Summary
במאמר זה אנו מתארים כלי מתקדם המיועד לניטור ביוסינתזה של כלורופיל בשלבים המוקדמים של דה-אטיולציה של שתילי ארבידופסיס . המתודולוגיה החדשנית מספקת דימות פלואורסצנטי כלורופיל לא פולשני בזמן אמת ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.
Abstract
ביוסינתזה של כלורופיל היא סימן ההיכר של דה-אטיולציה, אחד השלבים הדרמטיים ביותר במחזור החיים של הצמח. התהליך המבוקר היטב והדינמי מאוד של ביוסינתזה של כלורופיל מופעל במהלך המעבר מהחושך לאור בצמחים פורחים. ברגע שבו שתילים אטיולטיביים נחשפים לעקבות הראשונים של אור השמש, המרה מהירה (בסדר שניות) של פרוטוכלורופיליד לכלורופיליד מתווכת על ידי קומפלקסים חלבוניים ייחודיים קולטי אור, המובילים באמצעות שלבים מטבוליים הבאים לייצור כלורופיל מתפקד במלואו. טכניקות סטנדרטיות לניתוח תכולת כלורופיל כוללות מיצוי פיגמנטים מרקמות צמחים מנותקות, שאינו חל על חקר תהליכים מהירים כאלה. כדי לחקור קינטיקה של כלורופיל in vivo בדיוק גבוה וברזולוציה מרחבית-זמנית בשעות הראשונות לאחר דה-אטיולציה הנגרמת על ידי אור, פותחו מכשיר ופרוטוקול. כאן, אנו מציגים הליך מפורט המיועד לכימות סטטיסטי חזק של כלורופיל בשלבים המוקדמים של ארבידופסיס דה-אטיולציה.
Introduction
דה-אטיולציה מייצגת את השלב הדרמטי ביותר במחזור החיים של הצמח, המאופיין במספר שינויים מורפולוגיים וארגון מחדש מלא של חילוף החומרים של הצמח (מהטרו-טרופי לאוטו-טרופי)1. ביוסינתזה של כלורופיל היא סימן היכר של דה-אטיולציה הנגרמת על ידי אור בצמחים ותהליך דינמי מאוד. היווצרות כלורופיל מקודמן פרוטוכלורופיליד המיוצר בייצור כהה חייבת להיות מתואמת היטב כדי למנוע נזק כתוצאה מתוצרי לוואי תגובתיים2. ההפחתה של פרוטוכלורופיליד לכלורופיליד מזרזת על ידי פרוטוכלורופיליד אוקסידורדוקטאז (PORs) תלויי אור, אנזימים ייחודיים המופעלים ישירות על ידי אור. התגובה מהירה מאוד, מתרחשת בסדר גודל של ms עד s3, מה שמוביל להצטברות כלורופיל מזוהה בתוך דקות לאחר הקרנת שתיל אטיולציה 4,5,6. נדרש זמן רב יותר (משעות עד ימים) לביוגנזה של כלורופלסט כדי להקים מנגנון פוטוסינתטי מתפקד במלואו3.
קיימות שיטות שונות לניתוח תכולת הכלורופיל, כולל כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) או ספקטרופוטומטריה. בדרך כלל, טכניקות אלה דורשות הרס של רקמת הצמח 4,5,6, ומגבילות את קביעת השינויים ברמות הכלורופיל לאורך זמן. שיטות המאפשרות ביסוס קינטיקה לא פולשנית של כלורופיל עשויות לפתוח נקודת מבט חדשה לגמרי לחקר צמחים בהיבטים מגוונים, החל משאלות מחקר בסיסיות, כגון ניתוח תהליך סינתזת הכלורופיל בזמן ובמרחב, וכלה ביישומים מעשיים יותר, כגון הערכת סבילות לעקה או השפעת ביוסטימולנטים על קינטיקה של כלורופיל. בהתחשב בכך, הצגנו מערכת לניטור היווצרות כלורופיל, iReenCAM7. הוא משלב מצלמת CCD, מסנני פליטה, מקורות אור וצינור לניתוח פלואורסצנטי אוטומטי (איור 1). התכונה העיקרית של המכשיר שפותח היא רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה, העולה על הביצועים בפרמטרים המשמשים בגישות הנוכחיות, ורגישות מספקת וספציפיות בהשוואה לשיטות אנליטיות סטנדרטיות7.
