Summary
Dit protocol is ontwikkeld om de mechanische eigenschappen van neuraal plaatweefsel tijdens de neurulatie van kuikenembryo's longitudinaal te monitoren. Het is gebaseerd op de integratie van een Brillouin-microscoop en een incubatiesysteem op het podium, waardoor live mechanische beeldvorming van neuraal plaatweefsel in ex ovo gekweekte kuikenembryo's mogelijk wordt.
Abstract
Het sluiten van de neurale buis (NTC) is een cruciaal proces tijdens de embryonale ontwikkeling. Falen in dit proces kan leiden tot neurale buisdefecten, wat aangeboren misvormingen of zelfs sterfte veroorzaakt. NTC omvat een reeks mechanismen op genetisch, moleculair en mechanisch niveau. Hoewel mechanische regulering de laatste jaren een steeds aantrekkelijker onderwerp is geworden, blijft het grotendeels onontgonnen vanwege het gebrek aan geschikte technologie voor het uitvoeren van mechanische tests van 3D-embryonaal weefsel in situ. Als reactie hierop hebben we een protocol ontwikkeld om de mechanische eigenschappen van kippenembryonaal weefsel op een contactloze en niet-invasieve manier te kwantificeren. Dit wordt bereikt door een confocale Brillouin-microscoop te integreren met een incubatiesysteem op het podium. Om de weefselmechanica te onderzoeken, wordt een voorgekweekt embryo verzameld en overgebracht naar een incubator op het podium voor ex ovo-cultuur . Tegelijkertijd worden de mechanische beelden van het neurale plaatweefsel op verschillende tijdstippen tijdens de ontwikkeling door de Brillouin-microscoop verkregen. Dit protocol bevat gedetailleerde beschrijvingen van de monstervoorbereiding, de implementatie van Brillouin-microscopie-experimenten en de nabewerking en analyse van gegevens. Door dit protocol te volgen, kunnen onderzoekers de mechanische evolutie van embryonaal weefsel tijdens de ontwikkeling longitudinaal bestuderen.
Introduction
Neurale buisdefecten (NTD's) zijn ernstige geboorteafwijkingen van het centrale zenuwstelsel die worden veroorzaakt door storingen in de neurale buissluiting (NTC) tijdens de embryonale ontwikkeling1. De etiologie van NTD's is complex. Studies hebben aangetoond dat NTC een opeenvolging van morfogenetische processen omvat, waaronder convergente extensie, buiging van de neurale plaat (bijv. apicale vernauwing), het verhogen van de neurale plooi en ten slotte adhesie van de neurale vouw. Deze processen worden gereguleerd door meerdere moleculaire en genetische mechanismen 2,3, en elke storing in deze processen kan leiden tot NTD's 4,5,6. Aangezien er steeds meer bewijs is dat mechanische signalen ook een cruciale rol spelen tijdens NTC 3,7,8,9,10,11, en er relaties zijn gevonden tussen genen en mechanische signalen 12,13,14, wordt het noodzakelijk om de weefselbiomechanica tijdens neurulatie te onderzoeken.
Er zijn verschillende technieken ontwikkeld voor het meten van de mechanische eigenschappen van embryonale weefsels, waaronder laserablatie (LA)15, weefseldissectie en -ontspanning (TDR)16,17, micropipetaspiratie (MA)18, nanoindentatie op basis van atoomkrachtmicroscopie (AFM)19, microindenters (MI) en microplaten (MP)20, microreologie (MR) met optisch/magnetisch pincet21,22,23, en druppelsensoren24. Bestaande methoden kunnen mechanische eigenschappen meten bij ruimtelijke resoluties, variërend van subcellulaire tot weefselschalen. De meeste van deze methoden zijn echter invasief omdat ze contact met het monster vereisen (bijv. MA, AFM, MI en MP), externe materiaalinjectie (bijv. MR en druppelgebaseerde sensoren) of weefseldissectie (bijv. LA en TDR). Als gevolg hiervan is het voor bestaande methoden een uitdaging om de mechanische evolutie van neuraal plaatweefsel in situte volgen 25. Onlangs is galmende optische coherentie-elastografie veelbelovend gebleken voor contactloze mechanische mapping met een hoge ruimtelijke resolutie26.
