Summary
Denne protokollen ble utviklet for å overvåke de mekaniske egenskapene til nevrale platevev under kyllingembryoneurulasjon. Den er basert på integrering av et Brillouin-mikroskop og et inkubasjonssystem på scenen, som muliggjør levende mekanisk avbildning av nevrale platevev i ex ovo-dyrkede kyllingembryoer.
Abstract
Nevralrørslukning (NTC) er en kritisk prosess under embryonal utvikling. Feil i denne prosessen kan føre til nevralrørsdefekter, forårsaker medfødte misdannelser eller til og med dødelighet. NTC innebærer en rekke mekanismer på genetiske, molekylære og mekaniske nivåer. Mens mekanisk regulering har blitt et stadig mer attraktivt tema de siste årene, forblir det stort sett uutforsket på grunn av mangelen på egnet teknologi for å utføre mekanisk testing av 3D embryonalt vev in situ. Som svar har vi utviklet en protokoll for å kvantifisere de mekaniske egenskapene til kyllingembryonalt vev på en ikke-kontakt og ikke-invasiv måte. Dette oppnås ved å integrere et konfokal Brillouin-mikroskop med et inkubasjonssystem på scenen. For å undersøke vevsmekanikk samles et forhåndsdyrket embryo og overføres til en inkubator på scenen for ex ovo-kultur . Samtidig oppnås de mekaniske bildene av nevrale platevevet av Brillouin-mikroskopet på forskjellige tidspunkter under utviklingen. Denne protokollen inneholder detaljerte beskrivelser av prøvepreparering, implementering av Brillouin-mikroskopieksperimenter og etterbehandling og analyse av data. Ved å følge denne protokollen kan forskere studere den mekaniske utviklingen av embryonalt vev under utvikling i lengderetningen.
Introduction
Nevralrørsdefekter (NTD) er alvorlige fødselsskader i sentralnervesystemet forårsaket av svikt i nevralrørslukning (NTC) under embryonal utvikling1. Etiologien til NTD er kompleks. Studier har vist at NTC involverer en sekvens av morfogenetiske prosesser, inkludert konvergent forlengelse, bøyning av nevrale platen (f.eks. Apikal innsnevring), heving av nevrale fold og til slutt vedheft av nevrale fold. Disse prosessene reguleres av flere molekylære og genetiske mekanismer 2,3, og enhver funksjonsfeil i disse prosessene kan resultere i NTD 4,5,6. Som montering bevis tyder på at mekaniske signaler også spiller avgjørende roller under NTC 3,7,8,9,10,11, og forhold har blitt funnet mellom gener og mekaniske signaler 12,13,14, blir det viktig å undersøke vevsbiomekanikken under neurulasjon.
Flere teknikker er utviklet for å måle de mekaniske egenskapene til embryonale vev, inkludert laserablasjon (LA)15, vevsdisseksjon og relaksasjon (TDR)16,17, mikropipetteaspirasjon (MA)18, atomkraftmikroskopi (AFM)-basert nanoindentasjon19, mikroindenter (MI) og mikroplater (MP)20, mikroreologi (MR) med optisk/magnetisk pinsett21,22,23, og dråpebaserte sensorer24. Eksisterende metoder kan måle mekaniske egenskaper ved romlige oppløsninger som spenner fra subcellulære til vevsskalaer. Imidlertid er de fleste av disse metodene invasive fordi de krever kontakt med prøven (f.eks. MA, AFM, MI og MP), injeksjon av eksternt materiale (f.eks. MR og dråpebaserte sensorer) eller vevsdisseksjon (f.eks. LA og TDR). Som et resultat er det utfordrende for eksisterende metoder å overvåke den mekaniske utviklingen av nevrale platevev in situ25. Nylig har reverberant optisk koherens elastografi vist løfte om ikke-kontakt mekanisk kartlegging med høy romlig oppløsning26.
