Summary
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die mechanischen Eigenschaften des Neuralplattengewebes während der Neurulation des Hühnerembryos im Längsschnitt zu überwachen. Es basiert auf der Integration eines Brillouin-Mikroskops und eines Inkubationssystems auf der Bühne und ermöglicht die mechanische Live-Bildgebung von Neuralplattengewebe in Ex-Ovo-kultivierten Kükenembryonen.
Abstract
Der Neuralrohrverschluss (NTC) ist ein kritischer Prozess während der Embryonalentwicklung. Ein Versagen in diesem Prozess kann zu Neuralrohrdefekten führen, die angeborene Fehlbildungen oder sogar den Tod verursachen. NTC umfasst eine Reihe von Mechanismen auf genetischer, molekularer und mechanischer Ebene. Während die mechanische Regulation in den letzten Jahren zu einem immer attraktiveren Thema geworden ist, bleibt es aufgrund des Mangels an geeigneter Technologie für die mechanische Prüfung von 3D-embryonalem Gewebe in situ weitgehend unerforscht. Als Reaktion darauf haben wir ein Protokoll entwickelt, um die mechanischen Eigenschaften von embryonalem Gewebe von Hühnern berührungslos und nicht-invasiv zu quantifizieren. Dies wird durch die Integration eines konfokalen Brillouin-Mikroskops mit einem Inkubationssystem auf der Bühne erreicht. Um die Gewebemechanik zu untersuchen, wird ein vorkultivierter Embryo entnommen und in einen Inkubator auf der Bühne für die Ex-Ovo-Kultur überführt. Gleichzeitig werden die mechanischen Bilder des Neuralplattengewebes vom Brillouin-Mikroskop zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung aufgenommen. Dieses Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen der Probenvorbereitung, der Durchführung von Brillouin-Mikroskopie-Experimenten sowie der Datennachbearbeitung und -analyse. Durch die Befolgung dieses Protokolls können Forscher die mechanische Entwicklung des embryonalen Gewebes während der Entwicklung in Längsrichtung untersuchen.
Introduction
Neuralrohrdefekte (NTDs) sind schwere Geburtsfehler des zentralen Nervensystems, die durch Störungen des Neuralrohrverschlusses (NTC) während der Embryonalentwicklung verursachtwerden 1. Die Ätiologie von NTDs ist komplex. Studien haben gezeigt, dass NTC eine Abfolge morphogenetischer Prozesse beinhaltet, einschließlich konvergenter Ausdehnung, Biegung der Neuralplatte (z. B. apikale Verengung), Anhebung der Neuralfalte und schließlich Adhäsion der Neuralfalte. Diese Prozesse werden durch mehrere molekulare und genetische Mechanismen reguliert 2,3, und jede Fehlfunktion dieser Prozesse kann zu NTDs führen 4,5,6. Da sich die Beweise häufen, dass mechanische Signale auch während NTCeine entscheidende Rolle spielen 3,7,8,9,10,11 und Beziehungen zwischen Genen und mechanischen Hinweisen gefunden wurden 12,13,14, ist es unerlässlich, die Biomechanik des Gewebes während der Neurulation zu untersuchen.
Zur Messung der mechanischen Eigenschaften von embryonalem Gewebe wurden verschiedene Techniken entwickelt, darunter Laserablation (LA)15, Gewebedissektion und -entspannung (TDR)16,17, Mikropipettenaspiration (MA)18, Rasterkraftmikroskopie (AFM)-basierte Nanoindentation19, Mikroeindringkörper (MI) und Mikrotiterplatten (MP)20, Mikrorheologie (MR) mit optischer/magnetischer Pinzette 21,22,23und tröpfchenbasierte Sensoren24. Bestehende Methoden können mechanische Eigenschaften mit räumlichen Auflösungen messen, die von subzellulären bis hin zu Gewebemaßstäben reichen. Die meisten dieser Methoden sind jedoch invasiv, da sie Kontakt mit der Probe (z. B. MA, AFM, MI und MP), externe Materialinjektion (z. B. MR- und tröpfchenbasierte Sensoren) oder Gewebedissektion (z. B. LA und TDR) erfordern. Infolgedessen ist es für bestehende Methoden eine Herausforderung, die mechanische Entwicklung von Neuralplattengewebe in situzu überwachen 25. In jüngster Zeit hat sich die nachhallende optische Kohärenz-Elastographie als vielversprechend für die berührungslose mechanische Kartierung mit hoher räumlicher Auflösung erwiesen26.