Confocale Brillouin-microscopie is een opkomende optische modaliteit die contactloze kwantificering van weefselbiomechanica mogelijk maakt met een subcellulaire resolutievan 27,28,29,30. Brillouin-microscopie is gebaseerd op het principe van spontane Brillouin-lichtverstrooiing, de interactie tussen het invallende laserlicht en de akoestische golf die wordt veroorzaakt door thermische fluctuaties in het materiaal. Bijgevolg ondergaat het verstrooide licht een frequentieverschuiving, bekend als de Brillouin-verschuiving ωR, volgens de vergelijking31:
(1)
Hier is de brekingsindex van het materiaal, 
λ is de golflengte van het invallende licht, M' is de longitudinale modulus, ρ is de massadichtheid en θ is de hoek tussen het invallende licht en het verstrooide licht. Voor hetzelfde type biologische materialen is de verhouding tussen brekingsindex en dichtheid 
ongeveer constant 28,32,33,34,35,36. De Brillouin-verschuiving kan dus direct worden gebruikt om relatieve mechanische veranderingen in fysiologische processen te schatten. De haalbaarheid van Brillouin-microscopie is gevalideerd in verschillende biologische monsters 29,37,38. Onlangs werd time-lapse mechanische beeldvorming van een levend kuikenembryo gedemonstreerd door een Brillouin-microscoop te combineren met een incubatiesysteem op het podium39. Dit protocol bevat gedetailleerde beschrijvingen van de voorbereiding van het monster, de uitvoering van het experiment en de nabewerking en analyse van gegevens. We hopen dat deze inspanning de wijdverbreide acceptatie van contactloze Brillouin-technologie zal vergemakkelijken voor het bestuderen van biomechanische regulatie in de ontwikkeling van embryo's en geboorteafwijkingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Wayne State University.
1. Experimentele voorbereiding
- Gebruik een 70% ethanoloplossing om de schaar en het pincet schoon te maken en te steriliseren. Maak ook wegwerppipetten en een spuit klaar.
- Bereid een wasmedium voor door 3.595 g NaCl toe te voegen aan 495 ml gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens 5 ml penicilline-streptomycine (5 E/ml) toe aan het medium. Vul een petrischaal van 100 mm met het wasmedium en verwarm deze tot 37 °C.
- Bereid kweekschalen volgens afbeelding 1, die de algehele configuratie illustreert.
- Leg een stuk filtreerpapier klaar, knip het in een rechthoekige vorm van ongeveer 17 mm × 20 mm en verwijder de vier hoeken. Maak een holle kern in het filtreerpapier van ongeveer 7 mm × 10 mm groot om het embryo vast te zetten (figuur 1, links).
OPMERKING: Het verzamelen van embryo's wordt beschreven in stap 2. - Bevestig een in de handel verkrijgbare ring (Φ = 1 inch, zie Tabel met materialen) met een flexibele filmlaag (d.w.z. paraffinefilm) en zorg ervoor dat de flexibele film ook een hol midden heeft. Deze ring met de film wordt gebruikt om het filtreerpapier met het embryo vast te houden.
- Plaats ten slotte de voorbereide ring in een petrischaal van 35 mm (Figuur 1, rechts).
NOTITIE: Het filterpapier is bedoeld om het geëxtraheerde embryo vast te zetten en vast te houden door het filterpapier op het membraan te plaatsen en het embryo in het midden van het holle gebied te laten (wat in stap 2 wordt beschreven). De vier hoeken zijn op maat van de buitenring gesneden (niet nodig als deze al is gemonteerd). Een kweekschaal van 35 mm met glazen bodem wordt gebruikt voor een betere voortplanting van de laserstraal. De schaal heeft een binnenste put (Φ = 23 mm), die kan worden gevuld met eiwit voor ex ovo-cultuur . De diameter van de ring moet groter zijn dan de diameter van het binnenste putje, zodat het putje kan worden afgedekt door de flexibele folie op de ring (figuur 1, inzet). De grootte van het filtreerpapier is niet beperkt en kan worden aangepast aan de grootte van de gekozen ring en de kweekschaal. Als alternatief kan de bodem van de schaal worden voorbedekt met een agaroselaag (dikte: ~1 mm). Door agarose met een mes uit het midden van de laag te verwijderen, kan een putje met een vergelijkbare vorm als het holle midden van de flexibele film worden gemaakt voor het laden van albumine. Een kritiek punt is dat de vier zijden van het holle filtreerpapier voldoende breedte (> 5 mm) moeten hebben om de aanhechting van het embryo te garanderen.