Konfokal Brillouin-mikroskopi er en fremvoksende optisk modalitet som muliggjør ikke-kontaktkvantifisering av vevsbiomekanikk med subcellulær oppløsning 27,28,29,30. Brillouin-mikroskopi er basert på prinsippet om spontan Brillouin-lysspredning, som er vekselvirkningen mellom det innfallende laserlyset og den akustiske bølgen indusert av termiske fluktuasjoner i materialet. Følgelig opplever det spredte lyset en frekvensforskyvning, kjent som Brillouin-skiftet ωR, etter ligningen31:
(1)
Her er brytningsindeksen til materialet, λ er bølgelengden til det innfallende lyset, M' er lengdemodulen, ρ er massetettheten, og θ er vinkelen mellom det innfallende lyset og det spredte lyset. For samme type biologiske materialer er forholdet mellom brytningsindeks og tetthet 
omtrent konstant 28,32,33,34,35,36. Dermed kan Brillouin-skiftet brukes direkte til å estimere relative mekaniske endringer i fysiologiske prosesser. Gjennomførbarheten av Brillouin-mikroskopi er validert i forskjellige biologiske prøver 29,37,38. Nylig ble time-lapse mekanisk avbildning av et levende kyllingembryo demonstrert ved å kombinere et Brillouin-mikroskop med et inkubasjonssystem på scenen39. Denne protokollen gir detaljerte beskrivelser av prøvepreparering, eksperimentimplementering og etterbehandling og analyse av data. Vi håper denne innsatsen vil legge til rette for utbredt bruk av ikke-kontakt Brillouin-teknologi for å studere biomekanisk regulering i embryoutvikling og fødselsskader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Wayne State University.
1. Eksperimentell forberedelse
- Bruk en 70% etanolløsning for å rengjøre og sterilisere saks og pinsett. Forbered også engangspipetter og en sprøyte.
- Forbered et vaskemedium ved å tilsette 3,595 g NaCl til 495 ml avionisert vann. Deretter tilsettes 5 ml penicillin-streptomycin (5 U / ml) til mediet. Fyll en 100 mm petriskål med vaskemediet og varm den til 37 °C.
- Forbered kulturretter i henhold til figur 1, som illustrerer den generelle konfigurasjonen.
- Forbered et stykke filterpapir, klipp det i en rektangulær form på ca. 17 mm × 20 mm, og fjern de fire hjørnene. Lag et hult senter i filterpapiret, ca. 7 mm × 10 mm i størrelse for å sikre embryoet (figur 1, venstre).
MERK: Innsamlingen av embryoer er beskrevet i trinn 2. - Fest en kommersiell tilgjengelig ring (Φ = 1 tomme, se materialfortegnelse) med et fleksibelt filmlag (dvs. parafinfilm), slik at den fleksible filmen også har et hult senter. Denne ringen med filmen vil bli brukt til å holde filterpapiret med embryoet.
- Til slutt legger du den tilberedte ringen i en 35 mm petriskål (figur 1, høyre).
MERK: Filterpapiret er for å sikre og holde det ekstraherte embryoet ved å plassere filterpapiret på membranen og forlate embryoet i det midterste hule området (som vil bli beskrevet i trinn 2). De fire hjørnene ble kuttet for å passe størrelsen på den ytre ringen (ikke nødvendig hvis den allerede er montert). En 35 mm glassbunnskulturskål brukes til bedre laserstråleutbredelse. Retten har en indre brønn (Φ = 23 mm), som kan fylles med albumen for ex ovo kultur. Ringens diameter må være større enn diameteren på den indre brønnen slik at brønnen kan dekkes av den fleksible filmen på ringen (figur 1, innfelt). Størrelsen på filterpapiret er ikke begrenset og kan endres i henhold til størrelsen på den valgte ringen og kulturskålen. Alternativt kan bunnen av fatet forhåndsbelegges med et agaroselag (tykkelse: ~1 mm). Ved å fjerne agarose fra midten av laget ved hjelp av et blad, kan en brønn med en lignende form som det hule senteret av den fleksible filmen opprettes for lasting av albumen. Et kritisk punkt er at de fire sidene av det hule filterpapiret må ha nok bredde (> 5 mm) for å sikre festingen av embryoet.
