Summary
Aquí, describimos una herramienta avanzada diseñada para el monitoreo de la biosíntesis de clorofila durante las primeras etapas de la desetiolación de plántulas de Arabidopsis . La novedosa metodología proporciona imágenes no invasivas de fluorescencia de clorofila en tiempo real a alta resolución espacial y temporal.
Abstract
La biosíntesis de clorofila es un sello distintivo de la desetiolación, una de las etapas más dramáticas en el ciclo de vida de las plantas. El proceso de biosíntesis de clorofila, estrechamente controlado y altamente dinámico, se desencadena durante el cambio de la oscuridad a la luz en las plantas con flores. En el momento en que las plántulas etioladas se exponen a los primeros rastros de luz solar, la conversión rápida (en orden de segundos) de protoclorofilida en clorofilia está mediada por complejos proteicos únicos que aceptan la luz, lo que conduce a través de pasos metabólicos posteriores a la producción de clorofila completamente funcional. Las técnicas estándar para el análisis del contenido de clorofila incluyen la extracción de pigmentos de tejidos vegetales desprendidos, lo que no se aplica al estudio de procesos tan rápidos. Para investigar la cinética de la clorofila in vivo con alta precisión y resolución espacio-temporal en las primeras horas después de la desetiolación inducida por la luz, se desarrollaron un instrumento y un protocolo. Aquí, presentamos un procedimiento detallado diseñado para la cuantificación estadísticamente robusta de clorofila en las primeras etapas de la desetiolación de Arabidopsis .
Introduction
La desetiolación representa la fase más dramática del ciclo de vida de las plantas, caracterizada por una serie de cambios morfológicos y un reordenamiento completo del metabolismo de las plantas (de hetero a autotrópico)1. La biosíntesis de clorofila es un sello distintivo de la desetiolación inducida por la luz en las plantas y un proceso muy dinámico. La formación de clorofila a partir de protoclorofilida, precursora producida en la oscuridad, debe coordinarse estrechamente para evitar daños debidos a subproductos reactivos2. La reducción de protoclorofílidos a clorofilida es catalizada por protoclorofilidos oxidorreductasas dependientes de la luz (POR), enzimas únicas activadas directamente por la luz. La reacción es muy rápida, teniendo lugar en el orden de ms a s3, lo que lleva a una acumulación de clorofila reconocible en cuestión de minutos después de la irradiación etiolada de las plántulas 4,5,6. Se requiere más tiempo (de horas a días) para que la biogénesis del cloroplasto establezca un aparato fotosintético completamente funcional3.
Existen varios métodos para analizar el contenido de clorofila, incluida la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o la espectrofotometría. Por lo general, estas técnicas exigen la destrucción del tejido vegetal 4,5,6, lo que restringe la determinación de los cambios en los niveles de clorofila a lo largo del tiempo. Los métodos que permiten el establecimiento de la cinética de clorofila no invasiva pueden abrir una perspectiva completamente nueva para estudiar las plantas en diversos aspectos que van desde preguntas de investigación fundamentales, como el análisis del proceso de síntesis de clorofila en el tiempo y el espacio, hasta aplicaciones más prácticas, como la evaluación de la tolerancia al estrés o el efecto de los bioestimulantes en la cinética de la clorofila. Teniendo esto en cuenta, introdujimos un sistema para monitorear la formación de clorofila, iReenCAM7. Incorpora una cámara CCD, filtros de emisión, fuentes de luz y una tubería para el análisis automatizado de fluorescencia (Figura 1). La característica principal del dispositivo desarrollado es la alta resolución espacial y temporal, que supera los parámetros utilizados en los enfoques actuales, y la sensibilidad y especificidad suficientes en comparación con los métodos analíticos estándar7.
