Summary
Hier stellen we een rattenmodel op van traanklierdisfunctie om een basis te leggen voor de studie van waterdeficiënte droge ogen.
Abstract
Waterige-deficiënte droge ogen (ADDE) is een vorm van droge ogen die kan leiden tot een vermindering van de hoeveelheid en kwaliteit van de traanafscheiding. Langdurige abnormale traanproductie kan leiden tot een verstoring van het oogoppervlak, waaronder beschadiging van het hoornvlies en ontsteking. In ernstige gevallen kan ADDE verlies van gezichtsvermogen of zelfs blindheid veroorzaken. Momenteel is de behandeling van droge ogen beperkt tot oogdruppels of fysiotherapie, die alleen de symptomen van oogongemak kan verlichten en het droge-ogen-syndroom niet fundamenteel kan genezen. Om de functie van de traanklier in droge ogen te herstellen, hebben we een diermodel gemaakt van traanklierdisfunctie bij ratten veroorzaakt door scopolamine. Door de uitgebreide evaluatie van de traanklier, hoornvliezen, bindvlies en andere factoren, streven we ernaar een volledig inzicht te geven in de pathologische veranderingen van ADDE. Vergeleken met het huidige muismodel met droge ogen, bevat dit ADDE-diermodel een functionele evaluatie van de traanklier, wat een beter platform biedt voor het bestuderen van traanklierdisfunctie bij ADDE.
Introduction
In 2021 heeft ongeveer 12% van de mensen aanzienlijk last van drogeogen1, waardoor het een van de meest voorkomende chronische oogziekten is. Droge ogen kunnen worden onderverdeeld in twee soorten: droge ogen met watertekort (ADDE) en droge ogen met verdamping (EDE)2, afhankelijk van de verschillende factoren die de ziekte beïnvloeden. ADDE is verder onderverdeeld in het syndroom van Sjögren (SS) en niet-SS, maar de meerderheid van de patiënten met droge ogen zijn niet-SS-patiënten in klinische3. Chronische symptomen van droge ogen hebben een ernstige invloed op de visuele kwaliteit van patiënten. Momenteel omvat de conventionele behandeling van DED het aanbrengen van kunsttranen om het oogoppervlak te smeren en fysiotherapie van de oogleden. Het droge-ogen-syndroom biedt in veel gevallen echter geen volledige genezing. Daarom is het bestuderen van de pathogenese van droge ogen cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën en medicijnen. Diermodellen van het droge-ogen-syndroom bieden een basis voor verder onderzoek.
Er zijn veel manieren om diermodellen van het droge-ogen-syndroom4 te construeren, waaronder het veranderen van de traansecretieniveaus door de hormoonspiegels te veranderen. Het verwijderen van de teelballen van ratten kan bijvoorbeeld de androgeensecretie verminderen, de traansecretie verhogen en de concentratie van vrije secretoire component (SC) en IgA intranen verlagen. Een andere methode is om auto-immuunreacties in de traanklier aan te geven door de oogoppervlakzenuwen te verwijderen die de klier aansturen. Bovendien kan het direct verminderen van de traanafscheiding worden bereikt door de traanklier operatief te verwijderen7. Veranderende omgevingsomstandigheden kunnen ook de verdamping van tranen versnellen. Het kweken van dieren in omstandigheden met een lage luchtvochtigheid en droge ventilatie kan bijvoorbeeld een model van overmatige verdamping vandroge ogen tot stand brengen8, dat kan worden gecombineerd met andere methoden om de ernst van droge ogen te vergroten. De belangrijkste geneesmiddelen die worden gebruikt om experimentele modellen voor droge ogen te induceren, zijn atropine en scopolamine-9. Als parasympathische remmers kunnen beide farmacologische blokkade van cholinerge (muscarine) receptoren in de traanklier induceren en de traansecretie remmen. Vergeleken met droge ogen veroorzaakt door atropinespierinjectie10, heeft scopolamine een sterker remmend effect op de secretieklieren, een langere duur van de geneesmiddelwerking en zwakkere effecten op hart-, kleine darm- en bronchiale gladde spieren. Het is een van de meest volwassen medicijnen voor diermodellen met droge ogen.
Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt om droge ogen op te wekken met scopolamine, zoals subcutane injectie, medicijnpomp of pleistertoepassing 4,11,12. Om de frequentie van medicijntoediening aan proefdieren te verminderen, brengen veel onderzoekers transdermale pleisters aan op de staarten van muizen of gebruiken ze medicijnpompen. Beide methoden hebben echter beperkingen. Bij de absorptie van transdermale pleisters moet bijvoorbeeld rekening worden gehouden met de individuele absorptie van muizen, wat kan leiden tot een inconsistente dosering van het geneesmiddel. Hoewel medicijnpompen de dosering van elke toediening nauwkeurig kunnen regelen, zijn ze niet altijd compatibel met het medicijn dat wordt toegediend of de concentratie die wordt gebruikt. Ze moeten ook operatief worden geplaatst - wat invasiever is voor het dier, waarvoor een verdoving nodig is, en er is kans op postoperatieve complicaties zoals dehiscentie. Subcutane injectie, hoewel omslachtiger, kan zorgen voor een nauwkeurige dosering voor elke toediening en consistentie in de toediening van geneesmiddelen bij verschillende ratten behouden. Tegelijkertijd heeft het lagere kosten en is het geschikt voor het uitvoeren van een groot aantal dierproeven.
Deze studie past herhaalde subcutane injectie van scopolamine toe om een rattenmodel met droge ogen op te stellen. We analyseren indicatoren voor droge ogen, zoals hoornvliesdefecten, traansecretieniveaus en pathologische morfologie van het hoornvlies, het bindvlies en de traanklier. Door geneesmiddelconcentratie, pathologische manifestaties en symptomen van droge ogen te combineren, werken we het droge-ogen-rattenmodel verder in detail uit, waardoor we nauwkeurigere experimentele gegevens opleveren voor de studie van de behandeling van droge ogen en pathologische mechanismen. We beschrijven het modelleringsproces ook in detail voor toekomstige onderzoekers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven die volgens dit protocol worden uitgevoerd, worden uitgevoerd onder goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Voorbereiding van dieren
- Bereid 12 gezonde vrouwelijke ratten met SPF Wistar van 6 weken oud met een gewicht van 160 g ± 20 g.
- Gebruik een spleetlamp en oftalmoscoop om de oogaandoeningen van alle ratten te onderzoeken en zorg ervoor dat er geen voorste segment- of netvliesaandoeningen zijn.
- Voed alle ratten gedurende 1 week op met voldoende voedsel- en waterbronnen.
- Willekeurig verdeeld alle ratten in normale, scopolamine-geneesmiddelconcentratie 2,5 mg/ml, scopolamine-geneesmiddelconcentratie 5 mg/ml en scopolamine-geneesmiddelconcentratie 7,5 mg/ml, met drie dieren in elke groep.
2. Bereiding van de oplossing
- Bereid scopolaminehydrobromide door het op te lossen in 0.9% natriumchloride-oplossing om een oplossing te maken met concentraties van 7.5 mg/ml, 5 mg/ml en 2.5 mg/ml.
- Bereid een 0,9% natriumchloride-oplossing zonder scopolaminehydrobromide voor gebruik als injectie voor de controlegroep van ratten.
3. Uitrusting en materiaalvoorbereiding
- Maak een microscoop voor kleine dieren.
- Bereid materialen voor het experiment voor, waaronder een wegwerpspuit van 1 ml met naald (26 G); fluoresceïne natrium oogheelkundige strips; Schirmer scheur teststrip; absolute ethanol; 4% paraformaldehyde; Xyleen; neutrale balsem; hematoxyline, eosine; en periodieke zuur-Schiff-kleuringskit.
4. Subcutane injectie
OPMERKING: Deze procedure vereist hulp van een tweede persoon om de ratten te helpen beveiligen.
- Houd het lichaam van de rat stil en vang en strek zijn linker (of rechter) achterpoten.
OPMERKING: Een assistent kan helpen bij het vasthouden van het dier. - Reinig de injectieplaats met alcohol.
- Steek de wegwerpspuit van 1 ml met naald (26 G) aan de basis van de huidplooi tussen duim en vinger.
