Summary
I denne protokol udviklede vi en kationisk nanoemulsionsindkapslet retinsyre (RA), der skal bruges som adjuvans til at fremme antigenspecifikke systemiske og slimhinderesponser. Ved at tilføje den FDA-godkendte RA til nanoemulsionen blev antigenspecifik sIgA fremmet i vagina og tyndtarm efter intramuskulær injektion af nanoemulsionen.
Abstract
Kationiske nanostrukturer er opstået som et adjuvans- og antigenleveringssystem, der forbedrer dendritisk cellemodning, ROS-generering og antigenoptagelse og derefter fremmer antigenspecifikke immunresponser. I de senere år har retinsyre (RA) fået stigende opmærksomhed på grund af dens virkning ved aktivering af slimhindeimmunresponset; For at anvende RA som slimhindeadjuvans er det imidlertid nødvendigt at løse problemet med dets opløsning, indlæsning og levering. Her beskriver vi et kationisk nanoemulsionsindkapslet retinsyre (CNE-RA) leveringssystem sammensat af det kationiske lipid 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOTAP), retinsyre, squalen som oliefase, polysorbat 80 som overfladeaktivt middel og sorbitantrioleat 85 som co-overfladeaktivt middel. Dens fysiske og kemiske egenskaber blev karakteriseret ved hjælp af dynamisk lysspredning og et spektrofotometer. Immunisering af mus med blandingen af antigen (ovalbumin, OVA) og CNE-RA forhøjede signifikant niveauerne af anti-OVA sekretorisk immunglobulin A (sIgA) i vaginal skyllevæske og tyndtarmens skyllevæske hos mus sammenlignet med OVA alene. Denne protokol beskriver en detaljeret metode til forberedelse, karakterisering og evaluering af den adjuvanseffekt af CNE-RA.
Introduction
Adjuvanser bruges ofte til at forbedre effektiviteten af en vaccine ved at stimulere immunsystemet til at reagere stærkere på vaccinen og derved øge immuniteten over for et bestemt patogen1. Nanoemulsion (NE) adjuvans refererer til et kolloidt dispersionssystem med termodynamisk stabilitet ved at emulgere en vis andel af oliefase og vandig fase for at producere en emulsion i form af vand-i-olie (W / O) eller olie-i-vand (O / W) 2. O / W nanoemulsionsadjuvans kan producere cytokiner og kemokiner på injektionsstedet, inducere hurtig aggregering og proliferation af vigtige immunceller såsom monocytter, neutrofiler og eosinofiler og forbedre immunresponset og forbedre immunogeniciteten af antigener3. I øjeblikket er tre nanoemulsionsadjuvanser (MF59, AS03 og AF03) blevet licenseret til brug i vacciner og har vist god sikkerhed og effektivitet4.
Imidlertid er slimhindeimmunitet blevet dårligt behandlet af de aktuelt godkendte adjuvansformuleringer i konventionel parenteral vaccination5. Retinsyre (RA) er blevet rapporteret at inducere intestinal homing af immunceller, men dens lave polaritet, dårlig opløselighed i vand og dårligt lys og termisk stabilitet begrænser dets anvendelse til robust enterisk vaccination. Nanoemulsioner giver mulighed for at øge biotilgængeligheden af stærkt lipofile lægemidler, og oliekernen i O / W-emulsionsadjuvanser er egnet til opløsning af ikke-polære stoffer såsom RA6. Derfor kan nanoemulsioner anvendes som bærere for RA for at opnå den dobbelte responseffekt af systemisk immunitet og slimhindeimmunitet.
Sammenlignet med neutrale eller anioniske leveringssystemer har kationiske leveringssystemer relativt effektive antigenindkapslings- og leveringskapaciteter, hvilket kan forbedre immunogeniciteten af antigener 7,8,9. Den kationiske overfladeladning af en række adjuvanssystemer er vigtig for deres adjuvansvirkninger 10,11,12. Den kationiske ladning er en vigtig faktor i forlængelse af vaccineretention på injektionsstedet, øget antigenpræsentation og forlængelse af stimuleringen af cellulær immunitet i kroppen12.