Die konfokale Brillouin-Mikroskopie ist eine aufstrebende optische Modalität, die eine berührungslose Quantifizierung der Gewebebiomechanik mit subzellulärer Auflösungermöglicht 27,28,29,30. Die Brillouin-Mikroskopie basiert auf dem Prinzip der spontanen Brillouin-Lichtstreuung, also der Wechselwirkung zwischen dem einfallenden Laserlicht und der durch thermische Fluktuationen im Material induzierten Schallwelle. Folglich erfährt das Streulicht eine Frequenzverschiebung, die als Brillouin-Verschiebung ωR bekannt ist, nach der Gleichung31:
(1)
Hier ist der Brechungsindex des Materials, λ ist die Wellenlänge des einfallenden Lichts, M' ist der Längsmodul, ρ ist die Massendichte und θ ist der Winkel zwischen dem einfallenden Licht und dem Streulicht. Für die gleiche Art von biologischem Material ist das Verhältnis von Brechungsindex und Dichte 
ungefährkonstant 28,32,33,34,35,36. Somit kann die Brillouin-Verschiebung direkt verwendet werden, um relative mechanische Veränderungen physiologischer Prozesse abzuschätzen. Die Durchführbarkeit der Brillouin-Mikroskopie wurde in verschiedenen biologischen Proben validiert 29,37,38. Kürzlich wurde die mechanische Bildgebung eines lebenden Kükenembryos im Zeitraffer demonstriert, indem ein Brillouin-Mikroskop mit einem Inkubationssystem auf der Bühnekombiniert wurde 39. Dieses Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen der Probenvorbereitung, der Durchführung von Experimenten sowie der Datennachbearbeitung und -analyse. Wir hoffen, dass diese Bemühungen die weit verbreitete Einführung der berührungslosen Brillouin-Technologie zur Untersuchung der biomechanischen Regulation bei Embryonalentwicklung und Geburtsfehlern erleichtern werden.
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Protocol
Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wayne State University genehmigt.
1. Experimentelle Vorbereitung
- Verwenden Sie eine 70%ige Ethanollösung, um die Schere und Pinzette zu reinigen und zu sterilisieren. Bereiten Sie außerdem Einwegpipetten und eine Spritze vor.
- Bereiten Sie ein Waschmedium vor, indem Sie 3,595 g NaCl zu 495 ml deionisiertem Wasser geben. Geben Sie dann 5 ml Penicillin-Streptomycin (5 U/ml) in das Medium. Füllen Sie eine 100 mm Petrischale mit dem Waschmedium und erwärmen Sie sie auf 37 °C.
- Bereiten Sie Kulturschalen gemäß Abbildung 1 zu, die die Gesamtkonfiguration veranschaulicht.
- Bereiten Sie ein Stück Filterpapier vor, schneiden Sie es in eine rechteckige Form von ca. 17 mm × 20 mm und entfernen Sie die vier Ecken. Erzeugen Sie eine hohle Mitte im Filterpapier, ca. 7 mm × 10 mm groß, um den Embryo zu sichern (Abbildung 1, links).
HINWEIS: Die Entnahme von Embryonen wird in Schritt 2 beschrieben. - Befestigen Sie einen handelsüblichen Ring (Φ = 1 Zoll, siehe Materialtabelle) mit einer flexiblen Folienschicht (d. h. Paraffinfolie) und stellen Sie sicher, dass die flexible Folie auch eine hohle Mitte hat. Dieser Ring mit der Folie wird verwendet, um das Filterpapier mit dem Embryo zu halten.
- Legen Sie schließlich den vorbereiteten Ring in eine 35-mm-Petrischale (Abbildung 1, rechts).