- Zuig de spuit op door de zuiger van de spuit terug te trekken. Bloed in de spuit duidt op een onjuiste plaatsing van de naald; Verwijder de naald en verplaats deze.
- Dien 0,9% natriumchloride-oplossing met of zonder scopolaminehydrobromide toe in een constante, vloeiende beweging.
- Injecteer alle ratten volgens verschillende concentraties, waarbij elke keer 0,5 ml en vier keer per dag (om 9.00 uur, 12.00 uur, 15.00 uur en 18.00 uur) gedurende een aaneengesloten periode van 19 dagen wordt geïnjecteerd, afwisselend met linker- en rechterledematen.
OPMERKING: De groepen worden als volgt genoemd:
Groep zonder scopolaminehydrobromide: 0 groep (controle)
Groep met scopolaminehydrobromide 2,5 mg/ml: 2,5 groep
Groep met scopolaminehydrobromide 5 mg/ml: groep 5
Groep met scopolaminehydrobromide 7,5 mg/ml: 7,5 groep - Breng het dier terug naar zijn kooi en houd de ademhaling en het gedrag gedurende 5-10 minuten in de gaten.
5. De test van de scheursecretie (Schirmer-traantest, STT)
- Maak een aangepaste strook filterpapier voor ratten11. Knip de helft van de strook filtreerpapier die voor mensen wordt gebruikt langs de middellijn (1 mm × 15 mm) en snijd de kop van de strook af om deze glad te maken.
NOTITIE: Voordat u de traansecretietest uitvoert, moet u het lichaam van de rat handmatig in bedwang houden om beweging te voorkomen en ervoor te zorgen dat de ogen van de rat worden blootgesteld. - Plaats de strook filtreerpapier op de buitenste 1/3 van de conjunctivale zak van het onderste ooglid van de rat.
- Time de test gedurende 5 minuten. Controleer de sluiting van de ogen van de rat tijdens de procedure.
- Gebruik na het meten een pincet om de strook filtreerpapier in een microcentrifugebuisje te klemmen en registreer het traanvolume door een markering op de wand van het buisje te maken.
- Meet de traanafscheiding op dag 0, dag 1, dag 3, dag 5, dag 7, dag 11, dag 15 en dag 19.
6. Hoornvliesfluoresceïnekleuring
- Laat 0,5 μl 0,5% fluoresceïnenatriumoplossing in de inferieure conjunctivale zak van elke rat vallen.
- Observeer het hoornvlies onder blauw licht gedurende 3 minuten na fluoresceïne-instillatie.
- Noteer de fluorescentiekleuring van het hoornvlies van elke rat en observeer of er een hoornvliesdefect is.
- Voer corneafluoresceïnekleuring uit op dag 0, dag 1, dag 3, dag 5, dag 7, dag 11, dag 15 en dag 19.
7. Histologische observatie van conjunctivaal weefsel
- Na voltooiing van de modelontwikkeling verdooft u de ratten diep met een intraperitoneale injectie van 0,4 ml/100 g 10% waterig chloraalhydraat om de spanning van de dieren te verlichten. Euthanaseer vervolgens de ratten door cervicale dislocatie.
- Neem het bulbaire bindvlies uit dezelfde regio's van elke rat, met een grootte van ongeveer 2 mm x 2 mm.
- Fixeer de weefsels onmiddellijk in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur en veranker ze in paraffine13.
- Snijd secties met een dikte van 5 μm en beits ze met hematoxyline en eosine (HE)14 en periodieke zuur-Schiff (PAS)-kleuring (volg de instructies van de fabrikant).
8. Histologische observatie van hoornvlies- en traanklierweefsel
- Na voltooiing van de modelontwikkeling euthanaseert u de rat zoals beschreven in stap 7.1.
- Neem het hoornvlies aan de rechterkant van elke rat en fixeer het onmiddellijk in 4% paraformaldehyde-oplossing.
- Snijd de cephalische epidermis en het onderhuidse weefsel langs de lijn die het oor en de buitenste ooghoek verbindt, breid de incisie naar beide zijden uit en isoleer de gelige extra orbitale klier verder.
- Verwijder de vacht van de rat grondig en scheid de extraorbitale klier met 0,9% natriumchloride-oplossing.
