Summary
Her beskriver vi et avanceret værktøj designet til overvågning af klorofylbiosyntese i de tidlige stadier af Arabidopsis-frøplanteafetiolering. Den nye metode giver ikke-invasiv klorofyl fluorescensbilleddannelse i realtid ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning.
Abstract
Klorofylbiosyntese er et kendetegn ved de-etiolation, et af de mest dramatiske stadier i plantens livscyklus. Den stramt kontrollerede og meget dynamiske proces med klorofylbiosyntese udløses under skiftet fra mørket til lyset i blomstrende planter. I det øjeblik, hvor etiolerede frøplanter udsættes for de første spor af sollys, medieres hurtig (i rækkefølge af sekunder) omdannelse af protochlorophyllid til chlorophyllid af unikke lysaccepterende proteinkomplekser, der via efterfølgende metaboliske trin fører til produktion af fuldt funktionel klorofyl. Standardteknikker til klorofylindholdsanalyse inkluderer pigmentekstraktion fra løsrevet plantevæv, hvilket ikke gælder for undersøgelse af sådanne hurtige processer. For at undersøge klorofylkinetik in vivo med høj nøjagtighed og rumlig tidsmæssig opløsning i de første timer efter lysinduceret de-etiolation blev der udviklet et instrument og en protokol. Her præsenterer vi en detaljeret procedure designet til statistisk robust kvantificering af klorofyl i de tidlige stadier af Arabidopsis-de-etiolation.
Introduction
De-etiolation repræsenterer den mest dramatiske fase i plantens livscyklus, karakteriseret ved en række morfologiske ændringer og fuldstændig omlægning af plantemetabolisme (fra hetero- til autotropisk)1. Klorofylbiosyntese er et kendetegn ved lysinduceret de-etiolation i planter og en meget dynamisk proces. Dannelse af klorofyl fra mørkproduceret prækursor protochlorophyllid skal koordineres tæt for at undgå skader som følge af reaktive biprodukter2. Protochlorophyllidreduktionen til chlorophyllid katalyseres af lysafhængige protochlorophyllidoxidoreduktaser (POR'er), unikke enzymer aktiveret direkte af lys. Reaktionen er meget hurtig og finder sted i størrelsesordenen ms til s3, hvilket fører til genkendelig klorofylakkumulering inden for få minutter efter bestråling af etiolerede frøplanter 4,5,6. Mere tid (fra timer til dage) er nødvendig for chloroplastbiogenese at etablere et fuldt funktionelt fotosyntetisk apparat3.
Der findes forskellige metoder til at analysere klorofylindhold, herunder højtydende væskekromatografi (HPLC) eller spektrofotometri. Normalt kræver disse teknikker ødelæggelse af plantevæv 4,5,6, hvilket begrænser bestemmelsen af ændringer i klorofylniveauer over tid. Metoder, der tillader ikke-invasiv klorofylkinetiketablering, kan åbne et helt nyt perspektiv for at studere planter i forskellige aspekter lige fra grundlæggende forskningsspørgsmål, såsom analyse af processen med klorofylsyntese i tid og rum til mere praktiske anvendelser, såsom vurdering af stresstolerance eller virkning af biostimulerende midler på klorofylkinetikken. I betragtning af dette introducerede vi et system til overvågning af klorofyldannelse, iReenCAM7. Den indeholder et CCD-kamera, emissionsfiltre, lyskilder og en rørledning til automatiseret fluorescensanalyse (figur 1). Hovedtræk ved den udviklede enhed er høj rumlig og tidsmæssig opløsning, der overgår de parametre, der anvendes i nuværende tilgange, og tilstrækkelig følsomhed og specificitet sammenlignet med standard analysemetoder7.