- Leg een stuk filtreerpapier klaar, knip het in een rechthoekige vorm van ongeveer 17 mm × 20 mm en verwijder de vier hoeken. Maak een holle kern in het filtreerpapier van ongeveer 7 mm × 10 mm groot om het embryo vast te zetten (figuur 1, links).
2. Extractie en ex ovo kweek van het kippenembryo
OPMERKING: Deze stap is gewijzigd ten opzichte van eerder gepubliceerde rapporten40,41.
- Haal na de voorkweek het ei uit de broedmachine en plaats het op zijn lange as op de eierdoos. Reinig de eierschaal met 70% ethanol, zorg ervoor dat het hele oppervlak bedekt is en laat hem vervolgens 15 minuten rusten.
- Houd het ei op zijn korte as en breek het aan de onderkant. Open het ei boven een schone petrischaal van 100 mm om de inhoud eruit te halen, zoals geïllustreerd in figuur 2. Zorg ervoor dat u het ei niet draait terwijl u het vasthoudt en breekt.
- Breng met behulp van een pipet ongeveer 10 ml van het dunne eiwit (d.w.z. het vloeibare eiwit42) over en verzamel het in een buisje van 15 ml voor gebruik in ex ovo-cultuur . Vul het middelste putje van de kweekschaal met het verzamelde dunne eiwit (ongeveer 0,9 ml), zoals weergegeven in figuur 3. Het vulproces moet langzaam zijn en de vorming van luchtbellen in de put voorkomen. Zorg ervoor dat de kweekschaal met eiwit is opgewarmd tot 37 °C.
OPMERKING: Deze schaal wordt gebruikt voor het kweken van het embryo ex ovo. Tijdens de beeldvorming van Brillouin (zie stap 3) zullen nieuwe kweekschaaltjes gevuld met wasmedium worden gebruikt. - Verwijder met tissuepapier voorzichtig het dikke eiwit (d.w.z. stroperig albumine) dat aan het embryo is bevestigd door het eiwit voorzichtig te scheiden van het vitellinemembraan, zoals weergegeven in figuur 4. Vermijd direct contact met het vitelline-membraan.
- Nadat u al het dikke eiwit hebt verwijderd, bevestigt u het filtreerpapier voorzichtig op het vitelline-membraan. Zorg ervoor dat de lichaamsas van het embryo is uitgelijnd met de lange as van de middelste rechthoek op het filterpapier. Gebruik een schaar om het membraan rond het filtreerpapier door te knippen.
- Trek het geïsoleerde filtreerpapier met een pincet voorzichtig schuin weg van de dooier. Draai het filtreerpapier ondersteboven om het embryo met de dorsale kant naar beneden te positioneren (voor omgekeerde microscoopconfiguratie). Dompel het hele filtreerpapier vanaf één kant van de lange as voorzichtig schuin in de petrischaal van 100 mm met het wasmedium.
- Spoel de resterende dooier weg door het wasmedium voorzichtig parallel aan het filtreerpapier te spuiten met een schone pipet. Spuit het wasmedium niet rechtstreeks op het membraan.
- Nadat u alle dooier hebt verwijderd, verwijdert u voorzichtig het filterpapier van het wasmedium en gebruikt u tissuepapier om overtollig medium van de randen te absorberen. Plaats vervolgens het filtreerpapier met het embryo op de kweekschaal en zorg ervoor dat de dorsale zijde van het embryo naar beneden wijst, zoals geïllustreerd in figuur 5. Om de luchtvochtigheid op peil te houden, legt u een vochtig papieren zakdoekje in de schaal.
- Breng de kweekschaal over naar de incubator op het podium voor ex ovo-cultuur .