HINWEIS: Das Filterpapier dient zum Sichern und Halten des extrahierten Embryos, indem das Filterpapier auf die Membran gelegt und der Embryo im mittleren Hohlbereich belassen wird (was in Schritt 2 beschrieben wird). Die vier Ecken wurden auf die Größe des Außenrings zugeschnitten (nicht notwendig, wenn er bereits montiert ist). Für eine bessere Laserstrahlausbreitung wird eine 35-mm-Kulturschale mit Glasboden verwendet. Die Schale hat eine innere Vertiefung (Φ = 23 mm), die mit Eiweiß für die Ex-Ovo-Kultur gefüllt werden kann. Der Durchmesser des Rings muss größer sein als der Durchmesser des inneren Wells, damit das Well von der flexiblen Folie auf dem Ring abgedeckt werden kann (Abbildung 1, Einschub). Die Größe des Filterpapiers ist nicht begrenzt und kann je nach Größe des gewählten Rings und der Kulturschale geändert werden. Alternativ kann der Boden der Schale mit einer Agaroseschicht (Dicke: ~1 mm) vorbeschichtet werden. Durch Entfernen von Agarose aus der Mitte der Schicht mit einer Klinge kann eine Vertiefung mit einer ähnlichen Form wie die hohle Mitte der flexiblen Folie zum Laden von Albumin erzeugt werden. Ein kritischer Punkt ist, dass die vier Seiten des Hohlfilterpapiers eine ausreichende Breite (> 5 mm) haben müssen, um die Anhaftung des Embryos zu gewährleisten.
- Bereiten Sie ein Stück Filterpapier vor, schneiden Sie es in eine rechteckige Form von ca. 17 mm × 20 mm und entfernen Sie die vier Ecken. Erzeugen Sie eine hohle Mitte im Filterpapier, ca. 7 mm × 10 mm groß, um den Embryo zu sichern (Abbildung 1, links).
2. Extraktion und Ex-Ovo-Kultur des Hühnerembryos
HINWEIS: Dieser Schritt wurde gegenüber den zuvor veröffentlichten Berichten 40,41 geändert.
- Nehmen Sie das Ei nach der Vorkultur aus dem Inkubator und legen Sie es auf seiner Längsachse auf die Eierkartonschale. Reinigen Sie die Eierschale mit 70% Ethanol, achten Sie darauf, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist, und lassen Sie sie dann 15 Minuten ruhen.
- Halten Sie das Ei auf seiner kurzen Achse und schlagen Sie es unten auf. Öffnen Sie das Ei über einer sauberen 100-mm-Petrischale, um den Inhalt zu extrahieren, wie in Abbildung 2 dargestellt. Achten Sie darauf, das Ei nicht zu drehen, während Sie es halten und aufschlagen.
- Übertragen und sammeln Sie mit einer Pipette etwa 10 ml des dünnen Eiweißes (d. h. des flüssigen Eiweißes42) in ein 15-ml-Röhrchen für die Verwendung in der Ex-Ovo-Kultur . Füllen Sie die mittlere Vertiefung der Kulturschale mit dem gesammelten dünnen Eiweiß (ca. 0,9 ml), wie in Abbildung 3 gezeigt. Der Füllvorgang sollte langsam sein, um die Bildung von Blasen im Well zu vermeiden. Achten Sie darauf, dass die Kulturschale mit Eiweiß auf 37 °C erwärmt ist.
HINWEIS: Diese Schale wird für die Kultivierung des Embryos ex ovo verwendet. Während der Brillouin-Bildgebung werden neue Kulturschalen verwendet, die mit Waschmedium gefüllt sind (siehe Schritt 3). - Entfernen Sie mit Seidenpapier vorsichtig das dicke Eiweiß (d. h. viskoses Eiweiß), das am Embryo haftet, indem Sie das Eiweiß vorsichtig von der Vitellinmembran trennen, wie in Abbildung 4 gezeigt. Vermeiden Sie den direkten Kontakt mit der Vitellinmembran.
- Nachdem Sie das gesamte dicke Eiweiß entfernt haben, befestigen Sie das Filterpapier vorsichtig auf der Vitelline-Membran. Stellen Sie sicher, dass die Körperachse des Embryos mit der Längsachse des mittleren Rechtecks auf dem Filterpapier ausgerichtet ist. Verwenden Sie eine Schere, um die Membran um das Filterpapier herum zu schneiden.
- Ziehen Sie das isolierte Filterpapier mit einer Pinzette vorsichtig in schräger Richtung vom Eigelb weg. Drehen Sie das Filterpapier auf den Kopf, um den Embryo mit der Rückenseite nach unten zu positionieren (für die Konfiguration des inversen Mikroskops). Tauchen Sie das gesamte Filterpapier vorsichtig von einer Seite der Längsachse mit dem Waschmedium schräg in die 100 mm Petrischale.