ההליך הלא פולשני המתואר כאן דורש ריאגנטים מינימליים וכולל צעדים פשוטים, המאפשרים לקבל פרופיל קינטיקה כלורופיל בשתילי ארבידופסיס חיים בשלבים מוקדמים מאוד של דה-אטיולציה. הפרוטוקול יכול להיות שימושי לחקר תהליך דינמי מאוד של סינתזת כלורופיל המושפע ממספר גורמים, הן אקסוגניים (מלח, בצורת, ביוסטימולנטים, מתכות כבדות וכו ') והן אנדוגניים (הקשורים בדרך כלל לשינויים בפעילות הגנים) במקור ללא צורך לנתק רקמת צמח כלשהי, ובכך להימנע מעקה נוספת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה בינונית
- הכינו את מדיום הגידול על ידי ערבוב 0.75 גרם של חומר ג'לינג עם 50 מ"ל של מים סטריליים נטולי יונים, בבקבוק זכוכית כדי להשיג ריכוז של 1.5% (w/v) עבור צלחת פטרי אחת (120 x 120 x 17 מ"מ). נערו בעדינות את התערובת ולאחר מכן חממו אותה במיקרוגל עד לרתיחה כדי להמיס את חומר הג'לינג (התמיסה הופכת ברורה).
- אפשר למדיום להתקרר ל-58-60 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך לשלבים הבאים. כל השלבים הבאים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית כדי למנוע זיהום.
- השתמשו בלוחות פטרי עם קצוות אטומים לאור כדי למנוע השתקפות אור אקטיני מוגזמת ופלואורסצנטיות גבוהה ברקע במהלך המדידות. לשם כך, מרחו סרט הדבקה שחור (או אמצעים זמינים אחרים) כדי לכסות את כל הצדדים של צלחת פטרי הריקה (איור 2).
- בצע עיקור של הצלחת(ים) לאחר יישום סרט על ידי הקרנה עם מנורת UV germicide במשך 20-30 דקות.
- אם הניסוי כולל טיפול כימי (כלומר, גורמי עקה אביוטיים/ביוטיים, הורמונים צמחיים ו/או מווסתי גדילה וכו'), יש להוסיף את הכמות המתאימה של הכימיקל המתאים ישירות למדיום. שימו לב ליציבות כימית שנבחרה מתווספת למדיה (לדוגמה, אם החומר הכימי אינו תרמוס, הוסיפו למדיום כאשר הוא מקורר ממש לפני שאתם מוזגים אותו לצלחת). ערבבו היטב את המדיום על ידי ניעור כדי להבטיח פיזור אחיד של הכימיקל.
- הימנע מהארת לוחות לאור UV לאחר שפיכת המדיה (יוביל לייצור רדיקלי חמצן שעלול להפריע לניסוי).
- יוצקים את התווך המוכן לתוך צלחות הפטרי המרובעות ומניחים למדיום להתמצק בטמפרטורת החדר.
2. עיקור פני השטח של זרעים ותנאי גידול צמחים
- קבל את הכמות הנדרשת של זרעי Arabidopsis thaliana Col-0 מן balk מלאי (10-20 מ"ג) ולהוסיף אותו צינור microcentrifuge 2 מ"ל.
הערה: אין צורך בשינויים ספציפיים בעת עבודה עם קווי Arabidopsis שונים (ecotype/mutant lines). יש לבצע רביזיה של רשת הניסור ושלבי מדידה עבור מיני צמחים אחרים תוך התחשבות בהבדלים בגודל הזרעים, קצב הנביטה וגודל השתיל. - עיקור פני השטח של זרעי Arabidopsis על ידי הוספת 70% אתנול לצינור למשך 2 דקות. נערו בעדינות את הצינורות במהלך העיקור.
- הסר אתנול על ידי pipeting בזהירות, נזהר לא לאבד זרעים. שטפו את הזרעים על ידי הוספת מים סטריליים לצינור למשך 5 דקות כדי להסיר שאריות אתנול (נערו בעדינות את הצינורות במהלך תקופת הכביסה).
- תן לזרעים משקעים לתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה, להסיר את המים הנותרים.
- שטפו את הזרעים שוב פעמיים במים סטריליים כמתואר בשלב 2.3 כדי להבטיח שהם נקיים מכל תכונות אתנול. תן לזרעים משקעים לתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה, להסיר את המים הנותרים.
- הוסיפו נפח שווה של מים סטריליים לצינור המכיל את הזרעים כדי ליצור תרחיף של מי זרעים.
- השתמשו ברשת זריעה כדי לפזר באופן שווה את תרחיף מי הזרעים של הגנוטיפ הנתון באזורים שנבחרו בלוח הבינוני (איור 2 ואיור משלים 1). מפזרים את הזרעים (כ-30-40) בשורה בכל אזור בעזרת קצה פיפטה רחב.
- הניחו למים להתייבש באזורי הזרעים במשך כ-30 דקות, תוך שמירה על הצלחת(ות) פתוחות במכסה מנוע זרימה למינרית למניעת זיהום. אטמו את הצלחת בסרט מיקרו-נקבוביות ועטפו אותה ברדיד אלומיניום.
