Summary
Hier etablieren wir ein Rattenmodell der Tränendrüsendysfunktion, um eine Grundlage für die Untersuchung des wässrig-defizienten trockenen Auges zu schaffen.
Abstract
Das wässrig-defiziente trockene Auge (ADDE) ist eine Art von Erkrankung des trockenen Auges, die zu einer Verringerung der Quantität und Qualität der Tränensekretion führen kann. Eine längere abnormale Tränenproduktion kann zu einer Störung der Augenoberfläche führen, einschließlich Hornhautschäden und Entzündungen. In schweren Fällen kann ADDE zu Sehverlust oder sogar Erblindung führen. Derzeit beschränkt sich die Behandlung des trockenen Auges auf Augentropfen oder Physiotherapie, die nur die Symptome von Augenbeschwerden lindern und das Syndrom des trockenen Auges nicht grundlegend heilen können. Um die Funktion der Tränendrüse bei trockenem Auge wiederherzustellen, haben wir ein Tiermodell der durch Scopolamin induzierten Tränendrüsenfunktionsstörung bei Ratten erstellt. Durch die umfassende Bewertung der Tränendrüse, der Hornhaut, der Bindehaut und anderer Faktoren wollen wir ein vollständiges Verständnis der pathologischen Veränderungen der ADDE vermitteln. Im Vergleich zum aktuellen Mausmodell für trockene Augen enthält dieses ADDE-Tiermodell eine funktionelle Bewertung der Tränendrüse und bietet eine bessere Plattform für die Untersuchung der Tränendrüsenfunktionsstörung bei ADDE.
Introduction
Bis 2021 sind etwa 12 % der Menschen erheblich von trockenen Augenbetroffen 1, was sie zu einer der häufigsten chronischen Augenkrankheiten macht. Trockenes Auge kann in zwei Arten unterteilt werden: Kammerwassermangel trockenes Auge (ADDE) und verdunstungsarmes trockenes Auge (EDE)2, abhängig von den verschiedenen Faktoren, die die Krankheit beeinflussen. ADDE wird weiter in Sjögren-Syndrom (SS) und Nicht-SS unterteilt, aber die Mehrheit der Patienten mit trockenem Auge sind Nicht-SS-Patienten in Klinik3. Chronische Symptome des trockenen Auges beeinträchtigen die Sehqualität der Patienten erheblich. Derzeit umfasst die konventionelle Behandlung von DED die Anwendung künstlicher Tränen zur Befeuchtung der Augenoberfläche und die physikalische Therapie der Augenlider. Das Syndrom des trockenen Auges bietet jedoch in vielen Fällen möglicherweise keine vollständige Heilung. Daher ist die Untersuchung der Pathogenese des trockenen Auges für die Entwicklung neuer Therapien und Medikamente von entscheidender Bedeutung. Tiermodelle des Syndroms des trockenen Auges bilden eine Grundlage für weitere Forschungen.
Es gibt viele Möglichkeiten, Tiermodelle für das Syndrom des trockenen Auges4 zu konstruieren, einschließlich der Änderung der Tränensekretion durch Veränderung des Hormonspiegels. Beispielsweise kann das Entfernen der Hoden von Ratten die Androgensekretion reduzieren, die Tränensekretion erhöhen und die Konzentration der freien sekretorischen Komponente (SC) und IgA in Tränen verringern 5,6. Eine andere Methode besteht darin, Autoimmunreaktionen in der Tränendrüse anzuzeigen, indem die Nerven der Augenoberfläche entfernt werden, die die Drüse steuern. Zusätzlich kann eine direkte Reduzierung der Tränensekretion durch chirurgische Entfernung der Tränendrüseerreicht werden 7. Wechselnde Umgebungsbedingungen können auch die Tränenverdunstung beschleunigen. Beispielsweise kann die Kultivierung von Tieren bei niedriger Luftfeuchtigkeit und trockener Belüftung ein Modell für übermäßige Verdunstung des trockenen Auges8 erstellen, das mit anderen Methoden kombiniert werden kann, um den Schweregrad des trockenen Auges zu erhöhen. Die wichtigsten Medikamente, die zur Induktion von experimentellen Modellen für trockene Augen verwendet werden, sind Atropin und Scopolamin9. Als parasympathische Inhibitoren können beide eine pharmakologische Blockade cholinerger (muskarinischer) Rezeptoren in der Tränendrüse induzieren und die Tränensekretion hemmen. Im Vergleich zu trockenen Augen, die durch Atropin-Muskelinjektion verursacht werden10, hat Scopolamin eine stärkere hemmende Wirkung auf die Sekretdrüsen, eine längere Wirkungsdauer des Arzneimittels und eine schwächere Wirkung auf die glatte Herz-, Darm- und Bronchialmuskulatur. Es ist eines der ausgereiftesten Medikamente für Tiermodelle mit trockenen Augen.