Baseret på ovenstående overvejelser udviklede vi en kationisk nanoemulsion til effektivt at levere RA og antigener. Partikelstørrelsen og zetapotentialet for nanoemulsionen blev bestemt ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS), og nanoemulsionens systemiske og slimhindeimmunrespons kombineret med OVA blev evalueret ved intramuskulær injektion13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøgene blev udført i overensstemmelse med vejledningen til brug og pleje af forsøgsdyr og godkendt af laboratoriedyrs velfærds- og etiske komité ved det tredje militære medicinske universitet.
1. Fremstilling af nanoemulsioner (NE'er)
- Til fremstilling af vandig fase opløses 0,15 g polysorbat 80 i 28,2 ml phosphatbufret saltvand (PBS) under omrøring ved 40 °C.
- Til oliefaseforberedelse anvendes oliefaseformuleringen af nanoemulsionen vist i tabel 1. Sornitantrileatet 85, DOTAP og RA opløses i squalen under omrøring ved 40 °C.
- Til primær O/W-emulsionspræparation omrøres oliefasen magnetisk ved 1400 omdr./min., mens den vandige tilsættes langsomt og dråbevis med en hastighed på 1 ml/min. Foremulgerer blandingen ved hjælp af en højforskydningsemulgator ved 30.000 omdr./min. i 6 min.
- Til højtrykshomogenisering (HPH) behandles den primære O / W-emulsion fremstillet ovenfor med en højtrykshomogenisator i 12 cyklusser ved 900 bar for at opnå en homogen nanoemulsion i området 160-190 nm.
- Ved afslutningen af processen opsamles emulsionen i en 50 ml kolbe og filtrer-steriliserer emulsionen gennem en 0,2 μm PES-filtermembran.
- Tilslut kolben til Schlenk Line gennem kateteret, drej trevejs stophanen for at forbinde systemet til vakuumrøret, og tænd vakuumpumpen for at skabe vakuum i kolben. Drej derefter trevejs stophanen, tilslut systemet til Argon-røret og fyld det med Argon. Gentag dette trin 3x for at sikre, at kolben er fyldt med Argon.
- Kork og forsegling erstattes med en paraffinfilm, kolben pakkes ind i stanniol og opbevares ved 4 °C.
2. Karakterisering af nanoemulsionerne
- Partikelstørrelse og detektion af zetapotentiale
- Tænd for instrumentet, og vent 30 minutter på, at laserlyskilden stabiliseres.
- NE fortyndes 50 gange med ultrarent vand, og der tilsættes 1 ml prøve til den tilsvarende prøvecelle.
- For at måle partikelstørrelsen skal du indstille temperaturen til 25 °C, vælge vand som dispergeringsmedium og vælge engangsplastskåle som målecelle. Læg prøverne i, og mål automatisk. Angiv middelværdien af tre gentagne målinger for hver prøve som det endelige resultat.
- Til måling af zetapotentiale indstilles temperaturen til 25 °C. På grund af valget af den vandige fase som dispersionsmedium skal du vælge Smoluchowsi-modellen og den foldede kapillærcelle som målecelle. Læg prøverne i, og mål automatisk. Angiv gennemsnittet af tre replikate målinger for hver prøve som det endelige resultat.