- Waschen Sie das restliche Eigelb ab, indem Sie das Waschmedium mit einer sauberen Pipette vorsichtig parallel zum Filterpapier sprühen. Vermeiden Sie es, das Waschmedium direkt auf die Membran zu sprühen.
- Nachdem Sie das gesamte Eigelb entfernt haben, entfernen Sie vorsichtig das Filterpapier vom Waschmedium und verwenden Sie Seidenpapier, um überschüssiges Medium von den Rändern aufzusaugen. Legen Sie dann das Filterpapier mit dem Embryo auf die Kulturschale und stellen Sie sicher, dass die dorsale Seite des Embryos nach unten zeigt, wie in Abbildung 5 dargestellt. Um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, legen Sie ein angefeuchtetes Seidenpapier in die Schale.
- Überführen Sie die Kulturschale in den Inkubator auf der Bühne für die Ex-Ovo-Kultur .
3. Brillouin-Messung des Embryos
- Bereiten Sie einen weiteren Satz Kulturschalen vor und füllen Sie sie mit Waschmedium. Stellen Sie sicher, dass das Waschmedium auf 37 °C erwärmt ist.
- Wenn der Embryo das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht hat, geben Sie das Filterpapier mit dem Embryo in die mit Waschmedium gefüllte Kulturschale. Stellen Sie die Kulturschale in den Inkubator des Brillouin-Mikroskops auf der Bühne (siehe Materialtabelle).
- Speichern Sie vor der Brillouin-Messung ein Hellfeldbild des gesamten Embryos als Referenz. Die detaillierte Konfiguration des Brillouin-Mikroskops wurde bereits beschrieben30 und ist im Abschnitt Ergebnisse zusammengefasst (Abbildung 6).
- Messen Sie das Brillouin-Signal von Wasser und Methanol, das in Schritt 4 für den Kalibrierungsprozess verwendet wird.
- Passen Sie die Belichtungszeit der einfallenden Laserleistung und der elektronenmultiplen ladungsgekoppelten Vorrichtung (EMCCD ) an, um mindestens 10.000 Zählungen des Brillouin-Signals zu erreichen. Richten Sie anhand des Hellfeldbilds den Scanbereich und die Schrittweite ein. Erfassen Sie ein Brillouin-Bild der interessierenden Region, indem Sie den Embryo mit einem 2D-Translationsstadium scannen.
HINWEIS: Der horizontale Scanbereich kann basierend auf dem Hellfeldbild bestimmt werden, und der vertikale (d. h. Tiefen-) Scanbereich kann basierend auf der Signalstärke bestimmt werden, die durch einen schnellen und groben Scan erhalten wird. Um Lichtschäden am Embryo zu vermeiden, begrenzen Sie die einfallende Leistung auf 25 mW und stellen Sie die Belichtungszeit der EMCCD-Kamera auf 50 ms ein. Wählen Sie eine Schrittweite von 2 μm in horizontaler Richtung und 1 μm in vertikaler Richtung, um Bildqualität und Aufnahmezeit auszugleichen. - Entfernen Sie nach Abschluss des Scans vorsichtig das Filterpapier mit dem Embryo und verwenden Sie Seidenpapier, um überschüssiges Waschmedium aufzusaugen. Legen Sie dann das Filterpapier zurück in die mit dünnem Eiweiß gefüllte Kulturschale zur kontinuierlichen Kultivierung im Inkubator auf der Bühne.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.5 in regelmäßigen Zeitabständen (z. B. 1,5 h), um Zeitraffer-Brillouin-Bilder während der Entwicklung des Embryos aufzunehmen.
- Rekonstruieren Sie das 2D-Brillouin-Bild nach Schritt 4.
4. Brillouin-Bildrekonstruktion
- Kalibrieren Sie das Brillouin-Spektrometer unter Verwendung von Brillouin-Signalen von Wasser und Methanol, um den freien Spektralbereich (FSR) und das Pixel-zu-Frequenz-Konversionsverhältnis (PR) des Spektrometers30 zu berechnen. Die kalibrierten Werte von FSR und PR werden verwendet, um die Brillouin-Verschiebung des Embryos an jedem Pixel zu berechnen.