Es können verschiedene Methoden verwendet werden, um trockene Augen mit Scopolamin zu induzieren, wie z. B. subkutane Injektion, Medikamentenpumpe oder Pflasteranwendung 4,11,12. Um die Häufigkeit der Medikamentenverabreichung an Versuchstiere zu reduzieren, bringen viele Forscher transdermale Pflaster an den Schwänzen von Mäusen an oder verwenden Medikamentenpumpen. Beide Methoden haben jedoch Einschränkungen. Beispielsweise muss die Resorption von transdermalen Pflastern die individuelle Resorption von Mäusen berücksichtigen, was zu einer inkonsistenten Medikamentendosierung führen kann. Obwohl Medikamentenpumpen die Dosierung jeder Verabreichung genau steuern können, sind sie nicht immer mit dem verabreichten Medikament oder der verwendeten Konzentration kompatibel. Sie müssen auch chirurgisch platziert werden – was für das Tier invasiver ist, eine Anästhesie erfordert und es besteht die Möglichkeit von postoperativen Komplikationen wie Dehiszenz. Die subkutane Injektion ist zwar umständlicher, kann aber eine genaue Dosierung für jede Verabreichung sicherstellen und die Konsistenz der Arzneimittelverabreichung bei verschiedenen Ratten aufrechterhalten. Gleichzeitig hat es geringere Kosten und eignet sich für die Durchführung einer Vielzahl von Tierversuchen.
In dieser Studie wird wiederholte subkutane Injektion von Scopolamin angewendet, um ein Rattenmodell mit trockenem Auge zu etablieren. Wir analysieren Indikatoren für trockene Augen wie Hornhautdefekte, Tränensekretion und pathologische Morphologie der Hornhaut, der Bindehaut und der Tränendrüse. Durch die Kombination von Arzneimittelkonzentration, pathologischen Manifestationen und Symptomen des trockenen Auges führen wir das Modell der Ratte mit trockenen Augen weiter im Detail aus und liefern genauere experimentelle Daten für die Untersuchung der Behandlung des trockenen Auges und pathologischer Mechanismen. Wir beschreiben auch den Modellierungsprozess für zukünftige Forscher im Detail.
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Protocol
Alle Tierversuche, die nach diesem Protokoll durchgeführt werden, werden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt.
1. Tierische Vorbereitung
- Bereiten Sie 12 gesunde, 6 Wochen alte Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 160 g ± 20 g vor.
- Verwenden Sie eine Spaltlampe und ein Ophthalmoskop, um den Augenzustand aller Ratten zu untersuchen und sicherzustellen, dass keine Erkrankungen des vorderen Augenabschnitts oder der Netzhaut vorliegen.
- Ziehen Sie alle Ratten 1 Woche lang mit ausreichenden Nahrungs- und Wasserquellen auf.
- Alle Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in normale Gruppen mit einer Scopolamin-Wirkstoffkonzentration von 2,5 mg / ml, einer Scopolamin-Wirkstoffkonzentration von 5 mg / ml und einer Scopolamin-Wirkstoffkonzentration von 7,5 mg / ml mit drei Tieren in jeder Gruppe eingeteilt.
2. Vorbereitung der Lösung
- Bereiten Sie Scopolamin Hydrobromid vor, indem Sie es in 0,9% iger Natriumchloridlösung auflösen, um eine Lösung mit Konzentrationen von 7,5 mg/ml, 5 mg/ml und 2,5 mg/ml herzustellen.