- Bestemmelse af indkapslingshastighed og lægemiddelbelastningshastighed
- For at bestemme mængden af RA indlæst i NE skal du bruge absolut ethanol til at demulgere og ekstrahere RA fra NE. Til 5 μl prøve tilsættes 995 μl ethanol, og RA-indholdet i opløsningen bestemmes ved hjælp af et spektrofotometer ved 355 nm. Absorbansen sammenlignes med en standardkurve. Brug følgende ligning:
Indkapsling = faktisk RA-belastning / vægt af tilsat lægemiddel
Lægemiddelbelastningshastighed = faktisk RA-indlæsning / prøvekvalitet
- For at bestemme mængden af RA indlæst i NE skal du bruge absolut ethanol til at demulgere og ekstrahere RA fra NE. Til 5 μl prøve tilsættes 995 μl ethanol, og RA-indholdet i opløsningen bestemmes ved hjælp af et spektrofotometer ved 355 nm. Absorbansen sammenlignes med en standardkurve. Brug følgende ligning:
3. Immuniseringsprocedurer og prøveindsamling
- Immuniseringsprocedure og gruppering
- Gruppe kvindelige Balb / C-mus i alderen 6-8 uger og vejer ca. 18-21 g i sæt af 5 til immunisering på dag 0, dag 14, dag 28 i henhold til følgende eksperimentelle grupper: (1) PBS-gruppe, (2) ovalbumin (OVA) gruppe, (3) OVA + NE-RA (OVA / NE-RA) gruppe, (4) OVA + CNE-RA (OVA / CNE-RA) gruppe.
- Alle mus immuniseres ved intramuskulær injektion i de øvre quadriceps muskler med 200 μL forskellige vaccineformuleringer: 100 μL emulsion og 15 μg OVA absorberet i 100 μL PBS, blandet før administration. Injicer 100 μL/bagben. For mus i kontrolgruppen administreres PBS alene.
- Eutanasi: Aflive alle mus ved en intraperitoneal injektion af 100 mg / kg 1% natriumpentobarbital 2 uger efter afslutningen af de tre immuniseringer.
- Prøveindsamling og behandling: Efter eutanasi skal du bruge en saks til at skære musens bryst op og indsætte en sprøjte direkte i hjertet for at aspirere ca. 0,5 ml fuldblod. Blodet henstår i 2 timer ved stuetemperatur og centrifugeres derefter ved 1800 x g i 5 minutter ved 4 °C. Serum, delprøve opsamles og opbevares ved -80 °C til yderligere analyse.
- Saml fuldblod, milt, vaginal skyllevæske (VLF), bronchoalveolær skyllevæske (BALF), nasal skyllevæske (NLF) og tyndtarmsskylningsvæske (SILF).
- Isolering af miltlymfocytter
- Blødgør mus i ethanol 75% (v / v) For en kort sterilisering overføres musene til en ren bænk. Skær huden på venstre mave med en saks, udsæt og fjern milten.
- Milten anbringes i en petriskål indeholdende 3 ml PBS, formales og filtreres i et 15 ml centrifugeglas ved hjælp af en sigte (200 maske, 70 μm) og slibestang.
- Centrifuger cellerne ved 650 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, bundfaldet suspenderes med 3 ml natriumcellelyseopløsning, og der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Tilsæt 10 ml PBS til røret og ryst godt for at afslutte reaktionen, centrifuger det derefter ved 650 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 10 ml PBS, og der tilsættes 20 μL af cellefortyndingen til den automatiske celletæller til celletælling.
- Centrifuger cellerne ved 650 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og cellerne fortyndes til 1 x 106 celler/ml med 1640 helsubstrat (1 % penicillin-streptomycin, 10 % føtalt bovint serum).
- VLF-opsamling: Vagina skylles 4x med 75 μL 1% BSA/PBST, blandingen af skylleopløsningen og opsamles i 1,5 ml centrifugeglas, centrifugeres ved 5000 x g ved 4 °C i 20 minutter og supernatanten opsamles med en pipette og opbevares ved -80 °C.
- BALF og NLF kollektion
- Desinficer musene efter ofring med 75% (v/v) ethanol. Hold musens mave op og ret nakken. Brug saks til at lave et langsgående snit i huden på musehalsen og brug tang til at adskille musklerne og udsætte luftrøret tilstrækkeligt.
- Luftrøret skæres gennem en lille tværgående åbning, og slangen føres ind mod lungerne, sprøjten sættes på slangen og injiceres 0,5 ml PBS i lungerne, og optrækkes, skylles 3x gentagne gange og centrifugeres ved 650 x g ved 4 °C i 5 minutter, supernatanten (BALF) opbevares ved -80 °C.