El procedimiento no invasivo aquí descrito requiere un mínimo de reactivos y comprende pasos simples, lo que permite obtener un perfil cinético de clorofila en plántulas vivas de Arabidopsis durante etapas muy tempranas de desetiolación. El protocolo puede ser útil para el estudio de procesos altamente dinámicos de síntesis de clorofila influenciados por una serie de factores, tanto exógenos (sal, sequía, bioestimulantes, metales pesados, etc.) como endógenos (típicamente asociados a cambios en la actividad génica) de origen sin necesidad de desprender ningún tejido vegetal, evitando así estrés adicional.
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Protocol
1. Preparación media
- Prepare el medio de cultivo mezclando 0,75 g de gelificante con 50 ml de agua desionizada estéril en una botella de vidrio para lograr una concentración del 1,5% (p/v) para una placa de Petri (120 x 120 x 17 mm). Agite suavemente la mezcla y luego caliéntela en un microondas hasta que hierva para disolver el agente gelificante (la solución se vuelve clara).
- Deje que el medio se enfríe a 58-60 °C antes de continuar con los siguientes pasos. Todos los pasos posteriores deben realizarse en condiciones estériles dentro de una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.
- Utilice placas de Petri con bordes herméticos a la luz para evitar una reflexión excesiva de la luz actínica y una alta autofluorescencia de fondo durante las mediciones. Para ello, aplique cinta adhesiva negra (u otros medios disponibles) para cubrir todos los lados de la placa de Petri vacía (Figura 2).
- Realice la esterilización de la(s) placa(s) después de la aplicación de la cinta mediante irradiación con lámpara UV germicida durante 20-30 min.
- Si el experimento implica un tratamiento químico (es decir, estresores abióticos/bióticos, hormonas vegetales y/o reguladores del crecimiento, etc.), agregue la cantidad apropiada del producto químico correspondiente directamente al medio. Tenga en cuenta que se agrega una estabilidad química elegida al medio (por ejemplo, si el producto químico no es termoestable, agréguelo al medio cuando se enfríe justo antes de verterlo en la placa). Mezcle bien el medio agitándolo para asegurar una distribución uniforme del producto químico.
- Evite la iluminación de las placas a la luz ultravioleta después de verter el medio (conduciría a la producción de radicales de oxígeno que podrían interferir con el experimento).
- Vierta el medio preparado en la(s) placa(s) de Petri cuadrada y deje que el medio se solidifique a temperatura ambiente.
2. Esterilización de la superficie de la semilla y condiciones de crecimiento de las plantas
- Obtenga la cantidad requerida de semillas de Arabidopsis thaliana Col-0 del balk original (10-20 mg) y agréguela a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
NOTA: No es necesario realizar modificaciones específicas al trabajar con diferentes líneas de Arabidopsis (ecotipo/líneas mutantes). La revisión de la rejilla de aserrado y los pasos de medición deben realizarse para otras especies de plantas teniendo en cuenta la diferencia en el tamaño de la semilla, la tasa de germinación y el tamaño de la plántula. - Esterilizar las semillas de Arabidopsis añadiendo etanol al 70% al tubo durante 2 min. Agite suavemente los tubos durante la esterilización.
- Retire el etanol pipeteando con cuidado, teniendo cuidado de no perder semillas. Lave las semillas agregando agua estéril al tubo durante 5 minutos para eliminar cualquier residuo de etanol (agite suavemente los tubos durante el período de lavado).
- Deje que las semillas se sedimenten en el fondo del tubo por gravedad, elimine el agua restante.
- Enjuague las semillas nuevamente 2 veces con agua estéril como se describe en el paso 2.3 para asegurarse de que estén libres de cualquier rasgo de etanol. Deje que las semillas se sedimenten en el fondo del tubo por gravedad, elimine el agua restante.
- Agregue un volumen igual de agua estéril al tubo que contiene las semillas para crear una suspensión de agua y semillas.
- Utilice una rejilla de siembra para distribuir uniformemente la suspensión de agua de semilla del genotipo dado en las áreas seleccionadas de la placa del medio (Figura 2 y Figura 1 suplementaria). Distribuya las semillas (aproximadamente 30-40) en una fila en cada área usando una punta de pipeta ancha.