Den ikke-invasive procedure, der er beskrevet her, kræver minimale reagenser og omfatter enkle trin, der gør det muligt at opnå en klorofylkinetikprofil i levende Arabidopsis-frøplanter i meget tidlige stadier af de-etiolation. Protokollen kan være nyttig til undersøgelse af meget dynamisk klorofysynteseproces påvirket af en række faktorer, både eksogene (salt, tørke, biostimulerende midler, tungmetaller osv.) og endogene (typisk forbundet med ændringer i genaktiviteten) i oprindelse uden behov for at løsne noget plantevæv og dermed undgå yderligere stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medium forberedelse
- Dyrkningsmediet fremstilles ved at blande 0,75 g geleringsmiddel med 50 ml sterilt deioniseret vand i en glasflaske for at opnå en koncentration på 1,5% (w/v) for en petriplade (120 x 120 x 17 mm). Ryst forsigtigt blandingen og opvarm den derefter i en mikrobølgeovn, indtil den koger for at opløse geleringsmidlet (opløsningen bliver klar).
- Lad mediet køle af til 58-60 °C, før du fortsætter til næste trin. Alle efterfølgende trin skal udføres under sterile forhold i en laminar flow-hætte for at forhindre kontaminering.
- Brug petriplader med lystætte kanter for at undgå overdreven aktinisk lysrefleksion og høj baggrundsautofluorescens under målingerne. Til dette skal du anvende sort tape (eller andre tilgængelige midler) til at dække alle siderne af den tomme petriplade (figur 2).
- Udfør sterilisering af pladen/pladerne efter tapepåføring ved bestråling med bakteriedræbende UV-lampe i 20-30 min.
- Hvis forsøget omfatter kemisk behandling (dvs. abiotiske/biotiske stressorer, plantehormoner og/eller vækstregulatorer osv.), tilsættes den passende mængde tilsvarende kemikalie direkte til mediet. Vær opmærksom på, at en valgt kemisk stabilitet tilsættes mediet (for eksempel, hvis kemikaliet ikke er termostabilt, tilsættes mediet, når det afkøles lige før det hældes i pladen). Bland substratet grundigt ved omrystning for at sikre en jævn fordeling af kemikaliet.
- Undgå belysning af plader til UV-lys, efter at mediet er hældt (ville føre til iltradikalproduktion, der kan forstyrre eksperimentet).
- Hæld det tilberedte substrat i den eller de firkantede petriplader, og lad mediet størkne ved stuetemperatur.
2. Sterilisering af frøoverflade og plantevækstbetingelser
- Få den nødvendige mængde Arabidopsis thaliana Col-0 frø fra stambalken (10-20 mg) og tilsæt den til et 2 ml mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Ingen specifikke ændringer er nødvendige, mens du arbejder med forskellige Arabidopsis-linjer (økotype/mutantlinjer). Revision af savgitteret og måletrinnene bør udføres for andre plantearter under hensyntagen til forskelle i frøstørrelse, spireevne og frøplantestørrelse. - Overfladesteriliser Arabidopsis frø ved at tilsætte 70% ethanol til røret i 2 min. Ryst forsigtigt rørene under sterilisering.
- Fjern ethanol ved pipettering omhyggeligt, pas på ikke at miste frø. Vask frøene ved at tilsætte sterilt vand til røret i 5 minutter for at fjerne eventuel resterende ethanol (ryst forsigtigt rørene i vaskeperioden).
- Lad frøene sedimentere til bunden af røret ved tyngdekraften, fjern det resterende vand.
- Skyl frøene igen 2x med sterilt vand som beskrevet i trin 2.3 for at sikre, at de er fri for ethanolegenskaber. Lad frøene sedimentere til bunden af røret ved tyngdekraften, fjern det resterende vand.
- Tilsæt et lige så stort volumen sterilt vand til røret, der indeholder frøene, for at skabe en frøvandssuspension.
- Brug et sågitter til jævnt at fordele frø-vand-suspension af den givne genotype på de valgte områder af mellempladen (figur 2 og supplerende figur 1). Fordel frøene (ca. 30-40) i træk i hvert område ved hjælp af en bred pipettespids.
- Lad vandet tørre i såområderne i ca. 30 minutter, og hold pladen (pladerne) åbne i en laminar strømningshætte for at forhindre forurening. Forsegl pladen med mikroporetape og pakk den ind med aluminiumsfolie.