- Plaats de geïsoleerde extraorbitale klieren gedurende 24 uur in een 4% paraformaldehyde-oplossing en veranker ze in paraffine.
- Snijd doorlopende secties van ~5 μm dikte en kleurs ze met HE voor hoornvlies- en extraorbitale klierweefselmonsters.
9. Statistische analyse
- Gebruik geschikte software voor statistische analyse van de gegevens.
- Voer eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) uit om de gegevens te analyseren en de minst significante verschiltest (LSD) voor vergelijking tussen groepen. Stel het statistische significantieniveau in op α = 0,05, waarbij P < 0,05 statistische significantie aangeeft.
OPMERKING: SPSS 20-software werd gebruikt voor statistische analyse van de experimentele gegevens.
- Voer eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) uit om de gegevens te analyseren en de minst significante verschiltest (LSD) voor vergelijking tussen groepen. Stel het statistische significantieniveau in op α = 0,05, waarbij P < 0,05 statistische significantie aangeeft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schirmer I test, SIT I
Het traanvolume van de ratten werd gemeten op dag 0, 3, 5, 7, 11, 15 en 19 na de start van het experiment. De experimentele resultaten toonden aan dat de traansecretie van de scopolaminegroep (2,5 groep, 5 groep, 7,5 groep), vergeleken met de controlegroep (0 groep), significant was afgenomen en dat het verschil statistisch significant was (P < 0,01). Er was geen statistische significantie tussen de 2,5-groep, de 5-groep en de 7,5-groep (P > 0,05). Er werd geen significant verschil waargenomen tussen de verschillende groepen wat betreft het aantal dagen (P > 0,05) (Figuur 1, Tabel 1).
Hoornvliesfluoresceïnekleuring
Corneafluoresceïnekleuring werd uitgevoerd op dag 0, 3, 5, 7, 11, 15 en 19 van het experiment. De resultaten toonden aan dat er in geen enkele groep fluoresceïnekleuring in het hoornvlies was, wat aangeeft dat er geen duidelijke cornea-epitheeldefecten werden gevormd tijdens het 20-daagse experiment met verschillende concentraties scopolaminegeneesmiddelen (Figuur 2).
Pathologische analyse van hoornvliesepitheel
Na het experiment werden hoornvliesweefsels van elke rat verzameld voor HE-kleuring om de morfologie van het hoornvliesepitheel te observeren en de dikte van de hoornvliesepitheellaag te meten. Het hoornvliesepitheel van de controlegroep bestond uit 4-6 lagen ordelijk gerangschikte epitheelcellen, waaronder de basale laag bestond uit een enkele laag zuilvormige epitheelcellen die netjes en dicht bij elkaar waren gerangschikt. Het hoornvliesepitheel van de scopolaminegroepen 2,5, 5 en 7 was significant dunner dan de controlegroep, met afgeplatte en atrofische celmorfologie en ongeordende celstructuur. In groep 7.5 was er een losse intercellulaire verbinding en vacuolaire structuur in de basale laag (aangegeven door de rode pijl in figuur 3). Vergeleken met het hoornvliesepitheel van scopolaminegroepen, vertoonde het hoornvliesepitheel van de normale controlegroep statistische verschillen in de dikte van de hoornvliesepitheellaag (figuur 4).
Pathologische analyse van de traanklier
De belangrijkste klier voor traanafscheiding bij ratten is de extrorbitale traanklier15. Bij het observeren van plakjes traanklier werden veranderingen in de morfologie van de epitheelcellen van de traanklier waargenomen met de toename van de scopolamineconcentratie, vergezeld van ontsteking en weefseloedeem. Dergelijke veranderingen werden niet waargenomen in de controlegroep. De pathologieresultaten suggereren dat inflammatoire veranderingen van de traanklier, celoedeem en atrofie van de klierepitheelcellen kunnen worden gebruikt als indicatoren voor functionele schade aan de traanklier16 (tabel 2). Deze indicatoren kunnen worden gebruikt om de ernst van droge ogen te meten in relatie tot de hoeveelheid traanafscheiding (Figuur 5).