3. Brillouin-meting van het embryo
- Bereid nog een set kweekschalen voor en vul ze met wasmedium. Zorg ervoor dat het wasmedium is opgewarmd tot 37 °C.
- Wanneer het embryo het gewenste ontwikkelingsstadium heeft bereikt, brengt u het filtreerpapier met het embryo over in de kweekschaal gevuld met wasmedium. Plaats het kweekschaaltje in de incubator op het podium van de Brillouin-microscoop (zie Materiaaltabel).
- Voordat u de Brillouin-meting uitvoert, moet u ter referentie een helderveldopname van het hele embryo opslaan. De gedetailleerde configuratie van de Brillouin-microscoop is eerder beschreven30 en is samengevat in de sectie Resultaten (Figuur 6).
- Meet het Brillouin-signaal van water en methanol, dat in stap 4 zal worden gebruikt voor het kalibratieproces.
- Pas het invallende laservermogen en de belichtingstijd van het elektronenvermenigvuldigende charge-coupled device (EMCCD, zie Materiaaltabel) camera aan om ten minste 10.000 tellingen van het Brillouin-signaal te bereiken. Gebruik de helderveldafbeelding als richtlijn om het scanbereik en de stapgrootte in te stellen. Verkrijg een Brillouin-beeld van het interessegebied door het embryo te scannen met behulp van een 2D-translationele fase.
OPMERKING: Het horizontale scanbereik kan worden bepaald op basis van het helderveldbeeld en het verticale (d.w.z. diepte) scanbereik kan worden bepaald op basis van de signaalsterkte die wordt verkregen uit een snelle en grove scan. Om fotoschade aan het embryo te voorkomen, beperk je het invallende vermogen tot 25 mW en stel je de belichtingstijd van de EMCCD-camera in op 50 ms. Kies een stapgrootte van 2 μm in horizontale richting en 1 μm in verticale richting om de beeldkwaliteit en acquisitietijd in evenwicht te brengen. - Verwijder na het voltooien van de scan voorzichtig het filterpapier met het embryo en gebruik tissuepapier om overtollig wasmedium te absorberen. Plaats vervolgens het filtreerpapier terug in de kweekschaal gevuld met dun eiwit voor continue kweek in de incubator op het podium.
- Herhaal stap 3.2-3.5 met regelmatige tussenpozen (bijv. 1.5 uur) om time-lapse Brillouin-beelden vast te leggen terwijl het embryo zich ontwikkelt.
- Reconstrueer het 2D Brillouin-beeld volgens stap 4.
4. Reconstructie van het Brillouin-beeld
- Kalibreer de Brillouin-spectrometer met behulp van Brillouin-signalen van water en methanol om het vrije spectrale bereik (FSR) en de pixel-naar-frequentie-conversieverhouding (PR) van de spectrometer30 te berekenen. De gekalibreerde waarden van FSR en PR zullen worden gebruikt om de Brillouin-verschuiving van het embryo bij elke pixel te berekenen.
OPMERKING: Afbeelding 7A toont een onbewerkt Brillouin-spectrum dat is vastgelegd door de EMCCD-camera. Door het spectrum verticaal op te tellen en vervolgens een Lorentziaanse fitting uit te voeren, kan de piekafstand Δd van de twee stippen worden verkregen (Figuur 7B). Door de piekafstand van water Δdwater en methanol Δdmethanol te krijgen, kunnen de FSR en PR worden berekend op basis van de vergelijkingen30: PR = 2· (ωmethanol-ω water)/(Δdwater- Δdmethanol), en FSR = 2·ωwater + PR·Δdwater, met de bekende Brillouin-verschuiving van water ωwater = 6,01 GHz en methanol ωmethanol = 4,49 GHz bij 660 nm. - Verkrijg de piekafstand van het Brillouin-signaal op elke pixel van het monster. Bereken de Brillouin-verschuiving op basis van de gekalibreerde FSR en PR:ω-monster = 0,5 (FSR - PR xΔd-monster)30, waarbijω-monster de Brillouin-verschuiving van het monster is en Δd-monster de piekafstand van het Brillouin-signaal.
- Reconstrueer het 2D Brillouin-beeld op basis van de Brillouin-verschuivingen van alle pixels.