- Forbered et stykke filterpapir, klipp det i en rektangulær form på ca. 17 mm × 20 mm, og fjern de fire hjørnene. Lag et hult senter i filterpapiret, ca. 7 mm × 10 mm i størrelse for å sikre embryoet (figur 1, venstre).
2. Ekstraksjon og ex ovo kultur av kyllingembryoet
MERK: Dette trinnet er endret fra tidligere publiserte rapporter40,41.
- Etter prekultur, hent egget fra inkubatoren og legg det på sin lange akse på eggekartongbrettet. Rengjør eggeskallet med 70% etanol, sørg for å dekke hele overflaten, og la det hvile i 15 minutter.
- Hold egget på sin korte akse og knekk det nederst. Åpne egget over en ren petriskål på 100 mm for å trekke ut innholdet, som illustrert i figur 2. Pass på at du ikke roterer egget mens du holder og knekker det.
- Bruk en pipette til å overføre og samle ca. 10 ml av det tynne albumet (dvs. det flytende albumen42) til et 15 ml rør for ex ovo kultur bruk. Fyll midtbrønnen på kulturfatet med det oppsamlede tynne albumet (ca. 0,9 ml), som vist i figur 3. Fyllingsprosessen skal være langsom, og unngå dannelse av bobler inne i brønnen. Sørg for at dyrkingsretten med albumen varmes opp til 37 °C.
MERK: Denne retten vil bli brukt til dyrking av embryoet ex ovo. Nye kulturretter fylt med vaskemedium vil bli brukt under Brillouin-avbildning (se trinn 3). - Bruk silkepapir til å fjerne det tykke albumen (dvs. tyktflytende albumen) festet til embryoet forsiktig ved å separere albumen forsiktig fra vitellinemembranen, som vist i figur 4. Unngå direkte kontakt med vitellinemembranen.
- Etter å ha fjernet alt det tykke albumen, fest filterpapiret forsiktig til vitellinemembranen. Forsikre deg om at embryoets kroppsakse stemmer overens med den lange aksen til senterrektangelet på filterpapiret. Bruk saks til å klippe membranen som omgir filterpapiret.
- Bruk pinsett, trekk forsiktig det isolerte filterpapiret bort fra eggeplommen i skrå retning. Vend filterpapiret opp ned for å plassere embryoet med dorsalsiden ned (for invertert mikroskopkonfigurasjon). Senk forsiktig hele filterpapiret fra den ene siden av den lange aksen ned i 100 mm petriskålen med vaskemediet på skrå måte.
- Vask bort gjenværende eggeplomme ved å forsiktig spraye vaskemediet parallelt med filterpapiret med en ren pipette. Unngå å spraye vaskemediet direkte på membranen.
- Etter å ha fjernet all eggeplommen, fjern forsiktig filterpapiret fra vaskemediet og bruk silkepapir til å absorbere overflødig medium fra kantene. Legg deretter filterpapiret med embryoet på dyrkningsfatet, og sørg for at den dorsale siden av embryoet vender nedover, som illustrert i figur 5. For å opprettholde fuktighet, legg et fuktet silkepapir i fatet.
- Overfør kulturskålen til inkubatoren på scenen for ex ovo kultur.
3. Brillouin måling av embryoet
- Forbered et annet sett med kulturretter og fyll dem med vaskemedium. Sørg for at vaskemediet varmes opp til 37 °C.
- Når embryoet når ønsket utviklingsstadium, overfør filterpapiret med embryoet til kulturskålen fylt med vaskemedium. Plasser kulturretten i inkubatoren på scenen i Brillouin-mikroskopet (se materialfortegnelse).