- Deje que el agua se seque en las áreas de semillas durante unos 30 minutos, manteniendo la(s) placa(s) abierta(s) en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Selle la placa con cinta adhesiva de microporos y envuélvala con papel de aluminio.
- Estratificar las semillas durante 3 días a 4 °C en oscuridad para (dependiendo del ecotipo utilizado) superar la latencia de la semilla y/o promover una germinación uniforme.
- Transfiera la placa con semillas estratificadas a luz blanca (150 μmol/m2/s) durante 1 h para inducir la germinación (desenvuelva la lámina solo para el tratamiento de luz).
- Después del tratamiento con luz, envuelva la placa con papel de aluminio para proteger las semillas de la luz y colóquela en posición vertical en una cámara de crecimiento y cultive durante 4 días en la oscuridad a 21 °C.
3. Medición y análisis de fluorescencia de clorofila
- Encienda el sistema iReenCAM y asegúrese de que el sistema esté listo y configurado correctamente en el software del servidor PS iniciado automáticamente (por ejemplo, si hay suficiente espacio de almacenamiento para los datos del experimento, si la cámara de fluorescencia está conectada a la PC, etc.).
- Active el software Programador para crear el plan experimental para la medición haciendo clic en Experimentos > Nuevo experimento. Proporcione un nombre descriptivo para el experimento y rellene los detalles (descripción).
- Establezca las acciones necesarias para el experimento haciendo clic en Agregar acción , lo que conducirá a la programación de acciones experimentales.
NOTA: La palabra acción aquí significa realizar un experimento completo (es decir, incluir todos los pasos necesarios para realizar una medición de placa). - Especifique las condiciones para una sola medición redonda (es decir, la duración del período de luz/oscuridad).
- Al hacer clic en Generar lista , defina los intervalos de tiempo entre rondas de medición. Elija la hora en la que comenzará y terminará la ronda (4 h en total) y los intervalos entre las rondas (en la configuración actual, una ronda cada 2 minutos).
- Haga clic en Generar y asegúrese de que el marco de tiempo y los intervalos entre los impulsos de luz sean correctos comprobando la lista generada en el lado izquierdo de la pantalla.
- Elija el protocolo de medición (Figura complementaria 2). Guarde todas las modificaciones en la base de datos para futuras consultas.
- Justo antes de que comience la medición, use luz verde de baja intensidad (consulte la Tabla de materiales) dentro de la sala oscura y ajuste el nivel del estante dentro de la cámara de medición o realice otros pasos de preparación antes de retirar la lámina de la placa de Petri. A continuación, apague la luz y transfiera las placas a la cámara de medición en completa oscuridad.
- Retire con cuidado el papel de aluminio que cubre la placa de Petri que contiene las plántulas de 4 días. Coloque la placa de Petri horizontalmente dentro de la cámara de medición del dispositivo. Dentro de la cámara, induzca pulsos de luz actínica y realice imágenes de acuerdo con el plan del experimento (acciones) establecido en los pasos 3.1-3.7.
NOTA: Es fundamental evitar cualquier iluminación de las placas con plántulas etioladas antes de colocarlas en la cámara de medición. La manipulación con la placa con plántulas etioladas debe realizarse en el cuarto oscuro/cámara (para una posible configuración experimental, consulte la Figura complementaria 3).
4. Extracción y análisis de datos
- Después de completar la medición, abra el experimento correspondiente en el software del analizador.
- Para analizar la fluorescencia de las plántulas, genere dos tipos de máscaras: una máscara rugosa (bandeja) que cubra el área donde se encuentran las plántulas y una máscara precisa (planta) que cubra solo el tejido de interés (generalmente cotiledones).
- Genere una máscara de bandeja haciendo clic en la opción Crear nuevo tipo de bandeja . Asigne los nombres de genotipo apropiados a las áreas respectivas en la imagen de la placa.