- Bereiten Sie eine 0,9% ige Natriumchloridlösung ohne Scopolaminhydrobromid vor, die als Injektion für die Kontrollgruppe von Ratten verwendet wird.
3. Ausrüstungs- und Materialvorbereitung
- Bereiten Sie ein Kleintiermikroskop vor.
- Bereiten Sie Materialien für das Experiment vor, einschließlich 1 ml Einwegspritze mit Nadel (26 g); Fluorescein-Natrium-Augenstreifen; Schirmer-Tränenteststreifen; absolutes Ethanol; 4% Paraformaldehyd; Xylol; neutraler Balsam; Hämatoxylin, Eosin; und periodisches Säure-Schiff-Färbekit.
4. Subkutane Injektion
HINWEIS: Dieses Verfahren erfordert die Unterstützung einer zweiten Person, um die Ratten zu sichern.
- Halten Sie den Körper der Ratte ruhig und fangen und strecken Sie ihre linken (oder rechten) Hinterbeine.
HINWEIS: Ein Assistent kann beim Halten des Tieres helfen. - Injektionsstelle mit Alkohol reinigen.
- Führen Sie 1 ml Einmalspritze mit Nadel (26 g) an der Basis der Hautfalte zwischen Daumen und Finger ein.
- Saugen Sie die Spritze an, indem Sie den Spritzenkolben zurückziehen. Jegliches Blut in der Spritze weist auf eine unsachgemäße Platzierung der Nadel hin; Entfernen Sie die Nadel und positionieren Sie sie neu.
- Verabreichen Sie 0,9% ige Natriumchloridlösung mit oder ohne Scopolaminhydrobromid in einer gleichmäßigen, flüssigen Bewegung.
- Injizieren Sie alle Ratten in unterschiedlichen Konzentrationen, wobei jedes Mal und viermal täglich (um 9:00, 12:00, 15:00 und 18:00 Uhr) über einen aufeinanderfolgenden Zeitraum von 19 Tagen abwechselnd 0,5 ml injiziert werden.
HINWEIS: Die Gruppen werden wie folgt benannt:
Gruppe ohne Scopolamin Hydrobromid: 0 Gruppe (Kontrolle)
Gruppe mit Scopolamin Hydrobromid 2,5 mg/ml: 2,5 Gruppe
Gruppe mit Scopolamin Hydrobromid 5 mg/ml: 5 Gruppe
Gruppe mit Scopolamin Hydrobromid 7,5 mg/ml: 7,5 Gruppe - Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und überwachen Sie Atmung und Verhalten für 5-10 Minuten.
5. Tränensekretionstest (Schirmer-Tränentest, STT)
- Erstellen Sie einen modifizierten Filterpapierstreifen für Ratten11. Schneiden Sie die Hälfte des für den Menschen verwendeten Filterpapierstreifens entlang der Mittellinie (1 mm × 15 mm) ab und schneiden Sie den Kopf des Streifens ab, um ihn glatt zu machen.
HINWEIS: Halten Sie vor der Durchführung des Tränensekretionstests den Körper der Ratte manuell fest, um Bewegungen zu verhindern und sicherzustellen, dass die Augen der Ratte freigelegt werden. - Legen Sie den Filterpapierstreifen auf das äußere 1/3 des Bindehautsacks des unteren Augenlids der Ratte.
- Planen Sie den Test für 5 Minuten. Kontrollieren Sie das Schließen der Augen der Ratte während des gesamten Eingriffs.
- Klemmen Sie den Filterpapierstreifen nach der Messung mit einer Pinzette in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zeichnen Sie das Tränenvolumen auf, indem Sie eine Markierung an der Wand des Röhrchens anbringen.
- Messen Sie die Tränensekretion an Tag 0, Tag 1, Tag 3, Tag 5, Tag 7, Tag 11, Tag 15 und Tag 19.
6. Hornhaut-Fluorescein-Färbung
- Tropfen Sie 0,5 μl 0,5%ige Fluorescein-Natriumlösung in den unteren Bindehautsack jeder Ratte.