OPMERKING: Om lokale analyse uit te voeren, kan men een interessegebied (bijv. de neurale plaat) selecteren uit het verkregen Brillouin-beeld en de mechanische eigenschappen ervan kwantificeren. Een veelgebruikte aanpak is het berekenen van de gemiddelde Brillouin-verschuiving van de geselecteerde regio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 6 toont het schema van de Brillouin microscoop. Het systeem maakt gebruik van een 660 nm laser als lichtbron. Direct na de laserkop wordt een isolator geplaatst om teruggekaatst licht af te weren, en een ND-filter (Neutral Density) wordt gebruikt om het laservermogen aan te passen. Een paar lenzen, L1 en L2, met brandpuntsafstanden van respectievelijk f1 = 16 mm en f2 = 100 mm, worden gebruikt om de laserstraal uit te breiden. Een halfgolfplaat (HWP) en een lineaire polarisator (polarisator 1) worden gebruikt om het vermogen van de straal die op het monster of de kalibratiematerialen (dwz water en methanol) schijnt, aan te passen na de gepolariseerde bundelsplitser (PBS). Om de laser in het monster te richten en achterwaarts verstrooid licht te verzamelen, wordt een objectieflens (OBJ2) met een numerieke apertuur (NA) van 0,6 en een vergroting van 40 gebruikt. Het invallende licht en het achterwaarts verstrooide licht worden gescheiden door dezelfde PBS na polarisatie-aanpassing met behulp van een kwartgolfplaat (QWP2). Evenzo worden OBJ1 en QWP1 gebruikt om de laserstraal naar de kalibratiematerialen te leiden. Het Brillouin-signaal wordt door een single-mode vezel geleverd aan een Brillouin-spectrometer43 voor analyse. In de spectrometer koppelt een cilindrische lens (C1) het Brillouin-signaal aan de eerste VIPA (virtually imaged phased array) etalon. De output van de eerste VIPA-etalon wordt hervormd door een andere cilindrische lens (C2) en gericht op masker 1 om niet-verstrooid laserlicht te verwerpen. Vervolgens wordt het Brillouin-signaal gekoppeld aan een tweede VIPA-etalon door een sferische lens (SL1), hervormd door een andere sferische lens (SL2) en geprojecteerd op masker 2. Het resulterende spectrale patroon gaat vervolgens door een 4-f-eenheid voor ruisonderdrukking en wordt geprojecteerd op een EMCCD voor opname. We gebruikten een in de handel verkrijgbare microscoopbehuizing (zie Tabel met materialen). Over het algemeen kan elke microscoopbehuizing van verschillende merken worden gebruikt, zolang er maar een poort beschikbaar is voor het leveren van de externe lichtstraal. De incubator op het podium is een metalen kamer met temperatuur-, gas- en luchtstroomregeling. De positie van het monster wordt aangepast via de 2D gemotoriseerde tafel. Een complementaire metaaloxidehalfgeleidercamera (CMOS) wordt gebruikt om het helderveldbeeld te verkrijgen.
Figuur 8 toont de time-lapse bright-field en Brillouin beelden van een representatief kippenembryo. Het embryo werd geëxtraheerd na 29 uur in ovo-cultuur en de beelden werden genomen om 29 uur, 30,5 uur en 32 uur met ex ovo-cultuur, wat overeenkomt met somietgetallen van 4, 5 en 8, respectievelijk44. Over het algemeen kan het embryo minimaal 24 uur in de couveuse op het podium worden gekweekt. De rode lijn in het helderveldbeeld geeft de locatie aan voor Brillouin-beeldvorming. Met de verkregen Brillouin-beelden werd het neurale plaatgebied geselecteerd (gemarkeerd door de zwarte stippellijn in figuur 8) en werd de gemiddelde Brillouin-verschuiving van dit gebied berekend. Zoals te zien is in figuur 9, neemt de gemiddelde Brillouin-verschuiving van het weefsel toe tijdens het sluiten van de neurale buis. De longitudinale modulus wordt ook berekend op basis van vergelijking (1), waarbij de waarde van = 1,3330 wordt geschat uit de literatuur met behulp van zebravisembryo's45, ervan uitgaande dat de waarde relatief constant is voor vergelijkbare soorten biologische weefsels28,33.
