |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | |
| Paraffin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | YA0012 | |
| Periodic Acid-Schiff Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer tear test strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Scopolamine hydrobromide | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Small animal microscope | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 |
References
- Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
- Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133 (2015).
- Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309 (2014).
- Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102 (2021).
- Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
- Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
- Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
- Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
- Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
- Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
- Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
- Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483 (2018).
- Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
- Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
- Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394 (2021).
- Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
- Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