- Beobachten Sie die Hornhaut nach der Fluorescein-Instillation 3 Minuten lang unter blauem Licht.
- Zeichnen Sie die Fluoreszenzfärbung der Hornhaut jeder Ratte auf und beobachten Sie, ob ein Hornhautdefekt vorliegt.
- Führen Sie die Hornhautfluoreszeinfärbung an Tag 0, Tag 1, Tag 3, Tag 5, Tag 7, Tag 11, Tag 15 und Tag 19 durch.
7. Histologische Betrachtung des Bindehautgewebes
- Nach Abschluss der Modellentwicklung werden die Ratten mit einer intraperitonealen Injektion von 0,4 ml/100 g 10% wässrigem Chloralhydrat tief betäubt, um die Verspannungen der Tiere zu lindern. Dann die Ratten durch Zervixluxation einschläfern.
- Nehmen Sie die bulbäre Bindehaut aus den gleichen Regionen jeder Ratte mit einer Größe von ca. 2 mm x 2 mm.
- Fixieren Sie das Gewebe sofort 24 h lang in 4% Paraformaldehyd und betten Sie es in Paraffin13 ein.
- Schneiden Sie 5 μm dicke Abschnitte und färben Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin (HE)14 und periodischer Säure-Schiff (PAS)-Färbung (befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers).
8. Histologische Betrachtung von Hornhaut- und Tränendrüsengewebe
- Nach Abschluss der Modellentwicklung wird die Ratte wie in Schritt 7.1 beschrieben eingeschläfert.
- Nehmen Sie die Hornhaut auf der rechten Seite jeder Ratte und fixieren Sie sie sofort in 4% iger Paraformaldehydlösung.
- Schneiden Sie die cephale Epidermis und das Unterhautgewebe entlang der Linie, die das Ohr und den äußeren Augenwinkel verbindet, erweitern Sie den Schnitt zu beiden Seiten und isolieren Sie die gelbliche Extraorbitaldrüse weiter.
- Entfernen Sie das Fell der Ratte gründlich und trennen Sie die extraorbitale Drüse mit 0,9% iger Natriumchloridlösung.
- Legen Sie die isolierten extraorbitalen Drüsen für 24 h in 4%ige Paraformaldehydlösung und betten Sie sie in Paraffin ein.
- Schneiden Sie durchgehende Abschnitte von ~5 μm Dicke und färben Sie sie mit HE für Hornhaut- und extraorbitale Drüsengewebeproben.
9. Statistische Auswertung
- Verwenden Sie geeignete Software für die statistische Analyse der Daten.
- Führen Sie eine unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) durch, um die Daten zu analysieren, und den LSD-Test (Least Significant Difference) für den Vergleich zwischen Gruppen. Legen Sie das statistische Signifikanzniveau auf α = 0,05 fest, wobei P < 0,05 die statistische Signifikanz angibt.
HINWEIS: Für die statistische Analyse der experimentellen Daten wurde die SPSS 20-Software verwendet.
- Führen Sie eine unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) durch, um die Daten zu analysieren, und den LSD-Test (Least Significant Difference) für den Vergleich zwischen Gruppen. Legen Sie das statistische Signifikanzniveau auf α = 0,05 fest, wobei P < 0,05 die statistische Signifikanz angibt.
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Representative Results
Schirmer I test, SIT I
Das Tränenvolumen der Ratten wurde an den Tagen 0, 3, 5, 7, 11, 15 und 19 nach Beginn des Experiments gemessen. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die Tränensekretion der Scopolamin-Gruppe (2,5-Gruppe, 5-Gruppe, 7,5-Gruppe) im Vergleich zur Kontrollgruppe (0-Gruppe) signifikant verringert war und der Unterschied statistisch signifikant war (P < 0,01). Es gab keine statistische Signifikanz zwischen der 2,5-Gruppe, der 5-Gruppe und der 7,5-Gruppe (P > 0,05). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den verschiedenen Gruppen in Bezug auf die Anzahl der Tage (P > 0,05) (Abbildung 1, Tabelle 1).