- Før du utfører Brillouin-målingen, lagre et lysfeltbilde av hele embryoet for referanse. Den detaljerte konfigurasjonen av Brillouin-mikroskopet er tidligere beskrevet30 og er oppsummert i resultatdelen (figur 6).
- Mål Brillouin-signalet for vann og metanol, som vil bli brukt i trinn 4 for kalibreringsprosessen.
- Juster innfallende lasereffekt og elektronmultipliserende ladningskoblet enhet (EMCCD, se materialfortegnelse) kameraeksponeringstid for å oppnå minst 10 000 tellinger av Brillouin-signal. Bruk bildet for lysfelt som veiledning, og definer skanneområdet og trinnstørrelsen. Skaff deg et Brillouin-bilde av interesseområdet ved å skanne embryoet ved hjelp av et 2D-translasjonsstadium.
MERK: Det horisontale skanneområdet kan bestemmes basert på bildet i lysfeltet, og det vertikale (dvs. dybde) skanneområdet kan bestemmes basert på signalstyrken fra en rask og grov skanning. For å forhindre fotoskade på embryoet, begrens hendelseseffekten til 25 mW, og sett eksponeringstiden til EMCCD-kameraet til 50 ms. Velg en trinnstørrelse på 2 μm i horisontal retning og 1 μm i vertikal retning for å balansere bildekvalitet og anskaffelsestid. - Etter å ha fullført skanningen, fjern forsiktig filterpapiret med embryoet og bruk silkepapir for å absorbere overflødig vaskemedium. Legg deretter filterpapiret tilbake i kulturfatet fylt med tynt albumen for kontinuerlig dyrking i inkubatoren på scenen.
- Gjenta trinn 3.2-3.5 med jevne tidsintervaller (f.eks. 1,5 time) for å ta "time-lapse" Brillouin-bilder etter hvert som embryoet utvikler seg.
- Rekonstruer 2D Brillouin-bildet ved å følge trinn 4.
4. Brillouin bilde rekonstruksjon
- Kalibrer Brillouin-spektrometeret ved hjelp av Brillouin-signaler av vann og metanol for å beregne det frie spektralområdet (FSR) og piksel-til-frekvens-konverteringsforholdet (PR) til spektrometeret30. De kalibrerte verdiene til FSR og PR vil bli brukt til å beregne Brillouin-skiftet til embryoet ved hver piksel.
MERK: Figur 7A viser et rått Brillouin-spektrum fanget av EMCCD-kameraet. Ved å vertikalt summere spekteret og deretter gjøre en Lorentzian-montering, kan toppavstanden Δd for de to prikkene oppnås (figur 7B). Ved å få toppavstanden til vann Δdvann og metanol Δdmetanol, kan FSR og PR beregnes basert på ligningene30: PR = 2 · (ωmetanol-ω vann)/(Δdvann- Δdmetanol), og FSR = 2·ωvann + PR·Δdvann, med kjent Brillouin forskyvning av vann ωvann = 6,01 GHz og metanol ωmetanol = 4,49 GHz ved 660 nm. - Få toppavstanden til Brillouin-signalet ved hver piksel i prøven. Beregn Brillouin-skiftet basert på den kalibrerte FSR og PR:ω-prøven = 0,5 (FSR - PR xΔd-prøven)30, hvorω-prøven er Brillouin-forskyvningen av prøven, ogΔd-prøven er toppavstanden til Brillouin-signalet.
- Rekonstruer 2D Brillouin-bildet basert på Brillouin-skiftene til alle bildepunktene.