- ריבוד הזרעים במשך 3 ימים ב 4 ° C בחושך כדי (בהתאם לאקוטיפ בשימוש) להתגבר על תרדמת הזרעים ו / או לקדם נביטה אחידה.
- מעבירים את הצלחת עם זרעים מרובדים לאור לבן (150 μmol/m2/s) למשך שעה אחת כדי לגרום לנביטה (יש להסיר את עטיפת נייר הכסף רק לטיפול באור).
- לאחר הטיפול באור, לעטוף את הצלחת עם רדיד אלומיניום כדי להגן על הזרעים מפני אור ומניחים אותו במצב אנכי בתא צמיחה לטפח במשך 4 ימים בחושך ב 21 מעלות צלזיוס.
3. מדידה וניתוח פלואורסצנטי של כלורופיל
- הפעילו את מערכת iReenCAM וודאו שהמערכת מוכנה ומוגדרת כראוי בתוכנת שרת PS המופעלת באופן אוטומטי (למשל, אם יש מספיק מקום אחסון לנתוני הניסוי, אם מצלמת הפלואורסצנטיות מחוברת למחשב וכו').
- הפעל את תוכנת המתזמן כדי ליצור את תוכנית הניסוי עבור המדידה על-ידי לחיצה על ניסויים > ניסוי חדש. ספק שם תיאורי לניסוי ומלא את הפרטים (תיאור).
- הגדר את הפעולות הדרושות לניסוי על ידי לחיצה על הוסף פעולה שתוביל ללוח הזמנים של פעולות הניסוי.
הערה: המילה פעולה כאן פירושה ביצוע ניסוי שלם (כלומר, כולל כל השלבים הדרושים לביצוע מדידת לוח אחד). - ציין את התנאים למדידה עגולה אחת (כלומר, אורך תקופת האור/חושך).
- על-ידי לחיצה על צור רשימה , הגדר את מרווחי הזמן בין סבבי מדידה. בחר את הזמן שבו הסבב יתחיל ויסתיים (4 שעות בסך הכל) ואת המרווחים בין הסיבובים (במערך הנוכחי סבב אחד כל 2 דקות).
- לחץ על צור וודא שמסגרת הזמן והמרווחים בין דחפי האור נכונים על-ידי בדיקת הרשימה שנוצרה בצד שמאל של המסך.
- בחרו את פרוטוקול המדידה (איור משלים 2). שמור את כל השינויים במסד הנתונים לעיון עתידי.
- רגע לפני תחילת המדידה, השתמשו באור ירוק בעוצמה נמוכה (ראו טבלת חומרים) בתוך החדר החשוך והתאימו את מפלס המדף בתוך תא המדידה או בצעו שלבי הכנה אחרים לפני הסרת נייר הכסף מצלחת הפטרי. לאחר מכן כבו את האור והעבירו את הלוחות לתא המדידה בחושך מוחלט.
- הסירו בזהירות את רדיד האלומיניום המכסה את צלחת הפטרי המכילה את השתילים בני 4 הימים. הניחו את צלחת הפטרי אופקית בתוך תא המדידה של המכשיר. בתוך התא, לגרום פולסים אור אקטיני, ולבצע הדמיה על פי תוכנית הניסוי (פעולות) שנקבעו בשלבים 3.1-3.7.
הערה: חשוב להימנע מכל הארה של הלוחות עם שתילים אטיולטיים לפני הכנסתם לתא המדידה. המניפולציה עם הצלחת עם שתילים אטיולטיים חייבת להתבצע בחדר/חדר חשוך (למערך ניסויי אפשרי ראו איור משלים 3).
4. חילוץ וניתוח נתונים
- לאחר השלמת המדידה, פתח את הניסוי המתאים בתוכנת הנתח.
- כדי לנתח את הפלואורסצנטיות של השתילים, צרו שני סוגים של מסכות- מסכה גסה (מגש) המכסה את האזור בו נמצאים השתילים, ומסכה מדויקת (צמחית) המכסה רק את הרקמה המעניינת (בדרך כלל קוטילדונים).
- צור מסיכת מגש על-ידי לחיצה על האפשרות צור סוג מגש חדש . הקצו את שמות הגנוטיפים המתאימים לאזורים המתאימים בתמונת הלוחות.
- להקצאת גנוטיפ, בחר מספר תמונה בעגול ולאחר מכן לחץ על טען תמונה בחלק העליון של המסך. תמונת הצלחת תוצג על המסך. על ידי לחיצה על כל אחד מסט הכפתורים המייצגים כלי ציור של צורות שונות (איור משלים 4), הזן מצב צורה חדשה המאפשר לצייר את אזור העניין בתמונת הצלחת. בחר את האזורים הדרושים (למשל, גנוטיפים שונים על הצלחת) וספק את השמות המתאימים להם.
