Summary
Qui, stabiliamo un modello di ratto di disfunzione della ghiandola lacrimale per fornire una base per lo studio dell'occhio secco con deficit acquoso.
Abstract
L'occhio secco da carenza acquosa (ADDE) è un tipo di malattia dell'occhio secco che può comportare la riduzione della quantità e della qualità della secrezione lacrimale. La produzione anomala prolungata di lacrime può portare a un disturbo nell'ambiente della superficie oculare, inclusi danni corneali e infiammazioni. Nei casi più gravi, l'ADDE può causare la perdita della vista o addirittura la cecità. Attualmente, il trattamento dell'occhio secco è limitato a colliri o terapia fisica, che possono solo alleviare i sintomi del disagio oculare e non possono curare fondamentalmente la sindrome dell'occhio secco. Per ripristinare la funzione della ghiandola lacrimale nell'occhio secco, abbiamo creato un modello animale di disfunzione della ghiandola lacrimale nei ratti indotta dalla scopolamina. Attraverso la valutazione completa della ghiandola lacrimale, delle cornee, delle congiuntive e di altri fattori, miriamo a fornire una piena comprensione dei cambiamenti patologici dell'ADDE. Rispetto all'attuale modello murino a occhio secco, questo modello animale ADDE include una valutazione funzionale della ghiandola lacrimale, fornendo una piattaforma migliore per studiare la disfunzione della ghiandola lacrimale nell'ADDE.
Introduction
Entro il 2021, circa il 12% delle persone è significativamente colpito dalla secchezza oculare1, rendendola una delle malattie croniche degli occhi più comuni. L'occhio secco può essere suddiviso in due tipi: l'occhio secco da carenza acquosa (ADDE) e l'occhio secco evaporativo (EDE)2, a seconda dei diversi fattori che influenzano la malattia. L'ADDE è ulteriormente suddivisa in sindrome di Sjögren (SS) e non-SS, ma la maggior parte dei pazienti con occhio secco sono pazienti non SS nella clinica3. I sintomi cronici dell'occhio secco compromettono seriamente la qualità visiva dei pazienti. Attualmente, il trattamento convenzionale della DED prevede l'applicazione di lacrime artificiali per lubrificare la superficie oculare e la terapia fisica delle palpebre. Tuttavia, la sindrome dell'occhio secco potrebbe non offrire una cura completa in molti casi. Pertanto, lo studio della patogenesi della malattia dell'occhio secco è fondamentale per lo sviluppo di nuove terapie e farmaci. I modelli animali della sindrome dell'occhio secco forniscono una base per ulteriori ricerche.
Esistono molti modi per costruire modelli animali della sindrome dell'occhio secco4, tra cui la modifica dei livelli di secrezione lacrimale alterando i livelli ormonali. Ad esempio, la rimozione dei testicoli dei ratti può ridurre la secrezione di androgeni, aumentare la secrezione lacrimale e diminuire la concentrazione di componente secretorio libero (SC) e IgA nelle lacrime 5,6. Un altro metodo consiste nell'indicare le reazioni autoimmuni nella ghiandola lacrimale rimuovendo i nervi della superficie oculare che controllano la ghiandola. Inoltre, è possibile ridurre direttamente la secrezione lacrimale rimuovendo chirurgicamente la ghiandola lacrimale7. Anche le mutevoli condizioni ambientali possono accelerare l'evaporazione delle lacrime. Ad esempio, la coltura di animali in condizioni di bassa umidità e ventilazione asciutta può stabilire un modello di eccessiva secchezza oculare evaporativa8, che può essere combinato con altri metodi per aumentare la gravità dell'occhio secco. I principali farmaci utilizzati per indurre modelli sperimentali di occhio secco sono l'atropina e la scopolamina9. Come inibitori parasimpatici, entrambi possono indurre il blocco farmacologico dei recettori colinergici (muscarinici) nella ghiandola lacrimale e inibire la secrezione lacrimale. Rispetto alla secchezza oculare causata dall'iniezione muscolare di atropina10, la scopolamina ha un effetto inibitorio più forte sulle ghiandole della secrezione, una durata più lunga dell'azione del farmaco ed effetti più deboli sulla muscolatura liscia cardiaca, dell'intestino tenue e bronchiale. È uno dei farmaci più maturi per i modelli animali di occhio secco.