Figuur 1: Schema van de hele configuratie van de kweekschaal voor de embryonale ontwikkeling. Deze afbeelding toont links een filtreerpapier voor het bevestigen van het embryo en rechts een kweekschaaltje van 35 mm met een ring met een flexibele filmlaag. Het doorsnedeschema wordt ook verstrekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het proces van het openen van de eierschaal boven een schone petrischaal van 100 mm om het ei in de schaal te extraheren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Het midden van de kweekschaal vullen met dun eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Sleep het dikke eiwit weg in de richting van de rode pijl, met behulp van een stuk vloeipapier. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Het plaatsen van het filtreerpapier in de kweekschaal met het embryo aan de bovenkant van het filtreerpapier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Schema van de Brillouin microscoop. De rode pijl geeft het lichtpad van de laserstraal aan en de oranje pijl geeft het lichtpad van het Brillouin-signaal aan. L1, L2, SL1-SL4: sferische lens; SF: ruimtelijk filter; C1, C2: cilindrische lens, HWP: halfgolfplaat; PBS: gepolariseerde bundelsplitser; QWP1, QWP2: kwartgolfplaat; OBJ1, OBJ2: Objectief; LP: lenspaar. VIPA: virtueel in beeld gebrachte phased array. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Representatief Brillouin-signaal. (A) Een representatief Brillouin-spectrum dat door het EWCD is vastgelegd. (B) Een verticaal opgeteld Brillouin-spectrum en bijbehorend Lorentzisch passend resultaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Helderveldbeelden en de bijbehorende Brillouin-dwarsdoorsnedebeelden van het embryo na 29 uur, 30,5 uur en 32 uur met 4, 5 en 8 somieten. Rode ononderbroken lijnen geven de locatie aan voor Brillouin-beeldvorming en de zwarte stippellijn geeft het neurale plaatgebied aan. Het grijze gebied in het beeld van 32 uur (8 somieten) is een artefact van curve-aanpassing vanwege het zwakke Brillouin-signaal en wordt uitgesloten bij het berekenen van de gemiddelde verschuiving. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Brillouinverschuiving en de geschatte longitudinale modulus van de neurale plaat ten opzichte van het somietgetal en de incubatietijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vroege ontwikkeling van het embryo kan gemakkelijk worden beïnvloed door externe verstoringen. Daarom is uiterste voorzichtigheid geboden tijdens de monsterextractie en -overdracht. Een mogelijk probleem is het loskomen van het embryo van het filterpapier, wat kan leiden tot het krimpen van het vitelline-membraan en kan resulteren in een gekanteld artefact van de neurale plaat in Brillouin-beeldvorming. Bovendien kan dit krimpen de ontwikkeling van het embryo stoppen. Er moet aandacht worden besteed aan verschillende kritieke stappen om loslating te voorkomen. Ten eerste is het in stap 2.4 van cruciaal belang om te zorgen voor een grondige verwijdering van albumine van het membraanoppervlak. Eventueel achtergebleven eiwit kan de goede hechting van het membraan aan het filtreerpapierbelemmeren 46,47. Bovendien is het tijdens het wasproces belangrijk om het wasmedium in een richting evenwijdig aan het membraan te spuiten. Als u het membraan rechtstreeks met de vloeistofstroom raakt, kan het membraan losraken of zelfs scheuren. Bovendien moet het hele wasproces binnen korte tijd (bijv. <3 min) worden voltooid, omdat langdurige onderdompeling ook kan leiden tot het loslaten van het embryo van het filterpapier.
