Aqui, descrevemos uma ferramenta avançada projetada para o monitoramento da biossíntese de clorofila durante os estágios iniciais da desetiolação de plântulas de Arabidopsis . A nova metodologia fornece imagens não invasivas de fluorescência da clorofila em tempo real com alta resolução espacial e temporal.
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Artigo de método
Ensaio Não Invasivo para Determinação da Cinética de Biossíntese de Clorofila durante os Estágios Iniciais da Desetiolação de Arabidopsis
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A biossíntese de clorofila é uma marca da desetiolação, uma das fases mais dramáticas do ciclo de vida das plantas. O processo rigidamente controlado e altamente dinâmico de biossíntese de clorofila é desencadeado durante a mudança do escuro para a luz em plantas com flores. No momento em que as plântulas etioladas são expostas aos primeiros vestígios de luz solar, a rápida conversão (em ordem de segundos) de protoclorofilida em clorofilida é mediada por complexos proteicos únicos que aceitam a luz, levando através de etapas metabólicas subsequentes à produção de clorofila totalmente funcional. As técnicas padrão para análise do teor de clorofila incluem a extração de pigmentos de tecidos vegetais destacados, o que não se aplica ao estudo de processos tão rápidos. Para investigar a cinética da clorofila in vivo com alta acurácia e resolução espaço-temporal nas primeiras horas após a desetiolação induzida pela luz, um instrumento e um protocolo foram desenvolvidos. Aqui, apresentamos um procedimento detalhado desenhado para quantificação estatisticamente robusta de clorofila nos estágios iniciais da desetiolação de Arabidopsis .
Introdução
A desetiolação representa a fase mais dramática do ciclo de vida das plantas, caracterizada por uma série de alterações morfológicas e rearranjo completo do metabolismo vegetal (de hetero para autotrópico)1. A biossíntese de clorofila é uma característica da desetiolação induzida pela luz em plantas e um processo muito dinâmico. A formação de clorofila a partir de protoclorofilida precursora produzida no escuro deve ser fortemente coordenada para evitar danos causados por subprodutos reativos2. A redução do protoclorofilide a clorofilida é catalisada por protoclorofilídeos oxidorredutases (PORs) dependentes de luz, enzim....
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Protocolo
1. Preparação do meio
- Preparar o meio de cultivo misturando 0,75 g de gelificante com 50 mL de água deionizada estéril em um frasco de vidro para atingir uma concentração de 1,5% (p/v) para uma placa de Petri (120 x 120 x 17 mm). Agite suavemente a mistura e, em seguida, aqueça-a no micro-ondas até ferver para dissolver o agente gelificante (a solução torna-se clara).
- Deixe o meio arrefecer até 58-60 °C antes de prosseguir para os passos seguintes. Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas em condições estéreis dentro de uma capela de fluxo laminar para evitar contaminação.
- Use placas de Petri com bordas à prova d....
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Resultados
O resultado típico obtido usando o procedimento recém-desenvolvido em mudas de Arabidopsis desetioladas de 4 dias de idade do tipo selvagem (WT), ecótipo Columbia-0 (Col-0) é mostrado na Figura 3. Sob condições de controle (meio MS suplementado com DMSO), a curva biossintética da clorofila inicia-se com uma explosão inicial da síntese de clorofila, na qual o pool de protoclorfilídeos sintetizado durante a fase escotomorfogênica do crescimento é rapidamente convertido em clorofila de.......
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Discussão
Etapas críticas do protocolo e solução de problemas - sem luz e cuide da máscara
Como destacado diretamente na descrição do protocolo acima, evitar até mesmo as quantidades residuais de luz, tanto durante o cultivo de mudas de plantas etioladas ou pouco antes de iniciar o protocolo, é de fundamental importância11. Em nossa configuração, usamos uma câmara escura dedicada localizada no phytotron walk-in e separada do resto do phytotron com porta giratória à prova de luz (.......
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Divulgações
Z.B. e K.P. são funcionários da PSI e Martin Trtilek é CEO e proprietário da empresa PSI que produz o iReenCAM. Todos esses autores estiveram envolvidos no desenvolvimento do instrumento conforme descritoanteriormente7.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional – Projeto SINGING PLANT (nº. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Este projeto recebeu financiamento através do projeto MSCA4Ukraine (ID 1233580), que é financiado pela União Europeia. Somos gratos a Lenka Sochurkova pelo design gráfico da Figura 1.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 6-benzilaminopurina | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Folha de alumínio | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 sementes | NASC coleção | N1092 | |
| Câmara de cultivo | PSI | feito sob medida | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf monocanal, variável (100-1000 μ L) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM dispositivo | PSI | feito sob medida/protótipo | |
| Frascos de laboratório, com tampas (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Caixa de fluxo laminar | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Fita de emenda de borracha sem revestimento, 19 mm de largura, preto, Ciência escocesa | 3M. Aplicado à vida | 7000006085 | |
| tubo de microcentrífuga, 2 mL com tampa, PPT, MARCA | Merck | BR780546-500EA | |
| Micropore fita | 3M Science. Aplicado à Vida | 7100225115 | |
| Osram lumilux verde l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| placas de Petri - Pratos Greiner, quadrados, 120 x 120 x17mm, ventilados | Pontas de pipeta Merck | Z617679-240EA | |
| , 1000 μ L, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| O software Plant Screen Data Analyzer | PSI | fornecido como parte do iReenCAM |
Referências
- Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L. Photomorphogenesis. Arabidopsis Book. 10, e0147(2012).
- Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
- Heyes....
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Reimpressões e permissões