Diversi metodi possono essere utilizzati per indurre l'occhio secco con scopolamina, come l'iniezione sottocutanea, la pompa del farmaco o l'applicazione di cerotti 4,11,12. Al fine di ridurre la frequenza di somministrazione di farmaci agli animali da esperimento, molti ricercatori applicano cerotti transdermici alla coda dei topi o utilizzano pompe per farmaci. Tuttavia, entrambi questi metodi hanno delle limitazioni. Ad esempio, l'assorbimento dei cerotti transdermici deve tenere conto dell'assorbimento individuale dei topi, che può portare a un dosaggio incoerente del farmaco. Sebbene le pompe per farmaci siano in grado di controllare con precisione il dosaggio di ogni somministrazione, non sono sempre compatibili con il farmaco erogato o con la concentrazione utilizzata. Devono anche essere posizionati chirurgicamente, il che è più invasivo per l'animale, richiedendo un evento anestetico e c'è il potenziale per complicanze post-chirurgiche come la deiscenza. L'iniezione sottocutanea, sebbene più ingombrante, può garantire un dosaggio accurato per ogni somministrazione e mantenere la coerenza nella somministrazione del farmaco tra i diversi ratti. Allo stesso tempo, ha un costo inferiore ed è adatto per condurre un gran numero di esperimenti sugli animali.
Questo studio applica ripetute iniezioni sottocutanee di scopolamina per stabilire un modello di ratto a occhio secco. Analizziamo gli indicatori dell'occhio secco come i difetti corneali, i livelli di secrezione lacrimale e la morfologia patologica della cornea, della congiuntiva e della ghiandola lacrimale. Combinando la concentrazione del farmaco, le manifestazioni patologiche e i sintomi dell'occhio secco, elaboriamo ulteriormente il modello di ratto dell'occhio secco in dettaglio, fornendo dati sperimentali più accurati per lo studio del trattamento dell'occhio secco e dei meccanismi patologici. Descriviamo anche il processo di modellazione in dettaglio per i futuri ricercatori.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti seguendo questo protocollo sono eseguiti sotto l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC).
1. Preparazione dell'animale
- Prepara 12 ratti femmine Wistar sani di 6 settimane con SPF del peso di 160 g ± 20 g.
- Utilizzare una lampada a fessura e un oftalmoscopio per esaminare le condizioni degli occhi di tutti i ratti, assicurandosi che non vi siano malattie del segmento anteriore o della retina.
- Alleva tutti i ratti per 1 settimana con sufficienti fonti di cibo e acqua.
- Tutti i ratti sono stati divisi in modo casuale in gruppi normali, con concentrazione del farmaco scopolamina 2,5 mg/mL, concentrazione del farmaco scopolamina 5 mg/mL e concentrazione del farmaco scopolamina 7,5 mg/mL, con tre animali in ciascun gruppo.
2. Preparazione della soluzione
- Preparare il bromuro di scopolamina sciogliendolo in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% per ottenere una soluzione con concentrazioni di 7,5 mg/mL, 5 mg/mL e 2,5 mg/mL.
- Preparare una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% senza bromuro di scopolamina da utilizzare come iniezione per il gruppo di controllo dei ratti.
3. Preparazione dell'attrezzatura e del materiale
- Prepara un microscopio per piccoli animali.
- Preparare i materiali per l'esperimento, tra cui una siringa monouso da 1 mL con ago (26 G); strisce oftalmiche di fluoresceina sodica; Striscia reattiva per lacrime di Schirmer; etanolo assoluto; 4% paraformaldeide; xilene; balsamo neutro; ematossilina, eosina; e kit periodico di colorazione acido-Schiff.
4. Iniezione sottocutanea
NOTA: Questa procedura richiede l'assistenza di una seconda persona per aiutare a proteggere i ratti.
- Tieni fermo il corpo del ratto e afferra e allunga le zampe posteriori sinistre (o destre).
NOTA: Un assistente può aiutare a tenere l'animale. - Pulire il sito di iniezione con alcool.
- Inserire una siringa monouso da 1 mL con ago (26 G) alla base della piega cutanea tra il pollice e l'indice.