Voordat Brillouin-metingen worden uitgevoerd, is het noodzakelijk om het embryo over te brengen naar een schaal met wasmedium. Dit komt omdat de Brillouin-verschuiving van het eiwit zich zeer dicht bij de neurale plaatweefsels bevindt, waardoor een slecht beeldcontrast ontstaat. Brillouin-beeldvorming wordt verkregen door puntscanning, wat tijdrovend kan zijn, vooral als het om veel punten gaat. In dit protocol is het scangebied ongeveer 400 μm horizontaal en minder dan 100 μm verticaal. Om verstoring van de ontwikkeling van het embryo te voorkomen, werd de totale verwervingstijd beperkt tot binnen 30 minuten. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een stapgrootte van 2 μm horizontaal en 1 μm verticaal. In het geval dat men alleen geïnteresseerd is in de gemiddelde Brillouin-verschuiving van een specifiek gebied, kan een snelle en grove scan (bijv. met een stapgrootte van 4 μm zowel horizontaal als verticaal) worden uitgevoerd, die minder dan 5 minuten duurt en de negatieve impact op de embryonale ontwikkeling kan verminderen.
Brillouin-microscopie biedt een real-time en niet-invasieve beeldvormingsbenadering voor het onderzoeken van de biomechanica van de ontwikkeling van embryo's. Een beperking van deze methode ligt in de penetratiediepte, die ongeveer 100-200 μm bedraagt, afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van het embryo. Hoewel het verhogen van het laservermogen en/of de belichtingstijd van het EMCCD dit probleem gedeeltelijk kan verhelpen, gaat dit ten koste van mogelijke fototoxiciteit en/of een lange acquisitietijd. Als alternatief kunnen bestaande optische technologieën, zoals adaptieve optica, mogelijk worden gebruikt om de penetratiediepte te verbeteren48.
Tot slot hebben we een protocol opgesteld voor het onderzoeken van de mechanische eigenschappen van levende kippenembryo's met behulp van Brillouin-microscopie. Deze contactloze methode kan voldoen aan de huidige onvervulde behoeften en is een aanvulling op andere bestaande hulpmiddelen voor het bestuderen van biomechanica in embryonale ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (K25HD097288, R21HD112663).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Fisherbrand | FB0875713 | |
| 2D motorized stage | Prior Scientific | H117E2 | |
| 35 mm Petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Brillouin Microscope with on-stage incubator | N/A | N/A | This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30 |
| Chicken eggs | University of Connecticut | N/A | |
| CMOS camera | Thorlabs | CS2100M-USB | |
| EMCCD camera | Andor | iXon | |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | #2701 | |
| Filter paper | Whatman | 1004-070 | |
| Incubator for in ovo culture | GQF Manufacturing Company Inc. | GQF 1502 | |
| Ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Microscope body | Olympus | IX73 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| On-stage incubator | Oko labs | OKO-H301-PRIOR-H117 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-711-6M | |
| Scissors | Artman instruments | N/A | 3pc Micro Scissors 5 |
| Syringe | BD | 305482 | |
| Tissue paper | Kimwipes | N/A | |
| Tube | Corning | 430052 | |
| Tweezers | DR Instruments | N/A | Microdissection Forceps Set |
References
- Greene, N. D. E., Copp, A. J.
- Suzuki, M., Morita, H., Ueno, N. Molecular mechanisms of cell shape changes that contribute to vertebrate neural tube closure. Development, Growth & Differentiation. 54 (3), 266-276 (2012).
- Nikolopoulou, E., Galea, G. L., Rolo, A., Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube closure: Cellular, molecular and biomechanical mechanisms. Development. 144 (4), 552-566 (2017).
- Juriloff, D. M., Harris, M. J. Mouse models for neural tube closure defects. Human Molecular Genetics. 9 (6), 993-1000 (2000).
- Copp, A. J., Greene, N. D. E. Genetics and development of neural tube defects. The Journal of Pathology: A Journal of the Pathological Society of Great Britain and Ireland. 220 (2), 217-230 (2010).
- Wang, M., De Marco, P., Capra, V., Kibar, Z. Update on the role of the non-canonical wnt/planar cell polarity pathway in neural tube defects. Cells. 8 (10), 1198 (2019).
- Galea, G. L., et al. Biomechanical coupling facilitates spinal neural tube closure in mouse embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (26), E5177-E5186 (2017).
- Moon, L. D., Xiong, F.
- Christodoulou, N., Skourides, P. A. Distinct spatiotemporal contribution of morphogenetic events and mechanical tissue coupling during xenopus neural tube closure. Development. 149 (13), (2022).
- De Goederen, V., Vetter, R., Mcdole, K., Iber, D. Hinge point emergence in mammalian spinal neurulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2117075119 (2022).