- לחץ על Esc כדי לצאת ממצב הצורה. שמור את מסיכת המגש שנוצרה (לאחר שתספק שם עבורה) על-ידי לחיצה על סוג מגש חנות.
- חזור שלב אחורה והחל את המסיכה שנוצרה בשלבים קודמים על-ידי בחירת שמה מהאפשרות שנה לפי סוג מגש .
- ליצירת מסיכת צמחים בדיוק גבוה, השתמשו בתמונה שהתקבלה לאחר 180 דקות מדידה (סבב 91) כדי להגדיר את ערך הסף המינימלי לעוצמת אות פלואורסצנטי, ולאפשר חיסור רעשי רקע. לשם כך, הסר את הסימון מהסף האוטומטי והגדר סף ידני על 0 (איור משלים 4).
- לחצו על 'תצוגה מקדימה' כדי לוודא שמסיכת המגש מכסה את כל האזורים הדרושים (גנוטיפים) בתמונת הלוח. לשם כך, בחר סיבוב 91 ולחץ על רענן תצוגה מקדימה.
- היכנס לתפריט הפעלה על-ידי לחיצה על הפעל. הפעל את הניתוח באופן בלעדי עבור סיבוב 91 על ידי הצבת סמן רק בסיבוב 91. לאחר מכן בחר את נתיב הפלט ולחץ על התחל ניתוח.
- לאחר סיום הניתוח, תפריט סיום ייפתח באופן אוטומטי. בחר את הסבב המבוצע (הוא יהיה היחיד) מתוך ניסויים ולחץ על החלף מנתח לנתונים מנותחים כדי לייצא את הנתונים עבור נקודת זמן ספציפית זו (סבב 91).
- חלץ את קובץ ה- .xsel מהארכיון המיוצא, מכיוון שקובץ זה מכיל את המידע החיוני על מסיכת הצמח על-ידי לחיצה על סמל פתח ייצוא חלק .
- פתח מחדש את הניסוי על-ידי לחיצה על סמל פתח חלק ניתוח מקומי . היכנסו שוב לתפריט 'בונה מסיכות ', לחצו על 'טען תמונה', בחרו 'עיגול 1' ולאחר מכן ' טען מקובץ ' בפינה השמאלית העליונה של המסך וטענו את קובץ ה- .xsel שחולץ בעבר. תמונת הצלחת תוצג עם מסיכת המגש מוחלת.
- שמור את המסיכה על-ידי לחיצה על סוג מגש חנות והחל אותה על-ידי בחירת שמה באפשרות שנה לפי סוג מגש .
- צור את מסיכת הצמח על-ידי התאמת סף עוצמת האות הפלואורסצנטי. הגדל את הערך של סף ידני עד שהמסיכה שנוצרת בתפריט התצוגה המקדימה תתאים באופן מושלם להחזר ההשקעה (לדוגמה, cotyledons) בכל אחד מהגנוטיפים (איור משלים 4). בדקו אם המסיכה מתאימה לכל סבבי המידות באמצעות גלילה לאורך כל הסיבובים (בדיקת מיקום המסיכה הנכון בעיגולים 1, 61 ו-121 אמורה להספיק) בתפריט 'תצוגה מקדימה '.
- בצע את הניתוח עבור כל סבבי המדידה וייצוא הנתונים.
הערה: קובץ הפלט כולל ערכים פלואורסצנטיים של כלורופיל של גנוטיפ נתון עבור כל נקודת זמן, מה שמאפשר בניית תרשימים לפי בחירה ומקל על הערכה סטטיסטית נוספת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התפוקה האופיינית המתקבלת באמצעות ההליך החדש שפותח בשתילי Arabidopsis בני 4 ימים ללא אטיולציה של סוג בר (WT), אקוטיפ קולומביה-0 (Col-0) מוצגת באיור 3. בתנאי בקרה (מדיה של טרשת נפוצה בתוספת DMSO), העקומה הביוסינתטית של הכלורופיל מתחילה בפרץ ראשוני של סינתזת הכלורופיל, שבו מאגר הפרוטוכלורפיליד המסונתז במהלך השלב הסקוטומורפוגני של הגידול, מומר במהירות לכלורופיל הודות ל-PORs 7,8,9 המושרים באור. השלב הראשוני של הצטברות כלורופיל מהירה אורך כ-10 דקות ואחריו מגיע שלב ההשהיה, שבמהלכו מגיעים למינימום של הפרוטוכלורופיליד המסונתז כהה (כ-30 דקות לאחר הקרינה; לעקומת הפרוטוכלורופיליד שנמדדה על-ידי HPLC, ראו7). במהלך שלב הפיגור, הגנים הביוסינתטיים של הכלורופיל מווסתים10, מה שמוביל לייצור המושרה על ידי אור של פרוטוכלורופיליד. הפרוטוכלורופיליד המסונתז החדש מומר מיד לכלורופיל, וניתן לזיהוי כשלב מעריכי (במקרה של WT Col-0 החל מכ-120 דקות לאחר ההקרנה), ומסתיים בשלב פיגור נוסף לאחר כ-4 שעות לאחר הקרנת השתיל שבוטל (איור 3). בנוכחות 6-בנזילאמינופורין (BAP), ההבדלים המשמעותיים הראשונים ניתנים לזיהוי במהלך השלב המעריכי7, מה שמרמז על השפעה שלילית של BAP על קינטיקה של כלורופיל בשלבים מאוחרים יותר של ביוסינתזה של כלורופיל (בערך שעתיים לאחר תחילת ההארה באור אקטיני; איור 3).