Hornhaut-Fluoreszein-Färbung
Die Hornhautfluoreszeinfärbung wurde an den Tagen 0, 3, 5, 7, 11, 15 und 19 des Experiments durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass es in keiner Gruppe eine Hornhautfluoresceinfärbung gab, was darauf hindeutet, dass während des 20-tägigen Experiments mit unterschiedlichen Konzentrationen von Scopolamin-Medikamenten keine offensichtlichen Hornhautepitheldefekte gebildet wurden (Abbildung 2).
Pathologische Analyse des Hornhautepithels
Nach dem Experiment wurde Hornhautgewebe von jeder Ratte für die HE-Färbung gesammelt, um die Morphologie des Hornhautepithels zu beobachten und die Dicke der Hornhautepithelschicht zu messen. Das Hornhautepithel der Kontrollgruppe bestand aus 4-6 Schichten geordnet angeordneter Epithelzellen, von denen die Basalschicht aus einer einzigen Schicht von Säulenepithelzellen bestand, die sauber und dicht angeordnet waren. Das Hornhautepithel der Scopolamin-Gruppen 2,5, 5 und 7 war signifikant dünner als das der Kontrollgruppe, mit abgeflachter und atrophischer Zellmorphologie und ungeordneter Zellstruktur. In Gruppe 7.5 gab es eine lockere interzelluläre Verbindung und vakuoläre Struktur in der Basalschicht (gekennzeichnet durch den roten Pfeil in Abbildung 3). Im Vergleich zum Hornhautepithel der Scopolamin-Gruppen zeigte das Hornhautepithel der normalen Kontrollgruppe statistische Unterschiede in der Dicke der Hornhautepithelschicht (Abbildung 4).
Pathologische Analyse der Tränendrüse
Die Hauptdrüse für die Tränensekretion bei Ratten ist die extrorbitale Tränendrüse15. Bei der Beobachtung von Tränendrüsenschnitten wurden Veränderungen in der Morphologie der Tränendrüsenepithelzellen mit zunehmender Scopolaminkonzentration beobachtet, begleitet von Entzündungen und Gewebeödemen. In der Kontrollgruppe wurden keine solchen Veränderungen beobachtet. Die pathologischen Ergebnisse deuten darauf hin, dass entzündliche Veränderungen der Tränendrüse, Zellödeme und Atrophie der Drüsenepithelzellen als Indikatoren für eine funktionelle Schädigung der Tränendrüse verwendet werden können16 (Tabelle 2). Diese Indikatoren können verwendet werden, um den Schweregrad des trockenen Auges in Bezug auf die Menge der Tränensekretion zu messen (Abbildung 5).
Analyse der Ergebnisse der Bindehautfärbung
Die Struktur der Bindehaut in der Kontrollgruppe ist vollständig und besteht hauptsächlich aus der Oberflächenschicht und der Lamina propria. Die Oberflächenschicht besteht aus laminierten säulenförmigen Epithelzellen, glatt und vollständig, mit Mikrovilli auf der Zelloberfläche. Zwischen den Epithelzellen waren verstreute Becherzellen vorhanden, mit großem Zellvolumen und Schleimkörnchen im Zellzytoplasma. Die Oberflächenschicht des Bindehautepithels in den drei Scopolamin-Wirkstoffgruppen war signifikant dünner, die Anzahl der Mikrovilli- und Becherzellen war reduziert, die Zellanordnungsstruktur war unvollständig, begleitet von Ödemen und einer geringen Menge an Entzündungszellen, wie bei der HE-Färbung beobachtet (Abbildung 6).
Durch Färben der Bindehaut mit PAS wurde die durchschnittliche Anzahl von Becherzellen pro 40-fachem mikroskopischem Feld in drei unabhängigen Proben jeder Maus berechnet und als Mittelwert ± SD ausgedrückt (Abbildung 7).