- Aspirare la siringa tirando indietro lo stantuffo della siringa. L'eventuale presenza di sangue nella siringa indica un posizionamento errato dell'ago; Rimuovere e riposizionare l'ago.
- Somministrare una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% con o senza bromuro di scopolamina con un movimento costante e fluido.
- Iniettare tutti i ratti in base a diverse concentrazioni, iniettando 0,5 ml ogni volta e quattro volte al giorno (alle 9:00, 12:00, 15:00 e 18:00) per un periodo consecutivo di 19 giorni, alternando gli arti sinistro e destro.
NOTA: i gruppi sono denominati come segue:
Gruppo senza bromuro di scopolamina: 0 gruppo (controllo)
Gruppo con scopolamina bromuro 2,5 mg/mL: gruppo 2,5
Gruppo con bromuro di scopolamina 5 mg/mL: gruppo 5
Gruppo con bromidrato di scopolamina 7,5 mg/mL: gruppo 7,5 - Rimetti l'animale nella sua gabbia e monitora la respirazione e il comportamento per 5-10 minuti.
5. Test della secrezione lacrimale (test lacrimale di Schirmer, STT)
- Creare una striscia di carta da filtro modificata per i ratti11. Tagliare metà della striscia di carta da filtro utilizzata per gli esseri umani lungo la linea centrale (1 mm × 15 mm) e tagliare la testa della striscia per renderla liscia.
NOTA: Prima di eseguire il test della secrezione lacrimale, trattenere manualmente il corpo del ratto per impedirne il movimento e garantire l'esposizione degli occhi del ratto. - Posizionare la striscia di carta da filtro sul 1/3 esterno del sacco congiuntivale della palpebra inferiore del ratto.
- Cronometrare il test per 5 min. Controllare la chiusura degli occhi del ratto durante la procedura.
- Dopo la misurazione, utilizzare una pinzetta per bloccare la striscia di carta da filtro in una provetta per microcentrifuga e registrare il volume lacrimale tracciando un segno sulla parete della provetta.
- Misura la secrezione lacrimale il giorno 0, il giorno 1, il giorno 3, il giorno 5, il giorno 7, il giorno 11, il giorno 15 e il giorno 19.
6. Colorazione con fluoresceina corneale
- Far cadere 0,5 μL di soluzione di fluoresceina sodica allo 0,5% nel sacco congiuntivale inferiore di ciascun ratto.
- Osservare la cornea sotto la luce blu per 3 minuti dopo l'instillazione di fluoresceina.
- Registrare la colorazione fluorescente della cornea di ciascun ratto e osservare se c'è un difetto corneale.
- Eseguire la colorazione con fluoresceina corneale il giorno 0, il giorno 1, il giorno 3, il giorno 5, il giorno 7, il giorno 11, il giorno 15 e il giorno 19.
7. Osservazione istologica del tessuto congiuntivale
- Dopo aver completato lo sviluppo del modello, anestetizzare i ratti in profondità con un'iniezione intraperitoneale di 0,4 ml/100 g di idrato acquoso di cloralio al 10% per alleviare la tensione degli animali. Quindi, sopprimere i ratti mediante lussazione cervicale.
- Prelevare la congiuntiva bulbare dalle stesse regioni di ciascun ratto, con una dimensione di circa 2 mm x 2 mm.
- Fissare immediatamente i tessuti in paraformaldeide al 4% per 24 ore e incorporare in paraffina13.
- Tagliare sezioni di spessore 5 μm e colorare con ematossilina ed eosina (HE)14 e colorante periodico acido-Schiff (PAS) (seguire le istruzioni del produttore).
8. Osservazione istologica del tessuto corneale e lacrimale
- Dopo aver completato lo sviluppo del modello, sopprimere il ratto come descritto al punto 7.1.
- Prendi la cornea sul lato destro di ogni ratto e fissala immediatamente in una soluzione di paraformaldeide al 4%.
- Tagliare l'epidermide cefalica e il tessuto sottocutaneo lungo la linea che collega l'orecchio e l'angolo esterno dell'occhio, espandere l'incisione su entrambi i lati e isolare ulteriormente la ghiandola extraorbitaria giallastra.