- Vend slangen til næsehulen, fastgør sprøjten til slangen og injicer 0,5 ml PBS, væsken strømmer gennem næsehulen ind i 1,5 ml centrifugerøret. Opsug vasken fra centrifugeglasset, gentag skylningen 2x, centrifuger derefter ved 650 x g ved 4 °C i 5 minutter, og opbevar supernatanten (NLF) ved -80 °C.
- SILF kollektion
- Forbered PBS-opløsning indeholdende 0,1 mg/ml trypsinhæmmer, 50 mM/L EDTA-2Na, 1 mM/l phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) som tyndtarmens skylleopløsning. Der omrøres ved stuetemperatur for at opløses og opbevares ved 4 °C.
- Skær tyndtarmen åben langs tarmrøret og nedsænk i 3 ml tyndtarmsskylningsvæske. Bland ved lodret omrystning ved 15 o/min i 30 minutter ved 4 °C. Supernatanten centrifugeres ved 1440 x g ved 4 °C i 20 minutter, og supernatanten opsamles med en pipette, hvorefter der centrifugeres ved 5000 x g ved 4 °C i 20 minutter. Supernatanten (SILF) opbevares ved -80 °C.
4. Evaluering af OVA-specifikt antistofrespons efter intramuskulær administration
- Bestem serumniveauer af IgG, underklasser af IgG1, IgG2a og niveauerne af specifik sIgA i VLF, BALF, NLF og SILF ved enzymbundet immunosorbentassay (ELISA).
- Til antigenbelægning fortyndes OVA til 5 μg/ml med coatingbuffer og ELISA-plader med 96 huller natten over ved 4 °C med 100 μL OVA-opløsning pr. hul.
- ELISAPLADER 5x vaskes med PBST og blokeres ved inkubation med 250 μL 1 % BSA/PBST ved 37 °C i 2 timer.
- ELISA-pladerne vaskes 5x med PBST, derefter tilsættes 100 μL af den fortyndede prøve som beskrevet nedenfor for at blive testet, og der inkuberes ved 37 °C i 1 time. Fortyndet serum, VLF, BALF, NLF med 0,5% BSA/PBST, fortynd SILF med 20% føtalt kalveserum (FCS)/PBST.
- Start med at fortynde serum 1000x ved hjælp af en totrins fortyndingsprocedure: Fortynd 20 μL serum til 1 ml, fortynd derefter 25 μL af dette fortyndede serum til 500 μL. Brug denne fortynding af serum til påvisning af IgG1, IgG2a.
- Der tilsættes 200 μL serum fortyndet 1000x til den første række af den coatede plade, og der tilsættes 100 μL 0,5 % BSA/PBST til alle huller undtagen den første række. Overfør 100 μL fra første til anden række og bland 10x med pipetten. Dette trin gentages op til række 8, og der kasseres 100 μL væske, idet serumet med forskellige koncentrationer er opnået til påvisning af IgG.
- Udfør en 1:1 fortynding af BALF, NLF og SILF for at detektere IgA. Brug samme fortyndingsprocedure for VLF som for serum.
- Vask ELISA-plader 5x med PBST. Der tilsættes 100 μL HRP-konjugeret ged-antimus IgG/IgG1/IgG2a/IgA (fortyndet 1:10000 med PBST) til de relevante huller og inkuberes ved 37 °C i 40 minutter.
- Vask ELISA-plader 5x med PBST, tilsæt 100 μL TMB ELISA-substrat (meget følsomt), og overfør pladen til et sted, der er beskyttet mod lys i 5 minutter. Der tilsættes straks 100 μL 450 nm stopopløsning til TMB-substrat for at stoppe reaktionen.
- Absorbansen (OD) måles ved 450 nm for hvert hul, og antistoftiteren beregnes ved at anvende 2,1 gange serumværdien for blindmusen som positiv responsværdi.