Analyse van conjunctivale kleuringsresultaten
De structuur van het bindvlies in de controlegroep is compleet, voornamelijk samengesteld uit de oppervlaktelaag en de lamina propria. De oppervlaktelaag bestaat uit gelamineerde zuilvormige epitheelcellen, glad en compleet, met microvilli op het celoppervlak. Verspreide bekercellen waren aanwezig tussen de epitheelcellen, met een groot celvolume en slijmkorrels in het celcytoplasma. De oppervlaktelaag van het conjunctivale epitheel in de drie scopolaminegroepen was aanzienlijk dunner, het aantal microvilli en bekercellen was verminderd, de structuur van de celrangschikking was onvolledig, vergezeld van oedeem, en een kleine hoeveelheid ontstekingscellen zoals waargenomen bij HE-kleuring (Figuur 6).
Door het bindvlies te kleuren met PAS, werd het gemiddelde aantal bekercellen per 40x microscopisch veld in drie onafhankelijke monsters van elke muis berekend en uitgedrukt als gemiddelde ± SD (Figuur 7).
Figuur 1: Statistieken van de Schirmer-testwaarde in elke groep (mm) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fluoresceïnenatriumkleuring van het hoornvlies van ratten. In het 20-daagse experiment met fluoresceïnenatrium werden geen positieve bevindingen waargenomen in de hoornvliezen van alle ratten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kleuring en diktemeting van het hoornvliesepitheel. In groep 7.5 was er sprake van een losse intercellulaire verbinding en vacuolaire structuur in de basale laag (aangegeven door de rode pijl) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Statistieken van de dikte van het hoornvliesepitheel in elke groep. Vergeleken met het hoornvliesepitheel van scopolaminegroepen, vertoonde het hoornvliesepitheel van de normale controlegroep statistische verschillen in de dikte van de hoornvliesepitheellaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: HE-kleuringsresultaten van de extrorbitale traanklier van ratten. (A) Groep 0: In het gezichtsveld vertoonden de traanklieren een lobulaire structuur en waren ze samengesteld uit kanalen en buisvormige klieren, zonder duidelijke afwijkingen in de morfologie van de kanalen, terwijl de buisvormige klieren waren samengesteld uit kegelvormige kliercellen met overvloedige slijmstoffen in het cytoplasma; Geen duidelijk oedeem in bindweefsel, geen duidelijke afwijkingen in interstitiële bloedvaten en geen duidelijke necrose en infiltratie van ontstekingscellen. (B) Groep 2.5: In het gezichtsveld wordt incidentele atrofie van de epitheelcellen van de traanklier waargenomen, met verminderd volume, onregelmatig gevormde verwijde klierholten en verminderde slijmerige substantie in de holte (aangegeven met de rode pijl). Er is ook af en toe infiltratie van vrije lymfocyten in het stroma (aangegeven door de blauwe pijl), maar er worden geen duidelijke afwijkingen in de kanaalmorfologie of tekenen van oedeem waargenomen. (C) Groep 5: In het gezichtsveld werden traanepitheelcellen af en toe geatrofieerd en verkleind, de klierholte werd vergroot, de slijmerige substantie in de holte werd verkleind (rode pijl) en vrije lymfocytinfiltratie werd af en toe waargenomen in het stroma (blauwe pijl), en er worden geen duidelijke afwijkingen in de kanaalmorfologie of bindweefseloedeem tussen traanklierlobben waargenomen. (D) Groep 7.5: Oedeem is te zien in het gezichtsveld; de afstand tussen de traanklieren wordt verbreed en de opstelling is onregelmatig (groene pijl), de epitheelcellen van de traanklieren zijn vaak geatrofieerd, het volume wordt kleiner en de vorm is onregelmatig (gele pijl), af en toe wordt de klierholte vergroot, de slijmvliezen in de holte worden verminderd (rode pijl), af en toe wordt de vrije lymfocyt geïnfiltreerd (blauwe pijl), zonder duidelijke afwijkingen in de kanaalmorfologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: HE-kleuring van het bindvlies van de rat. Vergeleken met het conjunctivale epitheel van de controlegroep, vertoonden alle drie de groepen van scopolamine-gemedicineerd conjunctivaal epitheel verschillende gradaties van structurele schade. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: PAS-kleuring van het bindvlies. (A) Normale controleratten. B) ratten uit de scopolaminegroep. (C) Bekerceldichtheid in elke groep (20x). Zwarte balk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Schirmer I-test, SIT (gemiddelde waarde, eenheid [mm]) | |||||||
| Groep | 0 dagen | 3 dagen | 5 dagen | 7 dagen | 11 dagen | 15 dagen | 19 dagen |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
Tabel 1: Schirmer-test van ratten in de vier groepen op verschillende tijdstippen (mm). Na het aanbrengen van medicatie nam de afscheiding van tranen bij ratten aanzienlijk af.