- Rimuovere accuratamente il pelo del ratto e separare la ghiandola extraorbitaria con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%.
- Porre le ghiandole extraorbitali isolate in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore e incorporare in paraffina.
- Tagliare sezioni continue di ~5 μm di spessore e colorarle con HE per campioni di tessuto corneale ed extraorbitale.
9. Analisi statistica
- Utilizzare software appropriati per l'analisi statistica dei dati.
- Eseguire l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) per analizzare i dati e il test delle differenze meno significative (LSD) per il confronto tra i gruppi. Impostare il livello di significatività statistica su α = 0,05, con P < 0,05 che indica la significatività statistica.
NOTA: Per l'analisi statistica dei dati sperimentali è stato utilizzato il software SPSS 20.
- Eseguire l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) per analizzare i dati e il test delle differenze meno significative (LSD) per il confronto tra i gruppi. Impostare il livello di significatività statistica su α = 0,05, con P < 0,05 che indica la significatività statistica.
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Representative Results
Schirmer I prova, SIT I
Il volume lacrimale dei ratti è stato misurato nei giorni 0, 3, 5, 7, 11, 15 e 19 dopo l'inizio dell'esperimento. I risultati sperimentali hanno mostrato che la secrezione lacrimale del gruppo scopolamina (gruppo 2,5, gruppo 5, gruppo 7,5), rispetto al gruppo di controllo (gruppo 0), era significativamente diminuita e la differenza era statisticamente significativa (P < 0,01). Non c'è stata alcuna significatività statistica tra il gruppo 2,5, il gruppo 5 e il gruppo 7,5 (P > 0,05). Non è stata osservata alcuna differenza significativa tra i diversi gruppi in termini di numero di giorni (P > 0,05) (Figura 1, Tabella 1).
Colorazione con fluoresceina corneale
La colorazione con fluoresceina corneale è stata eseguita nei giorni 0, 3, 5, 7, 11, 15 e 19 dell'esperimento. I risultati hanno mostrato che non c'era colorazione con fluoresceina corneale in nessun gruppo, indicando che non si sono formati difetti epiteliali corneali evidenti durante l'esperimento di 20 giorni con diverse concentrazioni di farmaci scopolamina (Figura 2).
Analisi patologica dell'epitelio corneale
Dopo l'esperimento, i tessuti corneali di ciascun ratto sono stati raccolti per la colorazione HE per osservare la morfologia dell'epitelio corneale e misurare lo spessore dello strato epiteliale corneale. L'epitelio corneale del gruppo di controllo era composto da 4-6 strati di cellule epiteliali disposte in modo ordinato, tra cui lo strato basale era costituito da un singolo strato di cellule epiteliali colonnari disposte ordinatamente e ravvicinatamente. L'epitelio corneale dei gruppi scopolamina 2,5, 5 e 7 era significativamente più sottile del gruppo di controllo, con morfologia cellulare appiattita e atrofica e struttura cellulare disordinata. Nel gruppo 7.5, c'era una connessione intercellulare allentata e una struttura vacuolare nello strato basale (indicato dalla freccia rossa nella Figura 3). Rispetto all'epitelio corneale dei gruppi scopolamina, l'epitelio corneale del gruppo di controllo normale ha mostrato differenze statistiche nello spessore dello strato epiteliale corneale (Figura 4).
Analisi patologica della ghiandola lacrimale
La ghiandola principale per la secrezione lacrimale nei ratti è la ghiandola lacrimale estrorbitale15. Quando si osservano le fette della ghiandola lacrimale, sono stati osservati cambiamenti nella morfologia delle cellule epiteliali della ghiandola lacrimale con l'aumento della concentrazione di scopolamina, accompagnati da infiammazione ed edema tissutale. Non sono stati osservati cambiamenti di questo tipo nel gruppo di controllo. I risultati della patologia suggeriscono che i cambiamenti infiammatori della ghiandola lacrimale, l'edema cellulare e l'atrofia delle cellule epiteliali ghiandolari possono essere utilizzati come indicatori del danno funzionale della ghiandola lacrimale16 (Tabella 2). Questi indicatori possono essere utilizzati per misurare la gravità dell'occhio secco in relazione alla quantità di secrezione lacrimale (Figura 5).