- Para asignar el genotipo, elija un número de imagen en Redondo y luego haga clic en Cargar imagen en la parte superior de la pantalla. La imagen de la placa se mostrará en la pantalla. Al hacer clic en cualquiera de los conjuntos de botones que representan diferentes herramientas de dibujo de formas (Figura complementaria 4), ingrese al modo Nueva forma que permite dibujar el área de interés en la imagen de la placa. Elija las áreas necesarias (por ejemplo, diferentes genotipos en la placa) y proporcione su nombre apropiado.
- Haga clic en Esc para salir del modo de forma. Guarde la máscara de bandeja generada (después de proporcionarle un nombre) haciendo clic en Tipo de bandeja de almacenamiento.
- Retroceda un paso y aplique la máscara que se generó en los pasos anteriores seleccionando su nombre en la opción Cambiar por tipo de bandeja .
- Para generar una máscara vegetal con alta precisión, utilice la imagen adquirida después de 180 minutos de medición (ronda 91) para establecer el valor umbral mínimo para la intensidad de la señal de fluorescencia, lo que permite la sustracción del ruido de fondo. Para ello, quite la marca de verificación del umbral automático y establezca un umbral manual en 0 (Figura complementaria 4).
- Haga clic en Vista previa para asegurarse de que la máscara de bandeja cubra todas las áreas necesarias (genotipos) en la imagen de la placa. Para ello, elija la ronda 91 y haga clic en Actualizar vista previa.
- Para entrar en el menú Ejecutar, haga clic en Ejecutar. Ejecute el análisis exclusivamente para la ronda 91 colocando una marca solo en la ronda 91. A continuación, elija la ruta de salida y haga clic en Iniciar análisis.
- Una vez finalizado el análisis, el menú Finalizar se abrirá automáticamente. Elija la ronda ejecutada (será la única) de los experimentos y haga clic en Cambiar analizador a datos analizados para exportar los datos de este punto de tiempo específico (ronda 91).
- Extraiga el archivo .xsel del archivo exportado, ya que este archivo contiene la información esencial de la máscara de planta haciendo clic en el icono Abrir pieza de exportación .
- Vuelva a abrir el experimento haciendo clic en el icono Abrir parte de análisis local . Ingrese al menú Mask Builder nuevamente, haga clic en Cargar imagen, elija la ronda 1 y luego Cargar desde archivo en la esquina superior derecha de la pantalla y cargue el archivo .xsel extraído anteriormente. La imagen de la placa se mostrará con la máscara de bandeja aplicada.
- Guarde la máscara haciendo clic en Almacenar tipo de bandeja y aplíquela seleccionando su nombre en la opción Cambiar por tipo de bandeja .
- Genere la máscara vegetal ajustando el umbral de intensidad de la señal de fluorescencia. Aumente el valor de Umbral manual hasta que la máscara generada en el menú Vista previa se ajuste perfectamente al ROI (por ejemplo, cotiledones) en cada uno de los genotipos (Figura complementaria 4). Compruebe si la máscara se ajusta a todas las rondas de las medidas desplazándose a lo largo de las rondas (verificar la posición correcta de la máscara en la ronda 1, 61 y 121 debería ser suficiente) en el menú Vista previa .
- Realice el análisis de todas las rondas de medición y exporte los datos.
NOTA: El archivo de salida incluye los valores de fluorescencia de clorofila de un genotipo dado para cada punto de tiempo, lo que permite la construcción de gráficos de elección y facilita una evaluación estadística adicional.