Abbildung 1: Statistik des Schirmer-Testwertes in jeder Gruppe (mm) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Fluorescein-Natrium-Färbung der Rattenhornhaut. Im 20-tägigen Experiment mit Fluorescein-Natrium wurden bei allen Ratten keine positiven Befunde in den Hornhäuten beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Hornhautepithelfärbung und Dickenmessung. In Gruppe 7.5 gab es eine lose interzelluläre Verbindung und vakuoläre Struktur in der Basalschicht (gekennzeichnet durch den roten Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Statistik der Hornhautepitheldicke in jeder Gruppe. Im Vergleich zum Hornhautepithel der Scopolamin-Gruppen zeigte das Hornhautepithel der normalen Kontrollgruppe statistische Unterschiede in der Dicke der Hornhautepithelschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: HE-Färbeergebnisse der extrorbitalen Tränendrüse von Ratten. (A) Gruppe 0: Im Gesichtsfeld zeigten die Tränendrüsen eine lobuläre Struktur und bestanden aus Gängen und Röhrendrüsen, ohne offensichtliche Anomalien in der Morphologie der Gänge, während die Röhrendrüsen aus kegelförmigen Drüsenzellen mit reichlich Schleimstoffen im Zytoplasma bestanden, keine offensichtlichen Ödeme im Bindegewebe, keine offensichtlichen Anomalien in interstitiellen Blutgefäßen und keine offensichtliche Nekrose und Entzündungszellinfiltration. (B) Gruppe 2.5: Im Gesichtsfeld wird eine gelegentliche Atrophie der Tränendrüsenepithelzellen beobachtet, mit reduziertem Volumen, unregelmäßig geformten erweiterten Drüsenhöhlen und reduzierter Schleimsubstanz in der Höhle (gekennzeichnet durch den roten Pfeil). Es gibt auch eine gelegentliche Infiltration freier Lymphozyten im Stroma (gekennzeichnet durch den blauen Pfeil), aber es werden keine offensichtlichen Anomalien in der Gangmorphologie oder Anzeichen von Ödemen beobachtet. (C) Gruppe 5: Im Gesichtsfeld waren Tränenepithelzellen gelegentlich verkümmert und verkleinert, die Drüsenhöhle war vergrößert, die Schleimsubstanz in der Höhle war reduziert (roter Pfeil) und gelegentlich wurde eine Infiltration freier Lymphozyten im Stroma beobachtet (blauer Pfeil), und es wurden keine offensichtlichen Anomalien in der Gangmorphologie oder Bindegewebödeme zwischen den Tränendrüsenläppchen beobachtet. (D) Gruppe 7.5: Ödeme sind im Gesichtsfeld zu sehen; Der Abstand zwischen den Tränendrüsen ist erweitert und die Anordnung ist unregelmäßig (grüner Pfeil), die Epithelzellen der Tränendrüsen sind oft verkümmert, das Volumen wird kleiner und die Form ist unregelmäßig (gelber Pfeil), gelegentlich wird die Drüsenhöhle vergrößert, die Schleimmasse in der Höhle ist reduziert (roter Pfeil), gelegentlich wird der freie Lymphozyt infiltriert (blauer Pfeil), ohne offensichtliche Anomalien in der Gangmorphologie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: HE-Färbung der Rattenbindehaut. Im Vergleich zum Bindehautepithel der Kontrollgruppe zeigten alle drei Gruppen des mit Scopolamin behandelten Bindehautepithels unterschiedliche Grade an strukturellen Schäden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: PAS-Färbung der Bindehaut. (A) Normale Kontrollratten. (B) Scopolamin-Gruppenratten. (C) Kelchzelldichte in jeder Gruppe (20x). Schwarzer Balken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Schirmer-I-Test, SIT (Mittelwert, Einheit [mm]) | |||||||
| Gruppe | 0 Tage | 3 Tage | 5 Tage | 7 Tage | 11 Tage | 15 Tage | 19 Tage |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
Tabelle 1: Schirmer-Test von Ratten in den vier Gruppen zu unterschiedlichen Zeitpunkten (mm). Nach der Anwendung von Medikamenten nahm die Tränensekretion bei Ratten signifikant ab.
| Zahl | Nekrose | Entzündung | Ödem | Epithel-Atrophie |
| 0 Grp-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2,5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2,5 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2,5 Grp -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7,5 Grp -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7,5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7,5 Grp -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
Tabelle 2: Pathologischer Gewebe-Score der Ratten-Tränendrüse. Bewertungskriterien: 0: Unter normalen Bedingungen gilt das Gewebe unter Berücksichtigung von Faktoren wie Alter, Geschlecht und Belastung des Tieres als normal;
1: Die beobachteten Veränderungen haben gerade den normalen Bereich überschritten; 2: Läsionen können beobachtet werden, sind aber noch nicht schwerwiegend; 3: Die Läsionen sind offensichtlich und verschlimmern sich weiter; 4: Die Läsionen sind extrem schwerwiegend und haben das gesamte Gewebe betroffen16.