- Frøene stratificeres i 3 dage ved 4 °C i mørke for (afhængigt af den anvendte økotype) at overvinde frødvale og/eller for at fremme ensartet spiring.
- Overfør pladen med stratificerede frø til hvidt lys (150 μmol / m2 / s) i 1 time for at fremkalde spiring (pak folien kun ud til lysbehandling).
- Efter lysbehandlingen pakkes pladen med aluminiumsfolie for at beskytte frøene mod lys og placeres lodret i et vækstkammer og dyrkes i 4 dage i mørke ved 21 °C.
3. Klorofylfluorescens måling og analyse
- Tænd for iReenCAM-systemet, og sørg for, at systemet er klar og korrekt konfigureret i den automatisk startede PS-serversoftware (f.eks. hvis der er tilstrækkelig lagerplads til eksperimentdataene, hvis fluorescenskameraet er tilsluttet pc osv.).
- Aktivér planlægningssoftwaren for at oprette forsøgsplanen for målingen ved at klikke på Eksperimenter > nyt eksperiment. Angiv et beskrivende navn til eksperimentet, og udfyld detaljerne (beskrivelse).
- Angiv de påkrævede handlinger for eksperimentet ved at klikke på Tilføj handling , hvilket fører til tidsplanen for eksperimentelle handlinger.
BEMÆRK: Ordet handling betyder her at udføre et komplet eksperiment (dvs. inklusive alle de trin, der er nødvendige for at udføre en plademåling). - Angiv betingelserne for en enkelt rund måling (dvs. længden af lys/mørke-perioden).
- Ved at klikke på Generer liste skal du definere tidsintervallerne mellem målerunder. Vælg det tidspunkt, hvor runden starter og slutter (4 timer i alt) og intervallerne mellem runderne (i den aktuelle opsætning en runde hvert 2. minut).
- Klik på Generer , og sørg for, at tidsrammen og intervallerne mellem lysimpulser er korrekte ved at kontrollere listen, der genereres i venstre side af skærmen.
- Vælg måleprotokol (supplerende figur 2). Gem alle ændringer af databasen til fremtidig reference.
- Lige før målingen starter, skal du bruge grønt lys med lav intensitet (se materialetabel) inde i det mørke rum og justere niveauet på hylden inde i målekammeret eller udføre andre forberedelsestrin, før folien fjernes fra petripladen. Sluk derefter lyset og overfør pladerne til målekammeret i fuldstændig mørke.
- Fjern forsigtigt aluminiumsfolien, der dækker petripladen, der indeholder de 4 dage gamle frøplanter. Placer petripladen vandret inde i enhedens målekammer. Inducer aktiniske lysimpulser inde i kammeret, og udfør billeddannelse i henhold til forsøgsplanen (handlinger) i trin 3.1-3.7.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå belysning af pladerne med etiolerede frøplanter, før de placeres i målekammeret. Manipulationen med pladen med etiolerede frøplanter skal udføres i mørkerummet/kammeret (for en eventuel forsøgsopstilling se supplerende figur 3).
4. Dataudtræk og analyse
- Når målingen er afsluttet, skal du åbne det tilsvarende eksperiment i analysatorsoftwaren.
- For at analysere plantens fluorescens skal du generere to typer masker- en grov (bakke) maske, der dækker det område, hvor frøplanterne er placeret, og en præcis (plante) maske, der kun dækker vævet af interesse (typisk cotyledoner).
- Generer en bakkemaske ved at klikke på indstillingen Opret ny bakketype . Tildel de relevante genotypenavne til de respektive områder på pladebilledet.
- For at tildele genotype skal du vælge et billednummer på Round og derefter klikke på Indlæs billede øverst på skærmen. Billedet af pladen vises på skærmen. Ved at klikke på et af de sæt knapper, der repræsenterer forskellige former tegneværktøjer (supplerende figur 4), skal du indtaste Ny formtilstand , der gør det muligt at tegne interesseområdet på pladebilledet. Vælg de nødvendige områder (f.eks. Forskellige genotyper på pladen) og angiv deres passende navngivning.