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Representative Results
En la Figura 3 se muestra el resultado típico obtenido utilizando el procedimiento recientemente desarrollado en las plántulas de Arabidopsis desetioladas de 4 días de edad del ecotipo silvestre (WT) Columbia-0 (Col-0). En condiciones de control (medios MS suplementados con DMSO), la curva biosintética de clorofila comienza con un estallido inicial de la síntesis de clorofila, en el que el pool de protoclorfílidos sintetizado durante la fase escotomorfogénica del crecimiento, se convierte rápidamente en clorofila debido a los PORs inducidos por la luz 7,8,9. La fase inicial de acumulación rápida de clorofila dura aproximadamente 10 minutos y es seguida por una fase de retraso, durante la cual se alcanzan los mínimos de la protoclorofilida sintetizada en la oscuridad (aproximadamente 30 minutos después de la irradiación; para la curva de protoclorofilida medida por HPLC, véase elpunto 7). Durante la fase de retraso, los genes biosintéticos de la clorofila se regulan al alza10, lo que conduce a la producción de protoclorofilida inducida por la luz. La protoclorofilida recién sintetizada se convierte rápidamente en clorofila, detectable como fase exponencial (en el caso de WT Col-0 a partir de aproximadamente 120 min después de la irradiación), terminando con otra fase de retraso aproximadamente 4 h después de la irradiación de la plántula desetiolada (Figura 3). En presencia de 6-bencilaminopurina (BAP), las primeras diferencias significativas son detectables durante la faseexponencial 7, lo que sugiere un efecto negativo de la BAP sobre la cinética de la clorofila en etapas posteriores de la biosíntesis de clorofila (aproximadamente 2 h después del inicio de la iluminación con luz actínica; Figura 3).
Para la comparación de diferentes condiciones y/o genotipos, es necesaria la normalización de los datos brutos. Como no se detectó clorofila mediante HPLC en diversas condiciones y/o diferentes genotipos en plántulas etioladas, se realizó la normalización (F/F0) a los niveles de fluorescencia T0 (F0) medidos para el tratamiento correspondiente y/o genotipo7. Para demostrar la importancia de la normalización, presentamos tanto los datos brutos como los datos normalizados al valor medio de fluorescencia de clorofila del control medido en T0 (F0; Figura 3A y Figura 3B, respectivamente).
Figura 1: Descripción general del protocolo del dispositivo de medición. El esquema de la tubería de medición y análisis de iReenCAM. (A) Preparación de la muestra mediante siembra de semillas definida en cuadrícula, estratificación, inducción de la germinación por luz y cultivo en placa de Petri orientada verticalmente en la oscuridad. (B) El módulo de control para la adquisición automática y programable de imágenes y la gestión de datos basado en la caja de herramientas PlantScreen phenotyping SW organiza el funcionamiento de todo el sistema controlando y sincronizando el funcionamiento del hardware con el protocolo de medición y análisis definido por el usuario. (C) El protocolo de medición está diseñado para mediciones dinámicas de las imágenes fluorescentes de la muestra en intervalos de 2 minutos durante 4 h en total, es decir, 120 rondas de medición. Para la generación de la máscara de ROI se utiliza el marco visual temporal de la imagen representativa en falso color de plántulas de Arabidopsis de 4 días de edad orientadas verticalmente adquiridas en el tiempo 180 min. (D) Se aplica una máscara que define el ROI para un tejido de interés (por ejemplo, cotiledón, hipocótilo o zona de la raíz) en el marco visual de tiempo, se realiza la sustracción de fondo y se extraen los valores de fluorescencia píxel por píxel para cada ROI (definido por la máscara de la planta) de todas las rondas de medición. Finalmente, los datos brutos (fluorescencia F) se normalizan al valor medio de fluorescencia en T0 (F0). Barras de escala = 1 cm (A) y 0,25 cm (C). La cifra se modificó de7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Colocación de semillas. La figura muestra la colocación de semillas de Arabidopsis en la placa de Petri con bordes herméticos a la luz utilizando la rejilla de aserrado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cinética de acumulación de clorofila en las primeras etapas de la desetiolación de Arabidopsis . Las plántulas etioladas de WT Col-0 se cultivaron en medios suplementados con BAP o DMSO (simulacro). (A) El valor medio ± SD (área sombreada), n = 9 de los datos brutos y (B) los datos normalizados al valor medio de fluorescencia en T0 (F0). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Rejilla de siembra. Izquierda: Rejilla de siembra con casillas rectangulares delineadas para colocar las semillas de cada genotipo en un punto de medición situado en la zona de homogeneidad de la luz actínica (intensidad lumínica ≥ 0,7 de la intensidad lumínica máxima). Derecha: Representación esquemática de plántulas etioladas de Arabidopsis de 4 días de edad cultivadas para el análisis. La rejilla de siembra proporciona un posible esquema para el posicionamiento de las semillas de Arabidopsis asegurando la homogeneidad de la luz y la densidad de semillas adecuada (cada ranura se puede utilizar para la colocación de semillas ya que se unifican el tamaño de una ranura, la distancia entre las ranuras y la homogeneidad de la luz en el área de la rejilla). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Protocolo de medición de fluorescencia. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Configuración experimental que permite evitar la exposición a la luz no deseada. (A) El dispositivo de medición se coloca en el fitotron de entrada, (B) a la cámara separada por una puerta hermética a la luz. (C) Las cajas de cultivo in vitro (punta de flecha roja) dedicadas al crecimiento de las plántulas etioladas en condiciones definidas (temperatura y humedad relativa) se colocan justo debajo del dispositivo (punta de flecha amarilla), asegurando el mínimo riesgo de exposición a la luz. La fuente de luz verde tenue (punta de flecha azul) está montada en la pared junto al PC de control (punta de flecha naranja). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 4: Procedimiento de generación de máscaras en el flujo de trabajo mediante el software de análisis de datos PS. Imprima capturas de pantalla de los pasos individuales que se deben realizar para la generación y análisis de datos (pasos 4.7 y 4.13) de la máscara de bandeja (pasos 4.3-4.6) y la máscara de planta (paso 4.12). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 5: Densidad de siembra que afecta la variabilidad de la medición. Cinética de acumulación de clorofila en plántulas etioladas de Arabidopsis WT Col-0 de 4 días de edad cultivadas (A) por separado (como plántulas individuales, aquí n=5) o en un grupo de (B) alta densidad (HD, n=30-40) o (C) baja densidad (LD, n=10-15). La n corresponde al número de plántulas por ranura de la cuadrícula de siembra, los datos representan los valores medios ± SD (región sombreada). La densidad alta o baja corresponde al número de plántulas por ranura de la cuadrícula de siembra como se mencionó. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 6: El intervalo de cultivo y el espacio requieren una optimización específica para cada especie. Crecimiento de varias especies de plantas utilizando el protocolo optimizado para Arabidopsis. (A) Colocación de semillas en la rejilla de siembra. (B) plántulas etioladas de 4 días de edad (de izquierda a derecha) de Arabidopsis thaliana, Brassica napus y Crambe abyssinica. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Pasos críticos del protocolo y solución de problemas: no hay luz y se cuida la mascarilla
Como se destaca directamente en la descripción del protocolo anterior, es de vital importancia evitar incluso las pequeñas cantidades de luz tanto durante el cultivo de plántulas de plantas etioladas como justo antes de comenzar el protocolo11. En nuestra configuración, utilizamos una cámara oscura dedicada ubicada en el fitotrón de entrada y separada del resto del fitotrón con una puerta giratoria hermética a la luz (Figura complementaria 3). La cámara está equipada con un espacio de cultivo de plantas y un banco de trabajo que permite acomodar el dispositivo junto con la PC de control y la campana extractora. Esto nos permite cultivar las plantas en la oscuridad e iniciar la medición sin necesidad de transportar la placa.