| Getal | Necrose | Ontsteking | Oedeem | Epitheliale atrofie |
| 0 Grp-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Polyester -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2.5 Polyester -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Polyester -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7.5 Polyester -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7.5 Polyester -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7.5 Polyester -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
Tabel 2: Pathologische weefselscore van de traanklier van de rat. Scoringscriteria: 0: Onder normale omstandigheden, rekening houdend met factoren zoals leeftijd, geslacht en stam van het dier, wordt het weefsel als normaal beschouwd;
1: De waargenomen veranderingen hebben net het normale bereik overschreden; 2: Laesies kunnen worden waargenomen, maar ze zijn nog niet ernstig; 3: Laesies zijn duidelijk en blijven verergeren; 4: Laesies zijn extreem ernstig en hebben het hele weefsel aangetast16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Waterige-deficiënte droge ogen (ADDE) is een belangrijk type droge ogen, goed voor ongeveer 1/3 van de totale populatie droge ogen17, en de belangrijkste oorzaak van ADDE is pathologische schade en ontsteking van de traanklier13. Voor dit type droge ogen zijn de meest gebruikelijke klinische behandelingsmethoden kunstmatige tranen om de symptomen te verlichten of plaatselijke toepassing van steroïden of ciclosporine18, terwijl er weinig behandelingsopties zijn voor schade aan de traanklier. Daarom is het erg belangrijk om de impact van de reconstructie van de traanklierfunctie op droge ogen te onderzoeken en een diermodel van traanklierdisfunctie op te stellen. We gebruikten een methode van herhaalde toepassing van medicatie om de afscheiding van de traanklier bij ratten te onderdrukken en creëerden een diermodel met chronische traanklierdisfunctie met droge ogen.
We kozen ratten om dit droge-ogenmodel te bouwen, dat meer voordelen heeft in vergelijking met andere diermodellen19. Konijnen hebben bijvoorbeeld een grotere lichaamsgrootte en hebben meer doses medicatie of frequentere injecties nodig om het gewenste effect te bereiken. Bovendien zijn konijnen iets duurder, wat meer kosten voor het experiment betekent. Muizen worden ook vaak gebruikt in oogheelkundig onderzoek, maar ze worden over het algemeen gebruikt om modellen voor het syndroom van Sjögren te construeren20. Deze modellen richten zich op het vergelijken van orgaanontsteking en lymfocytinfiltratie om de immunopathologische mechanismen te onderzoeken. Muizen hebben een kleine lichaamsgrootte, een complexe anatomie van de traanklier en een lage traanafscheiding, waardoor het moeilijk is om de traanproductie nauwkeurig weer te geven. Het rattendiermodel is een geschikter model voor droge ogen omdat het gemakkelijke medicijninjecties mogelijk maakt, relatief eenvoudige voedingsomstandigheden heeft, geschikt is voor zowel klinische als experimentele onderzoeken en ook voordelen heeft op het gebied van kosten. Het is een goed diermodel voor ADDE.
We pasten de cholinerge receptorblokker scopolamine toe om de cholinerge receptoren in het lichaam van de rat te remmen, de traankliersecretie te verminderen en de pathologische structuur van traankliercellen te veranderen, wat fundamenteel de toestand van traanklieren bij patiënten met droge ogen simuleert. In vergelijking met andere methoden simuleert deze aanpak beter de beschadigde toestand van traanklieren in een natuurlijke staat. Andere methoden, zoals het gebruik van oogdruppels met benzalkoniumchloride21 of het veranderen van externe omstandigheden zoals het verlagen van de luchtvochtigheid en het verhogen van de verdamping van het oogoppervlak 4,8, verstoren alleen het oogoppervlak en veranderen de functionele toestand van de traanklier niet. Daarom zijn ze niet geschikt voor langdurige, chronische droge ogen.