MERK: For å utføre lokal analyse kan man velge en region av interesse (f.eks. Nevralplaten) fra det oppkjøpte Brillouin-bildet og kvantifisere dets mekaniske egenskaper. En vanlig tilnærming er å beregne gjennomsnittlig Brillouin-skift for den valgte regionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6 viser skjematisk fremstilling av Brillouin-mikroskopet. Systemet benytter en 660 nm laser som lyskilde. En isolator plasseres rett etter laserhodet for å avvise tilbakereflektert lys, og et filter med nøytral tetthet (ND) brukes til å justere lasereffekten. Et par linser, L1 og L2, med brennvidder på henholdsvis f1 = 16 mm og f2 = 100 mm, brukes til å utvide laserstrålen. En halvbølgeplate (HWP) og en lineær polarisator (Polarisator 1) brukes til å justere kraften til strålen som skinner på enten prøven eller kalibreringsmaterialene (dvs. vann og metanol) etter den polariserte strålesplitteren (PBS). For å fokusere laseren inn i prøven og samle bakoverspredt lys, brukes en objektivlinse (OBJ2) med en numerisk blenderåpning (NA) på 0,6 og en forstørrelse på 40. Innfallslyset og bakoverspredt lys separeres av samme PBS etter polarisasjonsjustering ved hjelp av en kvartbølgeplate (QWP2). På samme måte brukes OBJ1 og QWP1 til å lede laserstrålen til kalibreringsmaterialene. Brillouin-signalet leveres av en enkeltmodusfiber til et Brillouin-spektrometer43 for analyse. Inne i spektrometeret kobler en sylindrisk linse (C1) Brillouin-signalet til den første VIPA-etalonen (virtuelt avbildet faset matrise). Utgangen fra den første VIPA-etalon omformes av en annen sylindrisk linse (C2) og fokuseres på maske 1 for å avvise ikke-spredt laserlys. Deretter kobles Brillouin-signalet til et andre VIPA-etalon av en sfærisk linse (SL1), omformet av en annen sfærisk linse (SL2), og projiseres på maske 2. Det resulterende spektralmønsteret går deretter gjennom en 4-f-enhet for støyavvisning og projiseres på en EMCCD for opptak. Vi brukte et kommersielt mikroskoporgan (se Materialliste). Vanligvis kan ethvert mikroskophus med forskjellige merker brukes så lenge det har en tilgjengelig port for levering av den eksterne lysstrålen. Inkubatoren på scenen er et metallkammer med temperatur-, gass- og luftstrømskontroll. Prøvens posisjon justeres via det motoriserte 2D-trinnet. Et CMOS-kamera (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) brukes til å skaffe seg bildet med det lyse feltet.
Figur 8 viser time-lapse-lysfeltet og Brillouin-bildene av et representativt kyllingembryo. Embryoet ble ekstrahert etter 29 timer i ovokultur, og bildene ble tatt ved 29 timer, 30,5 timer og 32 timer med ex ovo-kultur, som tilsvarer somitetall på henholdsvis 4, 5 og 8,44. Generelt kan embryoet dyrkes i inkubatoren på scenen i minst 24 timer. Den røde linjen i bildet i det lyse feltet angir plasseringen for Brillouin-avbildning. Med de ervervede Brillouin-bildene ble nevralplateregionen valgt (uthevet av den svarte stiplede linjen i figur 8) og beregnet gjennomsnittlig Brillouin-skift i denne regionen. Som vist i figur 9 øker den gjennomsnittlige Brillouin-forskyvningen av vevet under nevralrørslukking. Lengdemodulen beregnes også ut fra ligning (1), der verdien = 1,3330 estimeres fra litteratur ved bruk av sebrafiskembryoer45, forutsatt at verdien er relativt konstant for lignende typer biologisk vev28,33.