Analisi dei risultati della colorazione congiuntivale
La struttura della congiuntiva nel gruppo di controllo è completa, composta principalmente dallo strato superficiale e dalla lamina propria. Lo strato superficiale è costituito da cellule epiteliali colonnari laminate, lisce e complete, con microvilli sulla superficie cellulare. Tra le cellule epiteliali erano presenti cellule caliciformi sparse, con grande volume cellulare e granuli mucosi nel citoplasma cellulare. Lo strato superficiale dell'epitelio congiuntivale nei tre gruppi di farmaci scopolamina era significativamente più sottile, il numero di microvilli e cellule caliciformi era ridotto, la struttura della disposizione cellulare era incompleta, accompagnata da edema e una piccola quantità di cellule infiammatorie come osservato nella colorazione HE (Figura 6).
Colorando la congiuntiva con PAS, è stato calcolato il numero medio di cellule caliciformi per campo microscopico 40x in tre campioni indipendenti di ciascun topo ed espresso come media ± SD (Figura 7).
Figura 1: Statistiche del valore del test di Schirmer in ciascun gruppo (mm) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Colorazione con fluoresceina sodica della cornea di ratto. Nell'esperimento di 20 giorni con fluoresceina sodica, non sono stati osservati risultati positivi nelle cornee di tutti i ratti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Colorazione dell'epitelio corneale e misurazione dello spessore. Nel gruppo 7.5, c'era una connessione intercellulare allentata e una struttura vacuolare nello strato basale (indicato dalla freccia rossa) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Statistiche dello spessore dell'epitelio corneale in ciascun gruppo. Rispetto all'epitelio corneale dei gruppi scopolamina, l'epitelio corneale del gruppo di controllo normale ha mostrato differenze statistiche nello spessore dello strato epiteliale corneale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati della colorazione HE della ghiandola lacrimale estrorbitale dei ratti. (A) Gruppo 0: Nel campo visivo, le ghiandole lacrimali mostravano una struttura lobulare ed erano composte da dotti e ghiandole tubolari, senza anomalie evidenti nella morfologia dei dotti, mentre le ghiandole tubulari erano composte da cellule ghiandolari a forma di cono con abbondanti sostanze mucose nel citoplasma, Nessun edema evidente nei tessuti connettivi, nessuna anomalia evidente nei vasi sanguigni interstiziali e nessuna necrosi evidente e infiltrazione di cellule infiammatorie. (B) Gruppo 2.5: Nel campo visivo si osserva un'atrofia occasionale delle cellule epiteliali della ghiandola lacrimale, con volume ridotto, cavità ghiandolari dilatate di forma irregolare e ridotta sostanza mucinosa all'interno della cavità (indicata dalla freccia rossa). C'è anche un'infiltrazione occasionale di linfociti liberi nello stroma (indicata dalla freccia blu), ma non si osservano anomalie evidenti nella morfologia del dotto o segni di edema. (C) Gruppo 5: nel campo visivo, le cellule epiteliali lacrimali sono state occasionalmente atrofizzate e ridotte di dimensioni, la cavità ghiandolare è stata allargata, la sostanza mucosa nella cavità è stata ridotta (freccia rossa) e occasionalmente è stata osservata infiltrazione di linfociti liberi nello stroma (freccia blu) e non si osservano anomalie evidenti nella morfologia del dotto o edema del tessuto connettivo tra i lobuli della ghiandola lacrimale. (D) Gruppo 7.5: l'edema può essere visto nel campo visivo; la spaziatura tra le ghiandole lacrimali è allargata e la disposizione è irregolare (freccia verde), le cellule epiteliali delle ghiandole lacrimali sono spesso atrofizzate, il volume diventa più piccolo e la forma è irregolare (freccia gialla), occasionalmente la cavità della ghiandola si allarga, la materia mucosa nella cavità è ridotta (freccia rossa), occasionalmente il linfocita libero viene infiltrato (freccia blu), senza apparenti anomalie nella morfologia del condotto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Colorazione HE della congiuntiva di ratto. Rispetto all'epitelio congiuntivale del gruppo di controllo, tutti e tre i gruppi di epitelio congiuntivale drogato con scopolamina hanno mostrato vari gradi di danno strutturale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Colorazione PAS della congiuntiva. (A) Ratti di controllo normali. (B) ratti del gruppo scopolamina. (C) Densità delle cellule caliciformi in ciascun gruppo (20x). Barra nera = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Test di Schirmer I, SIT(Valore medio, unità [mm]) | |||||||
| Gruppo | 0 giorni | 3 giorni | 5 giorni | 7 giorni | 11 giorni | 15 giorni | 19 giorni |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
Tabella 1: Test di Schirmer sui ratti dei quattro gruppi in diversi punti temporali (mm). Dopo l'applicazione del farmaco, la secrezione di lacrime nei ratti è diminuita significativamente.