- Klik på Esc for at afslutte formtilstanden. Gem den genererede bakkemaske (efter at have angivet et navn til den) ved at klikke på Store bakketype.
- Gå et trin tilbage, og anvend den maske, der blev genereret i tidligere trin, ved at vælge dens navn fra indstillingen Skift efter bakketype .
- For at generere plantemaske med høj nøjagtighed skal du bruge billedet taget efter 180 minutters måling (runde 91) til at indstille minimumstærskelværdien for fluorescenssignalintensitet, hvilket muliggør subtraktion af baggrundsstøj. For dette skal du fjerne fluebenet fra Automatisk tærskel og indstille en manuel tærskel til 0 (supplerende figur 4).
- Klik på Eksempel for at sikre, at bakkemasken dækker alle nødvendige områder (genotyper) på pladebilledet. Til dette skal du vælge runde 91 og klikke på Opdater forhåndsvisning.
- Gå ind i menuen Kør ved at klikke på Kør. Kør analysen udelukkende for runde 91 ved kun at sætte et kryds på runde 91. Vælg derefter outputstien, og klik på Start analyse.
- Når analysen er færdig, åbnes menuen Udfør automatisk. Vælg den udførte runde (det vil være den eneste) fra eksperimenter, og klik på Skift analysator til analyserede data for at eksportere dataene for dette specifikke tidspunkt (runde 91).
- Udpak .xsel-filen fra det eksporterede arkiv, da denne fil indeholder de vigtige oplysninger om plantemasker ved at klikke på ikonet Åbn eksportdel .
- Åbn eksperimentet igen ved at klikke på ikonet Åbn lokal analysedel . Gå ind i menuen Mask Builder igen, klik på Indlæs billede, vælg runde 1 og derefter Indlæs fra fil i øverste højre hjørne af skærmen, og indlæs den tidligere udpakkede .xsel-fil. Billedet af pladen vises med bakkemasken påført.
- Gem masken ved at klikke på Store bakketype og anvend den ved at vælge dens navn i Skift efter bakketype mulighed.
- Generer plantemasken ved at justere tærsklen for fluorescenssignalintensitet. Forøg værdien af manuel tærskel , indtil masken, der genereres i menuen Preview , passer perfekt til ROI (f.eks. cotyledoner) i hver af genotyperne (supplerende figur 4). Kontroller, om masken passer til alle runder af målingerne ved at rulle gennem runderne (det burde være nok at kontrollere den korrekte maskeplacering ved runde 1, 61 og 121) i menuen Preview .
- Udfør analysen for alle målerunder og eksportér data.
BEMÆRK: Outputfilen indeholder klorofylfluorescensværdier for en given genotype for hvert tidspunkt, hvilket muliggør konstruktion af diagrammer efter eget valg og letter yderligere statistisk evaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det typiske output, der opnås ved hjælp af den nyudviklede procedure i de 4 dage gamle afetiolerede Arabidopsis-frøplanter af vildtype (WT), økotype Columbia-0 (Col-0), er vist i figur 3. Under kontrolbetingelser (DMSO-supplerede MS-medier) starter den klorofylbiosyntetiske kurve med et indledende udbrud af klorofylsyntesen, hvor protochlorphyllid-puljen, der syntetiseres under vækstens scotomorfogene fase, hurtigt omdannes til klorofyl på grund af de lysinducerede POR'er 7,8,9. Den indledende fase af hurtig klorofylakkumulering tager ca. 10 minutter og efterfølges af en forsinkelsesfase, hvor minima for det mørksyntetiserede protochlorophyllid nås (ca. 30 minutter efter bestråling; for den HPLC-målte protochlorophyllidkurve, se7). I lagfasen opreguleres de klorofylbiosyntetiske gener10, hvilket fører til lysinduceret produktion af protochlorophyllid. Det nyligt syntetiserede protochlorophyllid omdannes straks til klorofyl, der kan påvises som eksponentiel fase (i tilfælde af WT Col-0, der starter ca. 120 min efter bestråling), og afsluttes med en anden forsinkelsesfase ca. 4 timer efter bestrålingen af den afetiolerede frøplante (figur 3). I nærvær af 6-benzylaminoturin (BAP) kan de første signifikante forskelle påvises under den eksponentielle fase7, hvilket tyder på negativ effekt af BAP på klorofylkinetikken i senere stadier af klorofylbiosyntese (ca. 2 timer efter starten af belysningen med aktinisk lys; Figur 3).