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Discussion
Das wässrig-defiziente trockene Auge (ADDE) ist eine wichtige Art des trockenen Auges, die etwa 1/3 der gesamten Population des trockenen Auges ausmacht17, und die Hauptursache für ADDE ist eine pathologische Schädigung und Entzündung der Tränendrüse13. Für diese Art von trockenem Auge sind die häufigsten klinischen Behandlungsmethoden künstliche Tränen zur Linderung der Symptome oder die topische Anwendung von Steroiden oder Cyclosporin18, während es nur wenige Behandlungsmöglichkeiten für Schäden an der Tränendrüse gibt. Daher ist es sehr wichtig, die Auswirkungen der Rekonstruktion der Tränendrüsenfunktion auf das trockene Auge zu untersuchen und ein Tiermodell für die Tränendrüsenfunktionsstörung zu erstellen. Wir verwendeten eine Methode der wiederholten Anwendung von Medikamenten, um die Sekretion der Tränendrüse bei Ratten zu unterdrücken, und schufen ein Tiermodell für chronische Tränendrüsendysfunktion trockenes Auge.
Wir haben Ratten ausgewählt, um dieses Modell des trockenen Auges zu konstruieren, das im Vergleich zu anderen Tiermodellen mehr Vorteile hat19. Kaninchen haben zum Beispiel eine größere Körpergröße und benötigen mehr Dosen von Medikamenten oder häufigere Injektionen, um die gewünschte Wirkung zu erzielen. Außerdem sind Kaninchen etwas teurer, was mehr Kosten für das Experiment bedeutet. Mäuse werden auch häufig in der ophthalmologischen Forschung verwendet, aber sie werden im Allgemeinen verwendet, um Modelle des Sjögren-Syndromszu konstruieren 20. Diese Modelle konzentrieren sich auf den Vergleich von Organentzündungen und Lymphozyteninfiltration, um die immunpathologischen Mechanismen zu untersuchen. Mäuse haben kleine Körpergrößen, eine komplexe Tränendrüsenanatomie und eine geringe Tränensekretion, was es schwierig macht, die Tränenproduktion genau widerzuspiegeln. Das Rattentiermodell ist ein geeigneteres Modell für trockene Augen, da es bequeme Medikamenteninjektionen ermöglicht, relativ einfache Fütterungsbedingungen hat, sowohl für klinische als auch für experimentelle Studien geeignet ist und auch Kostenvorteile bietet. Es ist ein gutes Tiermodell für ADDE.
Wir haben den cholinergen Rezeptorblocker Scopolamin angewendet, um die cholinergen Rezeptoren im Körper der Ratte zu hemmen, die Tränendrüsensekretion zu reduzieren und die pathologische Struktur der Tränendrüsenzellen zu verändern, was den Zustand der Tränendrüsen bei Patienten mit trockenem Auge grundsätzlich simuliert. Im Vergleich zu anderen Methoden simuliert dieser Ansatz den beschädigten Zustand der Tränendrüsen in einem natürlichen Zustand besser. Andere Verfahren, wie die Verwendung von Benzalkoniumchlorid-Augentropfen21 oder die Veränderung äußerer Bedingungen wie die Verringerung der Luftfeuchtigkeit und die Erhöhung der Verdunstung der Augenoberfläche 4,8, stören nur die Umgebung der Augenoberfläche und verändern nicht den Funktionszustand der Tränendrüse. Daher sind sie nicht für langfristige, chronische Erkrankungen des trockenen Auges geeignet.