| Numero | Necrosi | Infiammazione | Edema | Atrofia epiteliale |
| 0 Grp-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7.5 Grp -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7.5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7.5 Grp -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
Tabella 2: Punteggio tissutale patologico della ghiandola lacrimale di ratto. Criteri di punteggio: 0: In condizioni normali, considerando fattori come l'età, il sesso e la tensione dell'animale, il tessuto è considerato normale;
1: I cambiamenti osservati hanno appena superato l'intervallo normale; 2: Si possono osservare lesioni, ma non sono ancora gravi; 3: Le lesioni sono evidenti e continuano a peggiorare; 4: Le lesioni sono estremamente gravi e hanno interessato l'intero tessuto16.
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Discussion
L'occhio secco da carenza acquosa (ADDE) è un importante tipo di occhio secco, che rappresenta circa 1/3 della popolazione totale di occhio secco17 e la causa principale dell'ADDE è il danno patologico e l'infiammazione della ghiandola lacrimale13. Per questo tipo di occhio secco, i metodi di trattamento clinico più comuni sono le lacrime artificiali per alleviare i sintomi o l'applicazione topica di steroidi o ciclosporina18, mentre ci sono poche opzioni di trattamento per i danni alla ghiandola lacrimale. Pertanto, è molto importante esplorare l'impatto della ricostruzione della funzione della ghiandola lacrimale sull'occhio secco e stabilire un modello animale di disfunzione della ghiandola lacrimale. Abbiamo usato un metodo di applicazione ripetuta di farmaci per sopprimere la secrezione della ghiandola lacrimale nei ratti e abbiamo creato un modello animale di occhio secco con disfunzione cronica della ghiandola lacrimale.
Abbiamo scelto i ratti per costruire questo modello di occhio secco, che presenta più vantaggi rispetto ad altri modelli animali19. Ad esempio, i conigli hanno una corporatura più grande e richiedono più dosi di farmaci o iniezioni più frequenti per ottenere l'effetto desiderato. Inoltre, i conigli sono leggermente più costosi, il che significa più costi per l'esperimento. I topi sono anche comunemente usati nella ricerca oftalmica, ma sono generalmente usati per costruire modelli di sindrome di Sjögren20. Questi modelli si concentrano sul confronto dell'infiammazione d'organo e dell'infiltrazione linfocitaria per esplorare i meccanismi immunopatologici. I topi hanno dimensioni corporee ridotte, un'anatomia complessa delle ghiandole lacrimali e una bassa secrezione lacrimale, il che rende difficile riflettere accuratamente la produzione lacrimale. Il modello animale di ratto è un modello di occhio secco più adatto in quanto consente comode iniezioni di farmaci, ha condizioni di alimentazione relativamente semplici, è adatto sia per studi clinici che sperimentali e presenta anche vantaggi in termini di costi. È un buon modello animale per ADDE.
Abbiamo applicato il bloccante del recettore colinergico scopolamina per inibire i recettori colinergici nel corpo del ratto, riducendo la secrezione della ghiandola lacrimale e alterando la struttura patologica delle cellule della ghiandola lacrimale, che simula fondamentalmente lo stato delle ghiandole lacrimali nei pazienti con occhio secco. Rispetto ad altri metodi, questo approccio simula meglio la condizione danneggiata delle ghiandole lacrimali allo stato naturale. Altri metodi, come l'uso di colliri al cloruro di benzalconio21 o l'alterazione delle condizioni esterne come la riduzione dell'umidità e l'aumento dell'evaporazione della superficie oculare 4,8, interrompono solo l'ambiente della superficie oculare e non modificano lo stato funzionale della ghiandola lacrimale. Pertanto, non sono adatti per condizioni di secchezza oculare cronica a lungo termine.