Til sammenligning af forskellige tilstande og/eller genotyper er normalisering af rådata nødvendig. Da der ikke kunne påvises klorofyl ved hjælp af HPLC under forskellige betingelser og/eller forskellige genotyper i etiolerede frøplanter, udførte vi normaliseringen (F/F0) til T0-fluorescensniveauerne (F0) målt for den tilsvarende behandling og/eller genotype7. For at demonstrere vigtigheden af normalisering præsenterer vi både rådata og dataene normaliseret til den gennemsnitlige klorofylfluorescensværdi af kontrol målt ved T0 (F0; Figur 3A og figur 3B, henholdsvis).
Figur 1: Oversigt over måleenhedens protokol. Ordningen med iReenCAM måle- og analysepipeline. A) Prøveforberedelse ved gitterdefineret frøsåning, lagdeling, lysinduktion af spiring og vertikalt orienteret petripladedyrkning i mørke. (B) Kontrolmodul til automatisk og programmerbar billedoptagelse og datastyring baseret på PlantScreen fænotypebestemmelse SW-værktøjskasse organiserer driften af hele systemet ved at kontrollere og synkronisere HW-operationen med brugerdefineret måle- og analyseprotokol. (C) Måleprotokollen er konstrueret til dynamiske målinger af fluorescerende prøvebilleder i intervaller på 2 minutter i i alt 4 timer, dvs. 120 målerunder. Tidsvisuel ramme af repræsentativt falsk farvebillede af lodret orienterede 4 dage gamle Arabidopsis-frøplanter erhvervet på tidspunktet 180 min bruges til ROI-maskegenerering. (D) Maske, der definerer ROI for et væv af interesse (f.eks. cotyledon, hypocotyl eller rodzone) påføres på den tidsvisuelle ramme, baggrundssubtraktion udføres, og pixel for pixel fluorescensværdier for hver ROI (defineret af plantemasken) fra alle målerunder ekstraheres. Endelig normaliseres rådataene (fluorescens F) til den gennemsnitlige fluorescensværdi ved T0 (F0). Vægtstænger = 1 cm (A) og 0,25 cm (C). Tallet blev ændret fra7. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Placering af frø. Figuren viser placering af Arabidopsis-frø på petripladen med lystætte kanter ved hjælp af savgitteret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Klorofylakkumuleringskinetik i de tidlige stadier af Arabidopsis-afetiolation . Etiolerede WT Col-0-frøplanter blev dyrket på medier suppleret med BAP eller DMSO (mock). (A) Middelværdien ± SD (skraveret område), n = 9 af rådata og (B) data normaliseret til den gennemsnitlige fluorescensværdi ved T0 (F0). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Sågitter. Til venstre: Sågitter med skitserede rektangulære kasser til placering af frøene af hver genotype på et målested placeret i området med aktinisk lyshomogenitet (lysintensitet ≥ 0,7 af den maksimale lysintensitet). Til højre: Skematisk gengivelse af 4 dage gamle, etiolerede Arabidopsis-frøplanter dyrket til analysen. Sågitteret giver et muligt skema for Arabidopsis-frøpositionering , der sikrer let homogenitet og korrekt frøtæthed (hver slot kan bruges til frøplacering, da størrelsen på en slot, afstanden mellem slidserne og lyshomogeniteten i gitterets område er forenet). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Protokol til måling af fluorescens. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Eksperimentel konfiguration, der gør det muligt at undgå uønsket lyseksponering. A) Måleapparatet anbringes i walk-in-phytotronen, (B) til kammeret adskilt af lystæt dør. (C) In vitro-dyrkningskasserne (rød pilespids), der er beregnet til etiolerede frøplanters vækst under definerede betingelser (temperatur og relativ luftfugtighed), placeres lige under anordningen (gul pilespids), hvilket sikrer minimal risiko for lyseksponering. Kilden til grønt svagt lys (blå pilespids) er monteret på væggen ved siden af kontrol-pc'en (orange pilespids). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: Procedure for generering af masker i arbejdsgangen ved hjælp af PS-dataanalysatorsoftware. Udskriv skærmbilleder af individuelle trin, der skal udføres for bakkemasken (trin 4.3-4.6) og plantemasken (trin 4.12) generering og dataanalyse (trin 4.7 og 4.13). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 5: Såtæthed, der påvirker målevariabiliteten. Klorofylakkumuleringskinetik i 4 dage gamle, etiolerede Arabidopsis WT Col-0-frøplanter dyrket (A) separat (som individuelle frøplanter, her n = 5) eller i en gruppe af (B) høj (HD, n = 30-40) eller (C) lav densitet (LD, n = 10-15). N svarer til antallet af kimplanter pr. Slot i sågitteret, data repræsenterer middelværdierne ± SD (skraveret region). Den høje eller lave densitet svarer til antallet af kimplanter pr. Slot i sågitteret som nævnt. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 6: Dyrkningsinterval og plads kræver artsspecifik optimering. Vækst af forskellige plantearter ved hjælp af den Arabidopsis-optimerede protokol. (A) Frøplacering på sågitteret. B) 4 dage gamle, etiolerede frøplanter af (fra venstre mod højre) Arabidopsis thaliana, Brassica napus og Crambe abyssinica. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen og fejlfinding - intet lys og pas på masken
Som fremhævet direkte i protokolbeskrivelsen ovenfor er det af afgørende betydning at undgå selv spormængder af lys både under dyrkning af etiolerede planteplanter eller lige før protokollenpåbegyndes 11. I vores opsætning bruger vi et dedikeret mørkt kammer placeret i walk-in phytotronen og adskilt fra resten af phytotronen med lystæt roterende dør (supplerende figur 3). Kammeret er udstyret med plantedyrkningsplads og arbejdsbord, der gør det muligt at rumme enheden sammen med kontrol-pc og damphætte. Dette giver os både mulighed for at dyrke planterne i mørke og starte målingen uden behov for pladetransport.
Måden at dyrke planter og maskegenerering på er afgørende for efterfølgende kvantificering af klorofylfluorescenssignal via det foreslåede assay. Man bør undgå at få klumper af geleringsmiddel eller lille visuelt affald/støv i mediet, da det kan forårsage lysrefleksion. Da genkendelsen af klorofylfluorescens af softwaren er begrænset af masken, vil et planteområde, der ikke vil blive dækket af masken, simpelthen ikke blive analyseret af softwaren. Under 4 timers måling vokser / bevæger frøplanter sig lidt, derfor kan udpeget maske kræve justeringer, da den muligvis ikke passer gennem alle målerunder for den nøjagtige kvantificering af signalintensiteten. Ifølge vores erfaring synes den ufuldkomne maskedefinition at være den vigtigste kilde til variabilitet. Under optimeringseksperimenterne overvågede vi ændringerne i variabiliteten af klorofylfluorescensværdier taget til analyse i i) individuelle frøplanter og en gruppe frøplanter med ii) højere (30-40 frø) og iii) lavere (10-15 frø) densitetssåning (supplerende figur 5). Vi brugte en højere tæthed af frøsåning, da den viste den laveste variation. Den højere variabilitet, der ses i tilfælde af såning af individuelle frøplanter/såning med lavere densitet, stammer hovedsagelig fra den højere andel af pixels, der er placeret i kanten mellem signalet og baggrunden, og frøplanternes svage bevægelse i løbet af måleintervallet på 4 timer.