La forma de cultivo de las plantas y la generación de la máscara es fundamental para la posterior cuantificación de la señal de fluorescencia de la clorofila a través del ensayo propuesto. Se debe evitar que queden grumos de agente gelificante o pequeña basura/polvo visual en los medios, ya que podría causar la reflexión de la luz. Como el reconocimiento de la fluorescencia de la clorofila por parte del software está limitado por la máscara, un área de planta que no estará cubierta por la máscara simplemente no será analizada por el software. Durante la medición de 4 h, las plántulas crecen/se mueven un poco, por lo tanto, la máscara designada podría requerir ajustes, ya que es posible que no quepa en todas las rondas de medición para la cuantificación precisa de la intensidad de la señal. Según nuestra experiencia, la definición de máscara imperfecta parece ser la principal fuente de variabilidad. Durante los experimentos de optimización, monitoreamos los cambios en la variabilidad de los valores de fluorescencia de clorofila tomados para el análisis en i) plántulas individuales y un grupo de plántulas con ii) mayor densidad de siembra (30-40 semillas) y iii) menor (10-15 semillas) (Figura suplementaria 5). Se utilizó una mayor densidad de siembra de semilla, ya que presentó la menor variabilidad. La mayor variabilidad observada en el caso de plántulas individuales/siembra de menor densidad se origina principalmente en la mayor proporción de píxeles ubicados en el borde entre la señal y el fondo y el ligero movimiento de las plántulas durante el intervalo de medición de 4 h.
Para asegurarse de que todas las mediciones sean precisas, verifique si la máscara de la planta se ajusta a la primera ronda, luego a la15ª, 30ª, 45ª,60ª,75ª y así sucesivamente hasta la última (eligiendo el número de la ronda y haciendo clic en Actualizar vista previa). Esto tomará solo un par de minutos, pero asegurará que toda el área del cotiledón esté siendo cubierta y evaluada. Si en alguna ronda la máscara de la planta no encaja (el área requerida no está completamente cubierta), divida el experimento en varias partes. A continuación, realice el protocolo a partir del paso 4 (4.1-4.13) para crear una máscara específica por separado para cada parte del experimento. Por ejemplo, si notas el desplazamiento de la máscara de la planta en la ronda 60-61 (o un poco antes), divide el experimento en dos partes:1ª parte (1-60 rondas) y2ª parte (61-121 rondas). Para la1ª parte utiliza la imagen de la vuelta 41 para generar una máscara vegetal y para la2ª parte utiliza la vuelta 91. En el paso 4.13, al analizar los datos, tenga cuidado de elegir las rondas de acuerdo con la parte correspondiente del experimento (por ejemplo, rondas 1-60 para la primera parte y 61-121 para la segunda, como en el ejemplo anterior) antes de hacer clic en Analizar. Cuando se trabaja con Arabidopsis, el movimiento de las plantas es insignificante, ya que crecen bastante lentamente, pero si se aplica el protocolo para diferentes especies (ver más abajo), se debe tener en cuenta el ritmo de crecimiento.
Modificaciones y limitaciones
El número de parámetros se puede modificar, incluida la intensidad y la longitud de onda de la luz actínica y/o la luz que se aplica entre los intervalos de aplicación de luz actínica. El dispositivo de medición incluye la rueda de filtros integrada, totalmente motorizada y controlada por software. Por lo tanto, el algoritmo de medición adecuado para la cuantificación de otros pigmentos, típicamente también productos de la vía biosintética del tetrapirollo10,12, podría incluirse en el protocolo en caso de agregar los filtros apropiados.
Además, como se mencionó anteriormente, el protocolo se puede utilizar no solo para las plantas de Arabidopsis . Sin embargo, cuando se trabaja con otras especies de plantas, cada paso del protocolo debe revisarse en consecuencia, teniendo en cuenta las características específicas de la especie, incluida la tasa de germinación y crecimiento y/o el tamaño (Figura suplementaria 6).
Una de las limitaciones importantes del protocolo es el lapso de tiempo durante el cual se puede realizar el análisis de cuantificación de clorofila. Después de que la clorofila se integra en los complejos del fotosistema, la señal de fluorescencia se ve sesgada por el consumo de energía de la fotosíntesis (lo que se denomina la fluorescencia variable de la clorofila está presente) como se ha observado durante las etapas posteriores de la desetiolación13. De acuerdo con el ensayo14,15 de transitorios OJIP, no se detectaron signos de actividad fotosintética utilizando esta configuración experimental durante las primeras 4 h de desetiolación7. Sin embargo, si se supone o es necesario analizar el período de tiempo prolongado de la fotomorfogénesis, se debe probar el nivel de ensamblaje de los fotosistemas y el posible efecto de la fotosíntesis en los niveles generales de fluorescencia.