Bij het meten van het secretievolume van tranen bij ratten hebben we de Schirmer-traanteststrips verbeterd. Eerst snijden we de scheurteststrip die door mensen wordt gebruikt langs de middellijn. Vervolgens hebben we de bovenkant in een ronde boogvorm geknipt en voorzichtig aan de bovenkant teruggevouwen om het gemakkelijk in de onderste conjunctivale zak van de rat te kunnen inbrengen. Opgemerkt moet worden dat ratten actief zijn en moeilijk om tranen gedurende 5 minuten te meten. Nadat we de Schirmer-traanteststrip in de onderste conjunctivale zak van de rat hadden ingebracht, sloten we de ogen van de rat handmatig om hun comfort te vergroten en te voorkomen dat ze worstelen tijdens de lange meting van tranen, wat de meetresultaten kan beïnvloeden.
Bij het extraheren van de traanklier is het noodzakelijk om deze eerst te lokaliseren. Het punt van traanklierlokalisatie is het middelpunt tussen de voorkant van het oor en de binnenste canthus. Snijd vervolgens het huidweefsel onder de vacht, waardoor het binnendringen van gefragmenteerde vacht tot een minimum wordt beperkt en het hanteringsproces in een later stadium wordt verminderd. Tijdens het extractieproces is het ook belangrijk om de gefragmenteerde vacht tijdig op te ruimen. Gebruik vooral bij het scheiden van de traanklier fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of zoutoplossing om herhaaldelijk te spoelen en vermijd vermenging met andere weefsels die de resultaten van de secties kunnen beïnvloeden.
Het voordeel van het ontwikkelde diermodel met droge ogen is dat het protocol verschillende geneesmiddelconcentraties correleerde met verschillende gradaties van traanklierletsel. Dit biedt een experimentele basis voor de studie van de behandeling van traanklierdisfunctie. We hebben enkele van de operationele stappen in het modelleringsproces verfijnd om een onderzoeker gedetailleerder referentiemateriaal te bieden. Daarnaast hebben we analyse-indicatoren toegevoegd voor het diermodel met droge ogen, met morfologische indicatoren van het hoornvlies, het bindvlies en de traanklier, het tellen van conjunctivale cellen en het scoren van de mate van traanklierletsel. We evalueerden de traanklierfunctie van ontsteking, oedeem en atrofie. We hebben de meest uitgebreide, kosteneffectieve en nauwkeurige analysemethoden gekozen om de mate van droge ogen en traanklierdisfunctie weer te geven.
Onze methode heeft echter ook bepaalde beperkingen. Vanwege het langdurige proces van het construeren van diermodellen, moeten experimentatoren herhaaldelijk injecteren. Hoewel er momenteel enkele methoden zijn om handmatige injecties te vervangen, zoals medicijnpompen of transdermale pleisters, zijn er nog steeds enkele complicaties bij het gebruik ervan. Hoe we betere methoden kunnen toepassen om de frequentie van medicatie te verminderen, het optreden van complicaties te voorkomen en de nauwkeurigheid van de dosering te garanderen, is ons volgende doel. Concluderend hebben we een diermodel met droge ogen verbeterd dat wordt veroorzaakt door scopolamine-injectie, wat een experimentele basis biedt voor onderzoek naar traanklierdisfunctie bij ADDE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen potentiële belangenconflicten met betrekking tot de medicijnen en materialen die in deze procedure worden gebruikt.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door Guangdong Provincial High-level Clinical Key Specialties (SZGSP014) en Shenzhen Natural Science Foundation (JCYJ20210324125805012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | SJZ No.4 Pharmaceutical | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoxylin and eosin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D006 | |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | |
| Paraffin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | YA0012 | |
| Periodic Acid-Schiff Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer tear test strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Scopolamine hydrobromide | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Small animal microscope | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 |
References
- Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
- Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133 (2015).
- Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309 (2014).
- Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102 (2021).
- Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
- Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
- Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
- Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
- Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
- Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
- Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
- Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483 (2018).
- Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
- Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
- Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394 (2021).
- Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
- Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