Figur 1: Skjematisk av hele kulturparabolkonfigurasjonen for embryonal utvikling. Denne figuren viser et filterpapir for å feste embryoet til venstre og en 35 mm kulturfat med en ring festet med et fleksibelt filmlag til høyre. Tverrsnittsskjemaet er også gitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Prosessen med å åpne eggeskallet over en ren 100 mm petriskål for å trekke egget ut i retten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fyll midtbrønnen på kulturfatet med tynt albumen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Dra bort det tykke albumen i retningen indikert med den røde pilen, ved hjelp av et stykke silkepapir. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Plasseringen av filterpapiret i dyrkningsfatet med embryoet på oppsiden av filterpapiret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Skjematisk av Brillouin-mikroskopet. Den røde pilen indikerer lysbanen til laserstrålen, og den oransje pilen indikerer lysbanen til Brillouin-signalet. L1, L2, SL1-SL4: sfærisk linse; SF: romlig filter; C1, C2: sylindrisk linse, HWP: halvbølgeplate; PBS: polarisert strålesplitter; QWP1, QWP2: kvartbølgeplate; OBJ1, OBJ2: Objektiv linse; LP: linsepar. VIPA: virtuelt avbildet faset matrise. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Representativt Brillouin-signal. (A) Et representativt Brillouin-spektrum fanget av AMK-sentralen. (B) Et vertikalt summert Brillouin-spektrum og tilsvarende Lorentzian-monteringsresultat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Lyse feltbilder og tilhørende Brillouin-tverrsnittsbilder av embryoet ved 29 timer, 30,5 timer og 32 timer med 4, 5 og 8 somitter. Røde, heltrukne linjer angir stedet for Brillouin-avbildning, og den svarte stiplede linjen angir nevralplateområdet. Det grå området i 32 t (8 somitter) bilde er en artefakt av kurvetilpasning på grunn av det svake Brillouin-signalet og er ekskludert ved beregning av gjennomsnittlig skift. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Brillouinforskyvning og estimert lengdemodul av nevralplaten mot somittantall og inkubasjonstid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tidlige utviklingen av embryoet kan lett påvirkes av eksterne forstyrrelser. Derfor er det nødvendig med stor forsiktighet under prøveutvinning og overføring. Et potensielt problem er løsningen av embryoet fra filterpapiret, noe som kan føre til krymping av vitellinemembranen og resultere i en skråstilt artefakt av nevrale platen i Brillouin-avbildning. Videre kan denne krympingen stoppe utviklingen av embryoet. Det bør tas hensyn til flere kritiske trinn for å forhindre løsrivelse. For det første, i trinn 2.4, er det avgjørende å sikre grundig fjerning av albumen fra membranoverflaten. Eventuell gjenværende albumen kan hindre riktig vedheft av membranen til filterpapiret46,47. I tillegg er det under vaskeprosessen viktig å sprøyte vaskemediet i en retning parallelt med membranen. Direkte treffer membranen med væskestrømmen kan forårsake løsrivelse eller til og med rive membranen. Videre bør hele vaskeprosessen fullføres innen kort tid (f.eks. <3 min), da langvarig nedsenking også kan føre til løsrivelse av embryoet fra filterpapiret.
Før du utfører Brillouin-målinger, er det nødvendig å overføre embryoet til en tallerken med vaskemedium. Dette skyldes at Brillouin-forskyvningen av albumen er svært nær nevralplatevevet, noe som forårsaker dårlig bildekontrast. Brillouin-avbildning oppnås ved punktskanning, noe som kan være tidkrevende, spesielt når det gjelder mange punkter. I denne protokollen er skanneområdet ca. 400 μm horisontalt og mindre enn 100 μm vertikalt. For å unngå forstyrrelser i embryoets utvikling ble den totale innsamlingstiden begrenset til innen 30 minutter. Dette oppnås ved å benytte en trinnstørrelse på 2 μm horisontalt og 1 μm vertikalt. Hvis man bare er interessert i det gjennomsnittlige Brillouin-skiftet i en bestemt region, kan en rask og grov skanning (f.eks. med en trinnstørrelse på 4 μm både horisontalt og vertikalt) implementeres, noe som vil ta mindre enn 5 minutter og kan redusere den negative effekten på embryoutviklingen.