לצורך השוואה בין תנאים ו/או גנוטיפים שונים, יש צורך בנורמליזציה של הנתונים הגולמיים. מכיוון שלא ניתן היה לזהות כלורופיל באמצעות HPLC בתנאים שונים ו/או גנוטיפים שונים בשתילים שעברו אטיולציה, ביצענו את הנורמליזציה (F/F0) לרמות הפלואורסצנטיות T0 (F0) שנמדדו עבור הטיפול המתאים ו/או גנוטיפ7. כדי להדגים את חשיבות הנורמליזציה, אנו מציגים הן את הנתונים הגולמיים והן את הנתונים המנורמלים לערך הפלואורסצנטי הממוצע של כלורופיל שנמדד ב- T0 (F0; איור 3A ואיור 3B, בהתאמה).
איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול מכשיר מדידה. התוכנית של צינור מדידה וניתוח iReenCAM. (A) הכנת דגימה על ידי זריעת זרעים מוגדרת רשת, ריבוד, השראת אור של נביטה וטיפוח צלחת פטרי בכיוון אנכי בחשכה. (B) מודול בקרה לרכישת תמונה אוטומטית וניתנת לתכנות וניהול נתונים המבוסס על פנוטיפ PlantScreen ארגז כלים SW מארגן את פעולת המערכת כולה על ידי שליטה וסנכרון פעולת HW עם פרוטוקול מדידה וניתוח המוגדר על ידי המשתמש. (C) פרוטוקול המדידה מיועד למדידות דינמיות של תמונות הדגימה הפלואורסצנטית במרווחים של 2 דקות למשך 4 שעות בסך הכל, כלומר 120 סבבי מדידה. מסגרת חזותית של תמונה מייצגת בצבע כוזב של שתילי Arabidopsis בני 4 ימים בכיוון אנכי שנרכשו בזמן 180 דקות משמש ליצירת מסכת ROI. (D) מסיכה המגדירה ROI עבור רקמה מעניינת (למשל, cotyledon, hypocotyl, או אזור שורש) מוחלת על מסגרת הזמן החזותית, חיסור רקע מבוצע ופיקסל אחר פיקסל ערכי פלואורסצנטיות עבור כל ROI (מוגדר על ידי מסיכת הצמח) מכל סבבי המדידה. לבסוף, הנתונים הגולמיים (פלואורסצנטיות F) מנורמלים לערך הפלואורסצנטי הממוצע ב- T0 (F0). פסי קנה מידה = 1 ס"מ (A) ו- 0.25 ס"מ (C). הנתון שונהמ-7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקום זרעים. באיור נראים הנחת זרעי ארבידופסיס על צלחת פטרי עם קצוות אטומים לאור באמצעות רשת הניסור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קינטיקה של הצטברות כלורופיל בשלבים המוקדמים של דה-אטיולציה של Arabidopsis . שתילי WT Col-0 שעברו אטיולציה גודלו על מדיה בתוספת BAP או DMSO (דמה). (A) הערך הממוצע ± SD (אזור מוצלל), n=9 של נתונים גולמיים ו- (B) נתונים מנורמלים לערך הפלואורסצנטיות הממוצע ב-T0 (F0). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים משלים 1: רשת זריעה. משמאל: רשת זריעה עם תיבות מלבניות משורטטות להנחת הזרעים של כל גנוטיפ בנקודת מדידה הממוקמת באזור הומוגניות האור האקטינית (עוצמת האור ≥ 0.7 מעוצמת האור המרבית). מימין: ייצוג סכמטי של שתילי ארבידופסיס בני 4 ימים, שגודלו לצורך הניתוח. רשת הזריעה מספקת סכמה אפשרית למיקום זרעי Arabidopsis המבטיחה הומוגניות אור וצפיפות זרעים נאותה (כל חריץ יכול לשמש למיקום זרעים מכיוון שגודל החריץ, המרחק בין החריצים וההומוגניות האור באזור הרשת מאוחדים). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 2: פרוטוקול מדידת פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: תצורה ניסיונית המאפשרת להימנע מחשיפה לא רצויה לאור. (A) מכשיר המדידה ממוקם בחדר הפיטוטרון, (B) לתא המופרד בדלת אטומה לאור. (C) קופסאות הגידול במבחנה (ראש חץ אדום) המיועדות לגידול שתילים בתנאים מוגדרים (טמפרטורה ולחות יחסית) ממוקמות ממש מתחת למכשיר (ראש חץ צהוב), ומבטיחות את הסיכון המינימלי לחשיפה לאור. מקור האור הירוק העמום (ראש חץ כחול) מותקן על הקיר ליד מחשב הבקרה (ראש חץ כתום). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 4: הליך יצירת מסיכה בתהליך העבודה באמצעות תוכנת מנתח הנתונים של PS. הדפס צילומי מסך של שלבים בודדים שיש לבצע עבור יצירת מסיכת המגש (שלבים 4.3-4.6) ומסיכת צמחים (שלב 4.12) וניתוח נתונים (שלבים 4.7 ו- 4.13). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 5: צפיפות הזריעה המשפיעה על שונות המדידה. קינטיקה של הצטברות כלורופיל בשתילי Arabidopsis WT Col-0 בני 4 ימים שגדלו ( A) בנפרד (כשתילים בודדים, כאן n=5) או בקבוצה של (B) גבוהה (HD, n = 30-40) או (C) צפיפות נמוכה (LD, n = 10-15). n מתאים למספר שתילים לכל חריץ של רשת הזריעה, הנתונים מייצגים את הערכים הממוצעים ± SD (אזור מוצלל). הצפיפות הגבוהה או הנמוכה מתאימה למספר השתילים לכל חריץ ברשת הזריעה כאמור. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 6: מרווח גידול ומרחב דורשים אופטימיזציה ספציפית למין. גידול מיני צמחים שונים באמצעות פרוטוקול מותאם Arabidopsis. (A) הנחת זרעים על רשת הזריעה. (B) שתילים בני 4 ימים של (משמאל לימין) Arabidopsis thaliana, Brassica napus ו-Crambe abyssinica. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים של הפרוטוקול ופתרון בעיות - אין אור ודואגים למסכה
כפי שמודגש ישירות בתיאור הפרוטוקול לעיל, הימנעות אפילו מכמויות זעירות של אור הן במהלך גידול שתילי צמחים שעברו אטיולציה והן ממש לפני תחילת הפרוטוקול היא בעלת חשיבות קריטית11. במערך שלנו, אנו משתמשים בתא חשוך ייעודי הממוקם בפיטרון ומופרד משאר הפיטוטרון באמצעות דלת מסתובבת אטומה לאור (איור משלים 3). התא מצויד בחלל גידול צמחים ושולחן עבודה המאפשר להכיל את המכשיר יחד עם מחשב בקרה ומכסה מנוע. זה מאפשר לנו גם לגדל את הצמחים בחושך וגם להתחיל את המדידה ללא צורך בהובלת צלחות.
הדרך של גידול צמחים ויצירת מסכות היא קריטית לכימות הבא של אות פלואורסצנטיות כלורופיל באמצעות הבדיקה המוצעת. יש להימנע מקבלת גושים של חומר ג'לינג או זבל חזותי קטן / אבק בתקשורת כפי שהוא עלול לגרום השתקפות אור. מכיוון שהזיהוי של כלורופיל פלואורסצנטי על ידי התוכנה מוגבל על ידי המסכה, אזור צמח שלא יכוסה על ידי המסכה פשוט לא ינותח על ידי התוכנה. במהלך המדידה של 4 שעות, שתילים גדלים/זזים מעט, ולכן מסיכה ייעודית עשויה לדרוש התאמות מכיוון שהיא עשויה שלא להתאים דרך כל סבבי המדידה לכימות מדויק של עוצמת האות. על פי ניסיוננו, נראה שהגדרת המסכה הלא מושלמת היא המקור העיקרי לשונות. במהלך ניסויי האופטימיזציה עקבנו אחר השינויים בשונות של ערכי פלואורסצנטיות של כלורופיל שנלקחו לניתוח ב-i) שתילים בודדים וקבוצת שתילים עם ii) זריעה בצפיפות גבוהה יותר (30-40 זרעים) ו-iii) זריעה בצפיפות נמוכה יותר (10-15 זרעים) (איור משלים 5). השתמשנו בצפיפות גבוהה יותר של זריעת זרעים מכיוון שהיא הראתה את השונות הנמוכה ביותר. השונות הגבוהה יותר שנצפתה במקרה של שתילים בודדים / זריעה בצפיפות נמוכה יותר נובעת בעיקר מהיחס הגבוה יותר של פיקסלים הממוקמים בקצה שבין האות לרקע ומהתנועה הקלה של השתילים במהלך מרווח המדידה של 4 שעות.