- Christodoulou, N., Skourides, P. A. Somitic mesoderm morphogenesis is necessary for neural tube closure during xenopus development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1091629 (2023).
- Nikolopoulou, E., et al. Spinal neural tube closure depends on regulation of surface ectoderm identity and biomechanics by grhl2. Nature Communications. 10 (1), 2487 (2019).
- Nychyk, O., et al. Vangl2-environment interaction causes severe neural tube defects, without abnormal neuroepithelial convergent extension. Disease Models & Mechanisms. 15 (1), 049194 (2022).
- Li, B., Brusman, L., Dahlka, J., Niswander, L. A. Tmem132a ensures mouse caudal neural tube closure and regulates integrin-based mesodermal migration. Development. 149 (17), (2022).
- Zulueta-Coarasa, T., Fernandez-Gonzalez, R. Laser ablation to investigate cell and tissue mechanics in vivo. Integrative Mechanobiology: Micro-and Nano Techniques in Cell Mechanobiology. , Cambridge University Press. 128-147 (2015).
- Wiebe, C., Brodland, G. W. Tensile properties of embryonic epithelia measured using a novel instrument. Journal of Biomechanics. 38 (10), 2087-2094 (2005).
- Luu, O., David, R., Ninomiya, H., Winklbauer, R. Large-scale mechanical properties of xenopus embryonic epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), 4000-4005 (2011).
- Maître, J. L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nature Cell Biology. 10 (4), 429-436 (2008).
- Zamir, E. A., Srinivasan, V., Perucchio, R., Taber, L. A. Mechanical asymmetry in the embryonic chick heart during looping. Annals of Biomedical Engineering. 31, 1327-1336 (2003).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1416-1421 (2015).
- Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476 (7358), 57-62 (2011).
- Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nature Cell Biology. 17 (4), 470-479 (2015).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
- Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 55, 119-130 (2016).
- Christian, Z. D., et al. High-resolution 3D biomechanical mapping of embryos with reverberant optical coherence elastography (Rev-OCE). Proceedings of SPIE. , 123670 (2023).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. J. N. P. Confocal brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nature Photonics. 1 (1), 39-43 (2008).
- Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by brillouin microscopy. Nature Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
- Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: An emerging tool for mechanobiology. Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
- Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on brillouin module to confocal microscopes. Nature Protocols. 16 (2), 1251-1275 (2021).
- Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic press. (2020).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by brillouin optical microscopy. Biophysical Journal. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. H. Brillouin optical microscopy for corneal biomechanics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 185-190 (2012).
- Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive brillouin microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 37217 (2016).
- Zhang, J., et al. Tissue biomechanics during cranial neural tube closure measured by brillouin microscopy and optical coherence tomography. Birth Defects Research. 111 (14), 991-998 (2019).
- Zhang, J., et al. Nuclear mechanics within intact cells is regulated by cytoskeletal network and internal nanostructures. Small. 16 (18), 1907688 (2020).
- Elsayad, K., Polakova, S., Gregan, J. Probing mechanical properties in biology using brillouin microscopy. Trends in Cell Biology. 29 (8), 608-611 (2019).
- Poon, C., Chou, J., Cortie, M., Kabakova, I. Brillouin imaging for studies of micromechanics in biology and biomedicine: From current state-of-the-art to future clinical translation. Journal of Physics: Photonics. 3 (1), 012002 (2020).
- Handler, C., Scarcelli, G., Zhang, J. Time-lapse mechanical imaging of neural tube closure in live embryo using brillouin microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 263 (2023).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 220 (3), 284-289 (2001).
- Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e54636 (2016).
- Nys, Y., Guyot, N. Improving the safety and quality of eggs and egg products, vol 1: Egg chemistry, production and consumption. Nys, Y., Bain, M., VanImmerseel, F. , 83-132 (2011).
- Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-ghz spectrometer for brillouin scattering analysis. Journal of Visualized Experiments. (106), e53468 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Williams, R. M., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
- Edrei, E., Scarcelli, G. Adaptive optics in spectroscopy and densely labeled-fluorescence applications. Optics Express. 26 (26), 33865-33877 (2018).