HINWEIS: Abbildung 7A zeigt ein von der EMCCD-Kamera aufgenommenes Brillouin-Rohspektrum. Durch vertikales Summieren des Spektrums und anschließendes Durchführen einer Lorentzschen Anpassung kann der Peakabstand Δd der beiden Punkte erhalten werden (Abbildung 7B). Durch Ermitteln der Spitzenentfernung von Wasser ΔdWasser und Methanol ΔdMethanol können FSR und PR basierend auf den Gleichungen30 berechnet werden: PR = 2· (ωMethanol-ω Wasser)/(ΔdWasser- ΔdMethanol) und FSR = 2·ωWasser + PR·ΔdWasser, mit der bekannten Brillouin-Verschiebung von Wasser ωWasser = 6,01 GHz und Methanol ωMethanol = 4,49 GHz bei 660 nm. - Ermitteln Sie den Spitzenabstand des Brillouin-Signals an jedem Pixel des Samples. Berechnen Sie die Brillouin-Verschiebung basierend auf dem kalibrierten FSR und PR:ω-Probe = 0,5 (FSR - PR xΔd-Probe)30, wobeiω-Probe die Brillouin-Verschiebung der Probe und Δd-Probe der Spitzenabstand des Brillouin-Signals ist.
- Rekonstruieren Sie das 2D-Brillouin-Bild basierend auf den Brillouin-Verschiebungen aller Pixel.
HINWEIS: Um eine lokale Analyse durchzuführen, kann man aus dem aufgenommenen Brillouin-Bild einen interessierenden Bereich (z. B. die Neuralplatte) auswählen und seine mechanischen Eigenschaften quantifizieren. Ein gängiger Ansatz besteht darin, die durchschnittliche Brillouin-Verschiebung der ausgewählten Region zu berechnen.
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Representative Results
Abbildung 6 zeigt das Schema des Brillouin-Mikroskops. Das System verwendet einen 660-nm-Laser als Lichtquelle. Ein Isolator wird direkt hinter dem Laserkopf platziert, um rückreflektiertes Licht zu unterdrücken, und ein ND-Filter (Neutral Density) wird verwendet, um die Laserleistung einzustellen. Ein Linsenpaar, L1 und L2, mit Brennweiten von f1 = 16 mm bzw. f2 = 100 mm, wird verwendet, um den Laserstrahl zu erweitern. Eine Halbwellenplatte (HWP) und ein linearer Polarisator (Polarisator 1) werden verwendet, um die Leistung des Strahls einzustellen, der entweder auf die Probe oder die Kalibriermaterialien (d. h. Wasser und Methanol) nach dem polarisierten Strahlteiler (PBS) scheint. Um den Laser in die Probe zu fokussieren und rückwärts gestreutes Licht zu sammeln, wird eine Objektivlinse (OBJ2) mit einer numerischen Apertur (NA) von 0,6 und einer Vergrößerung von 40 verwendet. Das einfallende Licht und das rückwärts gestreute Licht werden nach der Polarisationseinstellung mit einer Viertelwellenplatte (QWP2) durch dasselbe PBS getrennt. In ähnlicher Weise werden OBJ1 und QWP1 verwendet, um den Laserstrahl zu den Kalibriermaterialien zu führen. Das Brillouin-Signal wird von einer Singlemode-Faser zur Analyse an ein Brillouin-Spektrometer43 geliefert. Im Inneren des Spektrometers koppelt eine zylindrische Linse (C1) das Brillouin-Signal in das erste VIPA-Etalon (virtuell abgebildetes Phased-Array) ein. Der Ausgang des ersten VIPA-Etalons wird durch eine weitere zylindrische Linse (C2) umgeformt und auf Maske 1 fokussiert, um nicht gestreutes Laserlicht zu unterdrücken. Dann wird das Brillouin-Signal durch eine sphärische Linse (SL1) in ein zweites VIPA-Etalon eingekoppelt, durch eine weitere sphärische Linse (SL2) umgeformt und auf Maske 2 projiziert. Das resultierende Spektralmuster durchläuft dann eine 4-f-Einheit zur Rauschunterdrückung und wird zur Aufzeichnung auf ein EMCCD projiziert. Wir verwendeten ein handelsübliches Mikroskopgehäuse (siehe Materialtabelle). Im Allgemeinen kann jedes Mikroskopgehäuse mit verschiedenen Marken verwendet werden, solange es über einen verfügbaren Anschluss für die Abgabe des externen Lichtstrahls verfügt. Der Inkubator auf der Bühne ist eine Metallkammer mit Temperatur-, Gas- und Luftstromregelung. Die Position der Probe wird über den motorisierten 2D-Tisch eingestellt. Eine komplementäre Metalloxid-Halbleiterkamera (CMOS) wird verwendet, um das Hellfeldbild aufzunehmen.