Brillouin-mikroskopi tilbyr en sanntids og ikke-invasiv bildebehandlingsmetode for å undersøke biomekanikken til embryoutvikling. En begrensning av denne metoden ligger i dens penetrasjonsdybde, som er ca. 100-200 μm avhengig av embryoets utviklingsstadium. Selv om økning av laserstyrken og/eller eksponeringstiden til AMK-sentralen delvis kan løse dette problemet, går det på bekostning av potensiell fototoksisitet og/eller lang anskaffelsestid. Alternativt kan eksisterende optiske teknologier, som adaptiv optikk, potensielt brukes til å forbedre penetrasjonsdybden48.
Avslutningsvis har vi etablert en protokoll for å undersøke de mekaniske egenskapene til levende kyllingembryoer ved bruk av Brillouin-mikroskopi. Denne ikke-kontaktmetoden kan oppfylle nåværende uoppfylte behov og er komplementær til andre eksisterende verktøy for å studere biomekanikk i embryonal utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (K25HD097288, R21HD112663).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Fisherbrand | FB0875713 | |
| 2D motorized stage | Prior Scientific | H117E2 | |
| 35 mm Petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Brillouin Microscope with on-stage incubator | N/A | N/A | This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30 |
| Chicken eggs | University of Connecticut | N/A | |
| CMOS camera | Thorlabs | CS2100M-USB | |
| EMCCD camera | Andor | iXon | |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | #2701 | |
| Filter paper | Whatman | 1004-070 | |
| Incubator for in ovo culture | GQF Manufacturing Company Inc. | GQF 1502 | |
| Ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Microscope body | Olympus | IX73 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| On-stage incubator | Oko labs | OKO-H301-PRIOR-H117 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-711-6M | |
| Scissors | Artman instruments | N/A | 3pc Micro Scissors 5 |
| Syringe | BD | 305482 | |
| Tissue paper | Kimwipes | N/A | |
| Tube | Corning | 430052 | |
| Tweezers | DR Instruments | N/A | Microdissection Forceps Set |
References
- Greene, N. D. E., Copp, A. J.
- Suzuki, M., Morita, H., Ueno, N. Molecular mechanisms of cell shape changes that contribute to vertebrate neural tube closure. Development, Growth & Differentiation. 54 (3), 266-276 (2012).
- Nikolopoulou, E., Galea, G. L., Rolo, A., Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube closure: Cellular, molecular and biomechanical mechanisms. Development. 144 (4), 552-566 (2017).
- Juriloff, D. M., Harris, M. J. Mouse models for neural tube closure defects. Human Molecular Genetics. 9 (6), 993-1000 (2000).
- Copp, A. J., Greene, N. D. E. Genetics and development of neural tube defects. The Journal of Pathology: A Journal of the Pathological Society of Great Britain and Ireland. 220 (2), 217-230 (2010).
- Wang, M., De Marco, P., Capra, V., Kibar, Z. Update on the role of the non-canonical wnt/planar cell polarity pathway in neural tube defects. Cells. 8 (10), 1198 (2019).
- Galea, G. L., et al. Biomechanical coupling facilitates spinal neural tube closure in mouse embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (26), E5177-E5186 (2017).
- Moon, L. D., Xiong, F.
- Christodoulou, N., Skourides, P. A. Distinct spatiotemporal contribution of morphogenetic events and mechanical tissue coupling during xenopus neural tube closure. Development. 149 (13), (2022).
- De Goederen, V., Vetter, R., Mcdole, K., Iber, D. Hinge point emergence in mammalian spinal neurulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2117075119 (2022).
- Christodoulou, N., Skourides, P. A. Somitic mesoderm morphogenesis is necessary for neural tube closure during xenopus development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1091629 (2023).