Bei der Messung des Sekretvolumens von Tränen bei Ratten haben wir die Schirmer-Tränenteststreifen verbessert. Zuerst schneiden wir den von Menschen verwendeten Tränenteststreifen entlang der Mittellinie. Dann schnitten wir die Oberseite in eine runde Bogenform und falteten sie oben vorsichtig zurück, um das Einführen in den unteren Bindehautsack der Ratte zu erleichtern. Es ist zu beachten, dass Ratten aktiv sind und es schwierig ist, Tränen für 5 Minuten zu messen. Nach dem Einführen des Schirmer-Tränenteststreifens in den unteren Bindehautsack der Ratte schlossen wir die Augen der Ratte manuell, um ihren Komfort zu erhöhen und zu vermeiden, dass sie während der langen Tränenmessung zu kämpfen haben, was die Messergebnisse beeinträchtigen könnte.
Beim Extrahieren der Tränendrüse muss sie zuerst lokalisiert werden. Der Punkt der Tränendrüsenlokalisation ist der Mittelpunkt zwischen der Vorderseite des Ohrs und dem inneren Canthus. Schneiden Sie dann das Hautgewebe unter dem Fell ab, um das Eindringen von fragmentiertem Fell zu minimieren und den Handhabungsprozess in der späteren Phase zu reduzieren. Während des Extraktionsprozesses ist es auch wichtig, das fragmentierte Fell rechtzeitig zu reinigen. Verwenden Sie insbesondere bei der Trennung der Tränendrüse phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder Kochsalzlösung zum wiederholten Spülen und vermeiden Sie eine Vermischung mit anderen Geweben, die das Schnittergebnis beeinträchtigen könnten.
Der Vorteil des entwickelten Tiermodells des trockenen Auges besteht darin, dass das Protokoll unterschiedliche Wirkstoffkonzentrationen mit unterschiedlichen Graden von Tränendrüsenverletzungen korrelierte. Dies bietet eine experimentelle Grundlage für die Untersuchung der Behandlung von Tränendrüsenfunktionsstörungen. Wir haben einige der operativen Schritte im Modellierungsprozess verfeinert, um einem Forscher detaillierteres Referenzmaterial zur Verfügung zu stellen. Darüber hinaus haben wir Analyseindikatoren für das Tiermodell des trockenen Auges hinzugefügt, die morphologische Indikatoren der Hornhaut, der Bindehaut und der Tränendrüse einbeziehen, Bindehautzellen zählen und den Grad der Tränendrüsenverletzung bewerten. Wir untersuchten die Tränendrüsenfunktion von Entzündungen, Ödemen und Atrophie. Wir haben die umfassendsten, kostengünstigsten und genauesten Analysemethoden ausgewählt, um den Grad der Funktionsstörung des trockenen Auges und der Tränendrüse widerzuspiegeln.
Unsere Methode hat jedoch auch gewisse Einschränkungen. Aufgrund des langwierigen Prozesses der Konstruktion von Tiermodellen müssen die Experimentatoren wiederholt injizieren. Obwohl es derzeit einige Methoden gibt, um manuelle Injektionen zu ersetzen, wie z. B. Medikamentenpumpen oder transdermale Pflaster, gibt es immer noch einige Komplikationen bei ihrer Verwendung. Wie wir bessere Methoden anwenden können, um die Häufigkeit von Medikamenten zu reduzieren, das Auftreten von Komplikationen zu vermeiden und die Genauigkeit der Dosierung sicherzustellen, ist unser nächstes Ziel. Zusammenfassend haben wir ein Tiermodell für trockene Augen, das durch Scopolamin-Injektion verursacht wurde, verbessert und damit eine experimentelle Grundlage für die Erforschung der Tränendrüsenfunktionsstörung bei ADDE geschaffen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine potenziellen Interessenkonflikte im Zusammenhang mit den in diesem Verfahren verwendeten Medikamenten und Materialien.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von Guangdong Provincial High-level Clinical Key Specialties (SZGSP014) und der Shenzhen Natural Science Foundation (JCYJ20210324125805012) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | SJZ No.4 Pharmaceutical | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoxylin and eosin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D006 | |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | |
| Paraffin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | YA0012 | |
| Periodic Acid-Schiff Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer tear test strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Scopolamine hydrobromide | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Small animal microscope | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 |
References
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