Abbildung 8 zeigt die Zeitraffer-Hellfeld- und Brillouin-Bilder eines repräsentativen Hühnerembryos. Der Embryo wurde nach 29 Stunden In-Ovo-Kultur extrahiert, und die Bilder wurden nach 29 h, 30,5 h und 32 h mit Ex-Ovo-Kultur aufgenommen, was Somitenzahlen von 4, 5 bzw.8 44 entspricht. Im Allgemeinen kann der Embryo mindestens 24 Stunden im Inkubator auf der Bühne kultiviert werden. Die rote Linie im Hellfeldbild zeigt den Ort für die Brillouin-Bildgebung an. Mit den aufgenommenen Brillouin-Bildern wurde die Region der Neuralplatte ausgewählt (hervorgehoben durch die schwarz gestrichelte Linie in Abbildung 8) und die durchschnittliche Brillouin-Verschiebung dieser Region berechnet. Wie in Abbildung 9 gezeigt, nimmt die gemittelte Brillouin-Verschiebung des Gewebes während des Neuralrohrverschlusses zu. Der Längsmodul wird ebenfalls auf der Grundlage von Gleichung (1) berechnet, wobei der Wert von = 1,3330 aus der Literatur unter Verwendung von Zebrafischembryonen45 geschätzt wird, unter der Annahme, dass der Wert für ähnliche Arten von biologischem Gewebe relativ konstant ist28,33.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der gesamten Kulturschalenkonfiguration für die Embryonalentwicklung. Diese Abbildung zeigt links ein Filterpapier zum Anbringen des Embryos und rechts eine 35-mm-Kulturschale mit einem Ring, der mit einer flexiblen Folienschicht befestigt ist. Der Querschnittsplan wird ebenfalls bereitgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Der Prozess des Öffnens der Eierschale über einer sauberen 100-mm-Petrischale, um das Ei in die Schale zu entnehmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Füllen der mittleren Vertiefung der Kulturschale mit dünnem Eiweiß. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Ziehen Sie das dicke Eiweiß mit einem Stück Seidenpapier in die durch den roten Pfeil angezeigte Richtung weg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Die Platzierung des Filterpapiers in der Kulturschale mit dem Embryo auf der Oberseite des Filterpapiers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Schematische Darstellung des Brillouin-Mikroskops. Der rote Pfeil zeigt den Lichtweg des Laserstrahls an, und der orangefarbene Pfeil zeigt den Lichtweg des Brillouin-Signals an. L1, L2, SL1-SL4: sphärische Linse; SF: räumlicher Filter; C1, C2: Zylinderlinse, HWP: Halbwellenplatte; PBS: polarisierter Strahlteiler; QWP1, QWP2: Viertelwellenplatte; OBJ1, OBJ2: Objektiv; LP: Linsenpaar. VIPA: virtuell abgebildetes Phased-Array. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Repräsentatives Brillouin-Signal. (A) Ein repräsentatives Brillouin-Spektrum, das vom EMCCD erfasst wurde. (B) Ein vertikal summiertes Brillouin-Spektrum und entsprechendes Lorentz'sches Anpassungsergebnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Hellfeldbilder und die entsprechenden Brillouin-Querschnittsbilder des Embryos bei 29 h, 30,5 h und 32 h mit 4, 5 und 8 Somiten. Rote durchgezogene Linien zeigen den Ort für die Brillouin-Bildgebung an, und die schwarze gepunktete Linie zeigt die Region der Neuralplatte an. Die graue Fläche im 32-Stunden-Bild (8 Somiten) ist ein Artefakt der Kurvenanpassung aufgrund des schwachen Brillouin-Signals und wird bei der Berechnung der durchschnittlichen Verschiebung ausgeschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Brillouin-Verschiebung und der geschätzte Längsmodul der Neuralplatte in Abhängigkeit von Somitenzahl und Inkubationszeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die frühe Entwicklung des Embryos kann leicht durch äußere Störungen beeinträchtigt werden. Daher ist bei der Probenentnahme und dem Transfer äußerste Vorsicht geboten. Ein potenzielles Problem ist die Ablösung des Embryos vom Filterpapier, was zum Schrumpfen der Vitellinmembran und zu einem gekippten Artefakt der Neuralplatte in der Brillouin-Bildgebung führen kann. Darüber hinaus kann diese Schrumpfung die Entwicklung des Embryos stoppen. Es sollte auf mehrere kritische Schritte geachtet werden, um eine Ablösung zu verhindern. Zunächst ist es in Schritt 2.4 entscheidend, eine gründliche Entfernung des Eiweißes von der Membranoberfläche sicherzustellen. Eventuell vorhandenes Eiweiß kann die ordnungsgemäße Haftung der Membran auf dem Filterpapierbehindern 46,47. Darüber hinaus ist es wichtig, das Waschmedium während des Waschvorgangs parallel zur Membran zu sprühen. Ein direkter Aufprall auf die Membran mit dem Flüssigkeitsstrom kann zu einer Ablösung oder sogar zum Reißen der Membran führen. Des Weiteren sollte der gesamte Waschvorgang innerhalb kurzer Zeit (z.B. <3 min) abgeschlossen sein, da auch längeres Eintauchen zu einer Ablösung des Embryos vom Filterpapier führen kann.