כדי לוודא שכל המדידות מדויקות, בדקו אם מסיכת הצמח מתאימה לסיבוב הראשון, ולאחר מכן לסיבובה-15, ה-30, ה-45, ה-60ה-75 וכן הלאה עד האחרון (על-ידי בחירת מספר הסבב ולחיצה על רענן תצוגה מקדימה). זה ייקח רק כמה דקות, אבל יבטיח כי כל אזור cotyledon מכוסה ומוערך. אם בכל סיבוב מסכת הצמח אינה מתאימה (האזור הנדרש אינו מכוסה במלואו), חלקו את הניסוי למספר חלקים. לאחר מכן בצע את הפרוטוקול החל משלב 4 (4.1-4.13) כדי ליצור מסיכה ספציפית בנפרד עבור כל חלק של הניסוי. לדוגמה, אם אתם מבחינים בתזוזה של מסיכת הצמח בסבב 60-61 (או מעט קודם לכן), חלקו את הניסוי לשני חלקים - חלקאחד (1-60 סיבובים) וחלקשני (61-121 סיבובים). עבור החלקהראשון השתמש בתמונה של סיבוב 41 כדי ליצור מסיכת צמח ועבור החלקהשני השתמש בסיבוב 91. בשלב 4.13, בעת ניתוח הנתונים, יש להקפיד לבחור את הסבבים בהתאם לחלק המתאים של הניסוי (למשל, סבבים 1-60 עבור החלק הראשון ו-61-121 עבור החלק השני, כמו בדוגמה שהוזכרה לעיל) לפני לחיצה על נתח. כאשר עובדים עם Arabidopsis, התנועה של צמחים היא זניחה כפי שהם גדלים לאט למדי, אבל אם מיישמים את הפרוטוקול עבור מינים שונים (ראה להלן), קצב הצמיחה צריך להילקח בחשבון.
שינויים ומגבלות
ניתן לשנות את מספר הפרמטרים, כולל עוצמת ואורך הגל של האור האקטוני ו/או האור המופעל בין מרווחי השימוש באור האקטוני. מכשיר המדידה כולל את גלגל המסנן המשולב, הממונע במלואו ונשלט על ידי תוכנה. לפיכך, אלגוריתם המדידה המתאים לכימות פיגמנטים אחרים, בדרך כלל גם תוצרים של המסלול הביוסינתטי טטרפירולה10,12, עשוי להיכלל בפרוטוקול במקרה של הוספת המסננים המתאימים.
כמו כן, כפי שהוזכר קודם לכן, הפרוטוקול יכול לשמש לא רק עבור צמחים Arabidopsis . עם זאת, כאשר עובדים עם מיני צמחים אחרים, כל שלב בפרוטוקול צריך להיות מתוקן בהתאם תוך התחשבות במאפיינים הספציפיים למין, כולל קצב הנביטה והגדילה ו/או הגודל (איור משלים 6).
אחת המגבלות החשובות של הפרוטוקול היא טווח הזמן, שבמהלכו ניתן לבצע את ניתוח כימות הכלורופיל. לאחר שהכלורופיל משתלב בקומפלקסים של המערכת הפוטו-מערכתית, האות הפלואורסצנטי הופך להיות מוטה על ידי צריכת האנרגיה של הפוטוסינתזה (מה שנקרא פלורסנציה משתנה של כלורופיל קיים) כפי שנצפה בשלבים מאוחרים יותר של דה-אטיולציה13. כפי שנבחן באמצעות בדיקת OJIP transients14,15, לא ניתן היה לזהות סימנים לפעילות פוטוסינתטית באמצעות מערך ניסיוני זה במהלך 4 השעות הראשונות של דה-אטיולציה7. עם זאת, אם פרק הזמן הממושך של פוטומורפוגנזה אמור/הכרחי לבדיקה, יש לבדוק את רמת הרכבת הפוטו-מערכות ואת ההשפעה האפשרית של פוטוסינתזה על רמות הפלואורסצנטיות הכוללות.
לבסוף, יש לציין כי הפרוטוקול שלנו, המבוסס על מדידות פלואורסצנטיות, מאפשר כימות כלורופיל יחסי, ולא מוחלט. אם יש צורך בכימות מוחלט, יש לבצע כיול מתאים באמצעות חלופה, למשל גישת HPLC.