For at sikre, at alle målinger er nøjagtige, skal du kontrollere, om plantemasken passer til den første runde, derefter til den 15., 30., 45., 60. 75. og så videre indtil den sidste (ved at vælge rundens nummer og klikke på Opdater forhåndsvisning). Dette tager kun et par minutter, men vil sikre, at hele cotyledon-området dækkes og evalueres. Hvis plantemasken ikke passer rundt (det krævede område er ikke fuldt dækket), skal du opdele eksperimentet i flere dele. Udfør derefter protokollen fra trin 4 (4.1-4.13) for at oprette en bestemt maske separat for hver del af eksperimentet. For eksempel, hvis du bemærker forskydningen af plantemasken ved runden 60-61 (eller lidt tidligere), opdele eksperimentet i to dele - 1. del (1-60 runder) og 2. del (61-121 runder). For 1. del skal du bruge billedet af runde 41 til at generere en plantemaske og for 2. del bruge runde 91. På trin 4.13, når du analyserer dataene, skal du være omhyggelig med at vælge runderne i henhold til den tilsvarende del af eksperimentet (f.eks. runder 1-60 for den første del og 61-121 for den anden, som i det førnævnte eksempel), før du klikker på Analyser. Når man arbejder med Arabidopsis, er planternes bevægelse ubetydelig, da de vokser ret langsomt, men hvis man anvender protokollen for forskellige arter (se nedenfor), skal væksttempoet tages i betragtning.
Ændringer og begrænsninger
Antallet af parametre kan ændres, herunder intensiteten og bølgelængden af det aktiniske lys og/eller det lys, der påføres mellem intervallerne for aktinisk lysanvendelse. Måleenheden inkluderer det integrerede, fuldt motoriserede og softwarestyrede filterhjul. Således kan målealgoritmen, der er egnet til kvantificering af andre pigmenter, typisk også produkter af tetrapyrolle biosyntetiske vej 10,12, medtages i protokollen i tilfælde af tilsætning af passende filtre.
Som det blev nævnt tidligere, kan protokollen også anvendes ikke kun til Arabidopsis-planter . Når der arbejdes med andre plantearter, bør hvert trin i protokollen dog revideres i overensstemmelse hermed under hensyntagen til de artsspecifikke karakteristika, herunder spireevne og væksthastighed og/eller størrelse (supplerende figur 6).
En af de vigtige begrænsninger i protokollen er det tidsrum, hvor klorofylkvantificeringsanalysen kan udføres. Efter at klorofyl bliver integreret i fotosystemkomplekserne, bliver fluorescenssignalet forspændt af fotosyntesens energiforbrug (det, der kaldes den variable klorofylflorescens er til stede), som det er blevet observeret i senere stadier af de-etiolation13. Som analyseret ved hjælp af OJIP transienter assay14,15, kunne der ikke påvises tegn på fotosyntetisk aktivitet ved hjælp af denne eksperimentelle opsætning i løbet af de første 4 timer af de-etiolation 7. Hvis den forlængede periode med fotomorfogenese antages/er nødvendig for at blive analyseret, bør fotosystemsamlingsniveauet og fotosyntesens mulige virkning på de samlede fluorescensniveauer testes.
Endelig skal det nævnes, at vores protokol baseret på fluorescensmålingerne tillader relativ, ikke absolut klorofylkvantificering. Hvis absolut kvantificering er nødvendig, skal tilsvarende kalibrering udføres ved hjælp af et alternativ, f.eks. HPLC-metoden.