Vor der Durchführung von Brillouin-Messungen muss der Embryo in eine Schüssel mit Waschmedium überführt werden. Dies liegt daran, dass die Brillouin-Verschiebung des Eiweißes sehr nahe am Neuralplattengewebe liegt, was zu einem schlechten Bildkontrast führt. Die Brillouin-Bildgebung wird durch Punktscannen erhalten, was zeitaufwändig sein kann, insbesondere wenn es um viele Punkte geht. In diesem Protokoll beträgt der Scanbereich etwa 400 μm horizontal und weniger als 100 μm vertikal. Um die Entwicklung des Embryos nicht zu stören, wurde die Gesamtaufnahmezeit auf 30 Minuten begrenzt. Dies wird durch die Verwendung einer Schrittweite von 2 μm horizontal und 1 μm vertikal erreicht. Wenn man nur an der durchschnittlichen Brillouin-Verschiebung einer bestimmten Region interessiert ist, kann ein schneller und grober Scan (z.B. mit einer Schrittweite von 4 μm sowohl horizontal als auch vertikal) durchgeführt werden, der weniger als 5 Minuten dauert und die negativen Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung abmildern kann.
Die Brillouin-Mikroskopie bietet einen nicht-invasiven Echtzeit-Bildgebungsansatz zur Untersuchung der Biomechanik der Embryonalentwicklung. Eine Einschränkung dieser Methode liegt in ihrer Eindringtiefe, die je nach Entwicklungsstadium des Embryos etwa 100-200 μm beträgt. Eine Erhöhung der Laserleistung und/oder Belichtungszeit des EMCCD kann dieses Problem zwar teilweise lösen, geht jedoch auf Kosten einer potenziellen Phototoxizität und/oder einer langen Erfassungszeit. Alternativ könnten bestehende optische Technologien, wie z. B. adaptive Optik, möglicherweise eingesetzt werden, um die Eindringtiefe48 zu verbessern.
Abschließend haben wir ein Protokoll zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften lebender Hühnerembryonen mit Hilfe der Brillouin-Mikroskopie erstellt. Diese berührungslose Methode kann den derzeitigen ungedeckten Bedarf decken und ergänzt andere bestehende Werkzeuge zur Untersuchung der Biomechanik in der Embryonalentwicklung.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird vom Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (K25HD097288, R21HD112663) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Fisherbrand | FB0875713 | |
| 2D motorized stage | Prior Scientific | H117E2 | |
| 35 mm Petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Brillouin Microscope with on-stage incubator | N/A | N/A | This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30 |
| Chicken eggs | University of Connecticut | N/A | |
| CMOS camera | Thorlabs | CS2100M-USB | |
| EMCCD camera | Andor | iXon | |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | #2701 | |
| Filter paper | Whatman | 1004-070 | |
| Incubator for in ovo culture | GQF Manufacturing Company Inc. | GQF 1502 | |
| Ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Microscope body | Olympus | IX73 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| On-stage incubator | Oko labs | OKO-H301-PRIOR-H117 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-711-6M | |
| Scissors | Artman instruments | N/A | 3pc Micro Scissors 5 |
| Syringe | BD | 305482 | |
| Tissue paper | Kimwipes | N/A | |
| Tube | Corning | 430052 | |
| Tweezers | DR Instruments | N/A | Microdissection Forceps Set |
References
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