Por último, cabe mencionar que nuestro protocolo basado en las medidas de fluorescencia, permite la cuantificación de clorofila relativa, no absoluta. Si se necesita una cuantificación absoluta, se debe realizar la calibración correspondiente utilizando un enfoque alternativo, por ejemplo, HPLC.
Importancia con respecto a los métodos existentes: cuantificación de clorofila simple, rápida y estadísticamente robusta con alta resolución temporal y espacial
El procedimiento descrito aquí permite la detección y cuantificación en tiempo real de clorofila en plántulas vivas de Arabidopsis durante las primeras etapas de desetiolación. En comparación con otros enfoques que se basan principalmente en la extracción de clorofila de material vegetal desprendido16,17 o métodos ópticos desarrollados recientemente18,19, este enfoque es puramente no invasivo, lo que permite la cuantificación de la clorofila mediante la medición in vivo de la intensidad de la fluorescencia. Además, no hay necesidad de reactivos adicionales necesarios para la preparación de muestras como ocurre con otros métodos alternativos existentes, incluidos los enfoques basados en HPLC o espectrofotometría antes mencionados. El protocolo recién introducido es simple, rápido y preciso, como se verificó previamente con HPLC5. Utilizando la configuración del protocolo estándar, la curva final de una sola repetición biológica se compone de 120 puntos de medición (medias de intensidad de fluorescencia) tomados durante 4 h de la medición, cada uno de los cuales consta de hasta 15 puntos de medición. Por lo general, la curva final incluye los datos de tres réplicas biológicas (por ejemplo, tres placas preparadas de forma independiente) y tres puntos de medición (tres réplicas técnicas), cada una de las cuales consta de 30-40 plántulas. Por lo tanto, hay alrededor de 300 plántulas ensayadas en cada intervalo de tiempo, lo que proporciona un conjunto de datos estadísticamente robusto, lo que permite detectar de manera confiable incluso pequeñas diferencias, como se demostró en los mutantes afectados en varios pasos de la biosíntesis de clorofila7. Aquí animamos al usuario a emplear el enfoque estadístico recientemente desarrollado basado en modelos mixtos lineales generalizados combinados con modelos clásicos de series temporales como una herramienta adecuada para el análisis de datos cinéticos de clorofila20.
Futuras aplicaciones de la técnica: cribado rápido y barato
Las características antes mencionadas hacen de este enfoque una herramienta útil adecuada para el cribado rápido y barato y la cuantificación altamente precisa de rasgos asociados (directa o indirectamente) con la biosíntesis de clorofila. Esto podría incluir estudios que empleen el cribado genético directo para caracterizar mejor las regulaciones complejas y multinivel de la biosíntesis de clorofila 10,12,21. Teniendo en cuenta la posibilidad de diversos tratamientos con compuestos, el protocolo también es muy valioso para estudiar, por ejemplo, la importancia de las regulaciones hormonales mediadas por la luz22,23 o el cribado de compuestos de bajo peso molecular con posible impacto en la cinética de acumulación de clorofila.
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Disclosures
Z.B. y K.P. son empleados de la ISP y Martin Trtilek es director ejecutivo y propietario de la empresa de la ISP que produce el iReenCAM. Todos estos autores participaron en el desarrollo del instrumento descrito anteriormente7.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional-Proyecto SINGING PLANT (No. CZ.02.1.01/0,0/0,0/16_026/0008446). Este proyecto ha recibido financiación a través del proyecto MSCA4Ukraine (ID 1233580), financiado por la Unión Europea. Agradecemos a Lenka Sochurkova por el diseño gráfico de la Figura 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
| Cultivation chamber | PSI | custom made | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
| Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
| Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
| Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
| Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |
References
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