- Nikolopoulou, E., et al. Spinal neural tube closure depends on regulation of surface ectoderm identity and biomechanics by grhl2. Nature Communications. 10 (1), 2487 (2019).
- Nychyk, O., et al. Vangl2-environment interaction causes severe neural tube defects, without abnormal neuroepithelial convergent extension. Disease Models & Mechanisms. 15 (1), 049194 (2022).
- Li, B., Brusman, L., Dahlka, J., Niswander, L. A. Tmem132a ensures mouse caudal neural tube closure and regulates integrin-based mesodermal migration. Development. 149 (17), (2022).
- Zulueta-Coarasa, T., Fernandez-Gonzalez, R. Laser ablation to investigate cell and tissue mechanics in vivo. Integrative Mechanobiology: Micro-and Nano Techniques in Cell Mechanobiology. , Cambridge University Press. 128-147 (2015).
- Wiebe, C., Brodland, G. W. Tensile properties of embryonic epithelia measured using a novel instrument. Journal of Biomechanics. 38 (10), 2087-2094 (2005).
- Luu, O., David, R., Ninomiya, H., Winklbauer, R. Large-scale mechanical properties of xenopus embryonic epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), 4000-4005 (2011).
- Maître, J. L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nature Cell Biology. 10 (4), 429-436 (2008).
- Zamir, E. A., Srinivasan, V., Perucchio, R., Taber, L. A. Mechanical asymmetry in the embryonic chick heart during looping. Annals of Biomedical Engineering. 31, 1327-1336 (2003).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1416-1421 (2015).
- Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476 (7358), 57-62 (2011).
- Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nature Cell Biology. 17 (4), 470-479 (2015).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
- Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 55, 119-130 (2016).
- Christian, Z. D., et al. High-resolution 3D biomechanical mapping of embryos with reverberant optical coherence elastography (Rev-OCE). Proceedings of SPIE. , 123670 (2023).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. J. N. P. Confocal brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nature Photonics. 1 (1), 39-43 (2008).
- Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by brillouin microscopy. Nature Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
- Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: An emerging tool for mechanobiology. Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
- Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on brillouin module to confocal microscopes. Nature Protocols. 16 (2), 1251-1275 (2021).
- Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic press. (2020).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by brillouin optical microscopy. Biophysical Journal. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. H. Brillouin optical microscopy for corneal biomechanics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 185-190 (2012).
- Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive brillouin microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 37217 (2016).
- Zhang, J., et al. Tissue biomechanics during cranial neural tube closure measured by brillouin microscopy and optical coherence tomography. Birth Defects Research. 111 (14), 991-998 (2019).
- Zhang, J., et al. Nuclear mechanics within intact cells is regulated by cytoskeletal network and internal nanostructures. Small. 16 (18), 1907688 (2020).
- Elsayad, K., Polakova, S., Gregan, J. Probing mechanical properties in biology using brillouin microscopy. Trends in Cell Biology. 29 (8), 608-611 (2019).
- Poon, C., Chou, J., Cortie, M., Kabakova, I. Brillouin imaging for studies of micromechanics in biology and biomedicine: From current state-of-the-art to future clinical translation. Journal of Physics: Photonics. 3 (1), 012002 (2020).
- Handler, C., Scarcelli, G., Zhang, J. Time-lapse mechanical imaging of neural tube closure in live embryo using brillouin microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 263 (2023).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 220 (3), 284-289 (2001).
- Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e54636 (2016).
- Nys, Y., Guyot, N. Improving the safety and quality of eggs and egg products, vol 1: Egg chemistry, production and consumption. Nys, Y., Bain, M., VanImmerseel, F. , 83-132 (2011).
- Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-ghz spectrometer for brillouin scattering analysis. Journal of Visualized Experiments. (106), e53468 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Williams, R. M., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
- Edrei, E., Scarcelli, G. Adaptive optics in spectroscopy and densely labeled-fluorescence applications. Optics Express. 26 (26), 33865-33877 (2018).