Misurando il volume di secrezione delle lacrime nei ratti, abbiamo migliorato le strisce reattive per le lacrime di Schirmer. Innanzitutto, tagliamo la striscia reattiva lacrimale utilizzata dagli esseri umani lungo la linea centrale. Quindi, abbiamo tagliato la parte superiore a forma di arco rotondo e l'abbiamo delicatamente ripiegata nella parte superiore per facilitare l'inserimento nel sacco congiuntivale inferiore del ratto. Va notato che i ratti sono attivi e difficili da misurare le lacrime per 5 minuti. Dopo aver inserito la striscia reattiva per le lacrime di Schirmer nel sacco congiuntivale inferiore del ratto, abbiamo chiuso manualmente gli occhi del ratto per aumentare il loro comfort ed evitare di lottare durante la lunga misurazione delle lacrime, che potrebbe influenzare i risultati della misurazione.
Durante l'estrazione della ghiandola lacrimale, è necessario prima individuarla. Il punto di localizzazione della ghiandola lacrimale è il punto medio tra la parte anteriore dell'orecchio e il canto interno. Quindi, taglia il tessuto cutaneo sotto la pelliccia, riducendo al minimo l'ingresso di pelliccia frammentata e riducendo il processo di manipolazione nella fase successiva. Durante il processo di estrazione, è anche importante pulire la pelliccia frammentata in modo tempestivo. Soprattutto quando si separa la ghiandola lacrimale, utilizzare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o soluzione salina per risciacquare ripetutamente ed evitare la miscelazione con altri tessuti che potrebbero influire sui risultati del sezionamento.
Il vantaggio del modello animale dell'occhio secco sviluppato è che il protocollo correlava diverse concentrazioni di farmaco con diversi gradi di danno della ghiandola lacrimale. Ciò fornisce una base sperimentale per lo studio del trattamento della disfunzione della ghiandola lacrimale. Abbiamo perfezionato alcune delle fasi operative del processo di modellazione per fornire materiali di riferimento più dettagliati per un ricercatore. Inoltre, abbiamo aggiunto indicatori di analisi per il modello animale dell'occhio secco, incorporando indicatori morfologici della cornea, della congiuntiva e della ghiandola lacrimale, contando le cellule congiuntivali e valutando il grado di lesione della ghiandola lacrimale. È stata valutata la funzione della ghiandola lacrimale da infiammazione, edema e atrofia. Abbiamo scelto i metodi di analisi più completi, economici e accurati per riflettere il grado di secchezza oculare e la disfunzione della ghiandola lacrimale.
Tuttavia, il nostro metodo ha anche alcune limitazioni. A causa del lungo processo di costruzione di modelli animali, gli sperimentatori devono iniettare ripetutamente. Sebbene attualmente esistano alcuni metodi per sostituire le iniezioni manuali, come le pompe per farmaci o i cerotti transdermici, ci sono ancora alcune complicazioni nel loro utilizzo. Come applicare metodi migliori per ridurre la frequenza dei farmaci, evitare l'insorgenza di complicazioni e garantire l'accuratezza del dosaggio è il nostro prossimo obiettivo. In conclusione, abbiamo migliorato un modello animale di occhio secco causato dall'iniezione di scopolamina, fornendo una base sperimentale per la ricerca sulla disfunzione della ghiandola lacrimale nell'ADDE.
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Disclosures
Gli autori non hanno potenziali conflitti di interesse relativi ai farmaci e ai materiali utilizzati in questa procedura.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla Guangdong Provincial High-level Clinical Key Specialties (SZGSP014) e dalla Shenzhen Natural Science Foundation (JCYJ20210324125805012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | SJZ No.4 Pharmaceutical | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoxylin and eosin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D006 | |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | |
| Paraffin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | YA0012 | |
| Periodic Acid-Schiff Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer tear test strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Scopolamine hydrobromide | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Small animal microscope | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 |
References
- Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
- Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133 (2015).
- Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309 (2014).
- Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102 (2021).
- Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
- Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
- Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
- Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
- Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
- Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
- Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
- Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483 (2018).
- Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
- Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
- Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394 (2021).
- Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
- Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