Betydning i forhold til eksisterende metoder - enkel, hurtig og statistisk robust klorofylkvantificering med høj tid og rumlig opløsning
Proceduren beskrevet her tillader realtidspåvisning og kvantificering af klorofyl i levende Arabidopsis-frøplanter i tidlige stadier af de-etiolation. Sammenlignet med andre metoder, der hovedsagelig er baseret på klorofylekstraktion fra løsrevet plantemateriale16,17 eller nyligt udviklede optiske metoder18,19, er denne fremgangsmåde rent ikke-invasiv, idet den muliggør klorofylkvantificering ved in vivo-måling af fluorescensintensitet. Der er heller ikke behov for yderligere reagenser, der er nødvendige til prøveforberedelse, som det er tilfældet med andre eksisterende alternative metoder, herunder ovennævnte HPLC- eller spektrofotometribaserede tilgange. Den nyligt introducerede protokol er enkel, hurtig og præcis, som tidligere verificeret ved hjælp af HPLC5. Ved hjælp af standardprotokolindstillingerne laves den endelige kurve for en enkelt biologisk gentagelse af 120 målepunkter (fluorescensintensitetsmiddel) taget i løbet af 4 timer af målingen, hver bestående af op til 15 målepunkter. Den endelige kurve omfatter typisk data fra tre biologiske replikaer (f.eks. tre uafhængigt forberedte plader) og tre målepunkter (tre tekniske replikaer), der hver består af 30-40 frøplanter. Således er der omkring 300 frøplanter analyseret i hvert tidsinterval, hvilket giver statistisk robust datasæt, der gør det muligt pålideligt at detektere selv små forskelle som demonstreret på mutanter, der er påvirket i forskellige trin af klorofylbiosyntese7. Her opfordrer vi brugeren til at anvende den nyligt udviklede statistiske tilgang baseret på generaliserede lineære blandede modeller kombineret med klassiske tidsseriemodeller som et passende værktøj til klorofylkinetikdataanalyse20.
Fremtidige anvendelser af teknikken - hurtig og billig screening
De ovennævnte funktioner gør denne tilgang til et nyttigt værktøj, der er egnet til hurtig og billig screening og meget præcis kvantificering af træk, der er forbundet (direkte eller indirekte) med klorofylbiosyntese. Dette kan omfatte undersøgelser, der anvender den fremadrettede genetiske screening for bedre at karakterisere de komplekse og multi-level reguleringer af klorofylbiosyntese 10,12,21. I betragtning af muligheden for forskellige sammensatte behandlinger er protokollen også meget værdifuld til at studere for eksempel vigtigheden af lysmedierede hormonelle reguleringer22,23 eller screening for lavmolekylære forbindelser med mulig indvirkning på klorofylakkumuleringskinetik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Z.B. og K.P. er ansatte i PSI, og Martin Trtilek er administrerende direktør og ejer af PSI-selskabet, der producerer iReenCAM. Alle disse forfattere var involveret i udviklingen af instrumentet som tidligere beskrevet7.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Den Europæiske Fond for Regionaludvikling-projekt SINGING PLANT (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Dette projekt har modtaget finansiering gennem MSCA4Ukraine-projektet (ID 1233580), som er finansieret af EU. Vi er taknemmelige for Lenka Sochurkova for det grafiske design af figur 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
| Cultivation chamber | PSI | custom made | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
| Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
| Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
| Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
| Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |
References
- Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L.
- Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
- Heyes, D. J., et al. Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development. Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).
- Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples. Plant Methods. 9 (1), 19 (2013).
- Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination. Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).
- Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry. Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).
- Balakhonova, V., et al. Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation. Front Plant Sci. 14, 1093292 (2023).
- Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts. Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).
- Reinbothe, C., et al. Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction. Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).
- Kobayashi, K., Masuda, T. Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 7, 1811 (2016).
- Wang, Y., Folta, K. M. Contributions of green light to plant growth and development. Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).
- Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae. Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).
- Pipitone, R., et al. A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis. eLife. 10, e62709 (2021).
- Stirbet, A. G. On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient. J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).
- Kupper, H., et al. Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging. Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Kósa, A., Preininger, É, Böddi, B. Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures. Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).
- Liang, Y., et al. A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings. Plant Met. 13 (1), 26 (2017).
- Pérez-Patricio, M., et al. Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves. Sensors. 18 (2), 650 (2018).
- Spyroglou, I., et al. Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences. Plants (Basel). 10 (2), (2021).
- Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T.
- De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development. Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).
- Liu, X., Li, Y., Zhong, S. Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis. Front Plant Sci. 8, 1433 (2017).