מובהקות ביחס לשיטות הקיימות - כימות כלורופיל פשוט, מהיר וחזק סטטיסטית עם זמן גבוה ורזולוציה מרחבית
ההליך המתואר כאן מאפשר זיהוי וכימות בזמן אמת של כלורופיל בשתילי ארבידופסיס חיים בשלבים מוקדמים של דה-אטיולציה. בהשוואה לגישות אחרות המסתמכות בעיקר על מיצוי כלורופיל מחומר צמחי מנותק16,17 או שיטות אופטיות שפותחו לאחרונה18,19, גישה זו אינה פולשנית לחלוטין, ומאפשרת כימות כלורופיל על ידי מדידת in vivo של עוצמת הפלואורסצנטיות. כמו כן, אין צורך בריאגנטים נוספים הדרושים להכנת הדגימה כמו בשיטות חלופיות קיימות אחרות, כולל גישות מבוססות HPLC או ספקטרופוטומטריה שהוזכרו לעיל. הפרוטוקול החדש שהוצג הוא פשוט, מהיר ומדויק, כפי שאומת בעבר באמצעות HPLC5. באמצעות הגדרות הפרוטוקול הסטנדרטיות, העקומה הסופית של חזרה ביולוגית אחת מורכבת מ-120 נקודות מדידה (אמצעי עוצמת פלואורסצנטיות) שנלקחו במהלך 4 שעות של המדידה, שכל אחת מהן מורכבת מעד 15 נקודות מדידה. בדרך כלל, העקומה הסופית כוללת נתונים של שלושה העתקים ביולוגיים (למשל, שלושה לוחות שהוכנו באופן עצמאי), ושלושה נקודות מדידה (שלושה העתקים טכניים), שכל אחד מהם מורכב מ-30-40 שתילים. לפיכך, ישנם כ -300 שתילים שנבדקו בכל מרווח זמן, המספקים מערך נתונים חזק סטטיסטית, המאפשר לזהות באופן אמין אפילו הבדלים קטנים כפי שהודגם על מוטנטים מושפעים בשלבים שונים של ביוסינתזה של כלורופיל7. כאן אנו מעודדים את המשתמש להשתמש בגישה הסטטיסטית שפותחה לאחרונה המבוססת על מודלים מעורבים ליניאריים כלליים בשילוב עם מודלים קלאסיים של סדרות זמן ככלי מתאים לניתוח נתוני קינטיקה כלורופיל20.
יישומים עתידיים של הטכניקה - סינון מהיר וזול
התכונות הנ"ל הופכות גישה זו לכלי שימושי המתאים לסינון מהיר וזול ולכימות מדויק ביותר של תכונות הקשורות (במישרין או בעקיפין) לביוסינתזה של כלורופיל. זה עשוי לכלול מחקרים המשתמשים בסינון גנטי קדמי כדי לאפיין טוב יותר את התקנות המורכבות והמרובות רמות של ביוסינתזה של כלורופיל 10,12,21. בהתחשב באפשרות של טיפול בתרכובות שונות, הפרוטוקול הוא גם בעל ערך רב כדי לחקור, למשל, את החשיבות של תקנות הורמונליות בתיווך אור22,23 או סינון עבור תרכובות מולקולריות נמוכות עם השפעה אפשרית על קינטיקה של הצטברות כלורופיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ז.ב. וק.פ. הם עובדי PSI ומרטין טרטילק הוא המנכ"ל והבעלים של חברת PSI המייצרת את iReenCAM. כל המחברים הללו היו מעורבים בפיתוח הכלי כמתואר לעיל7.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן האירופית לפיתוח אזורי-פרויקט SINGING PLANT (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). פרויקט זה קיבל מימון באמצעות פרויקט MSCA4Ukraine (ID 1233580), הממומן על ידי האיחוד האירופי. אנו אסירי תודה ללנקה סוצ'ורקובה על העיצוב הגרפי של איור 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
| Cultivation chamber | PSI | custom made | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
| Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
| Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
| Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
| Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |
References
- Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L.
- Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
- Heyes, D. J., et al. Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development. Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).
- Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples. Plant Methods. 9 (1), 19 (2013).
- Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination. Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).
- Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry. Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).
- Balakhonova, V., et al. Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation. Front Plant Sci. 14, 1093292 (2023).
- Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts. Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).
- Reinbothe, C., et al. Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction. Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).
- Kobayashi, K., Masuda, T. Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 7, 1811 (2016).
- Wang, Y., Folta, K. M. Contributions of green light to plant growth and development. Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).
- Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae. Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).
- Pipitone, R., et al. A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis. eLife. 10, e62709 (2021).
- Stirbet, A. G. On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient. J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).
- Kupper, H., et al. Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging. Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Kósa, A., Preininger, É, Böddi, B. Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures. Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).
- Liang, Y., et al. A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings. Plant Met. 13 (1), 26 (2017).
- Pérez-Patricio, M., et al. Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves. Sensors. 18 (2), 650 (2018).
- Spyroglou, I., et al. Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences. Plants (Basel). 10 (2), (2021).
- Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T.
- De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development. Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).
- Liu, X., Li, Y., Zhong, S. Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis. Front Plant Sci. 8, 1433 (2017).