5. ELISpot-analyse
- Følg retningslinjerne for ELISpot Plus, brug Mouse IFN-γ (ALP) fra sættet til at udføre analyserne.
- Fjern pladen fra den forseglede emballage og vask 4x med steril PBS (200 μL/hul). Pladen konditioneres med 1640 hele substratet (200 μL/hul) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Substratet fjernes, og den justerede koncentration af lymfocytsuspension fremstillet i trin 3.2.2 (100 μL/hul) tilsættes pladen, hvorefter der tilsættes 100 μL stimulus, dvs. 1640 komplet substrat indeholdende 20 μg/ml OVA257~264 eller OVA323~339 eller 1640 komplet medium. Pladen anbringes i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 i 48 timer. Pak pladen ind med aluminiumsfolie for at undgå fordampning.
- Kassér celleopslæmningen, og vask pladen 5x med PBS (200 μL/hul). Detektionsantistoffet (R4-6A2-biotin) fortyndes til 1 μg/ml i PBS indeholdende 0,5 % føtalt kalveserum (PBS-0,5 % FCS). Der tilsættes 100 μL/hul og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vaskeplade som i trin 5.2. Fortynd streptavidin-ALP (1:1000) i PBS-0,5%FCS og tilsæt 100 μL/hul, inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
- Vaskeplade som i trin 5.2. Den brugsklare substratopløsning (BCIP/NBT-plus) filtreres gennem et 0,45 μm filter, og der tilsættes 100 μL/hul. Udvikl indtil forskellige pletter dukker op.
- Stop farveudviklingen ved at vaske grundigt i postevand, fjern den bløde plast og lad pladen tørre.
- Undersøg og tæl pletter i en ELISpot-læser.
6. Statistisk analyse
- Analyser forskellene mellem data fra 4 grupper ved envejs ANOVA efterfulgt af Tukey multiple sammenligning efter test. Alle resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SD. P-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I alt blev fire nanoemulsionsformuleringer fremstillet og karakteriseret ved deres partikelstørrelse (figur 1), deres zetapotentiale og deres indkapslingseffektivitet som vist i tabel 2. Partikelstørrelsen var koncentreret omkring 160-190nm, og tilsætningen af DOTAP vendte Zeta-potentialet for nanoemulsion. OVA-specifikt serum IgG og dets undergruppe antistofniveau i serum blev påvist 2 uger efter tredje immunisering. Nanoemulsionsadjuvansvaccinen øgede signifikant de OVA-specifikke IgG-, IgG1- og IgG 2a-antistoftitere i serum (figur 2). Endnu vigtigere var det, at niveauerne af specifik sIgA i vaginal skyllevæske og tyndtarmsskylningsvæske blev signifikant forbedret, når OVA blev adjuveret med CNE-RA (figur 3). I ELISpot-analysen blev der ikke fundet signifikante pletter.
Figur 1: Størrelse, diameter og fordeling. (A) Størrelse, diameter og fordeling af NE-RA. B) CNE-RA's størrelse, diameter og fordeling. d.nm er partiklernes gennemsnitlige diameter i nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: OVA-specifikt serum IgG og dets undergruppe antistofniveauer i serum. OVA-specifikt serum IgG og dets undergruppeantistofniveauer i serum 2 uger efter, at de tre immuniseringer blev afsluttet. (A) Log2-værdien af IgG-titerne. B) IgG1 optisk massefylde ved 450 nm. C) IgG2a optisk densitet ved 450 nm. Data udtrykkes som gennemsnit ± SD (n = 5), ***: P<0,001. Sammenligninger af forskellene mellem grupperne og PBS-gruppen vises direkte over kolonnerne i figuren og er angivet som følger: ns: ingen betydning, #p<0,05, ###p<0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: OVA-specifik sIgA. OVA-specifik sIgA i vaginal skyllevæske, bronchoalveolær skyllevæske, nasal skylningsvæske, tyndtarmsskylningsvæske. (A) Vaginal skylningsvæske, (B) bronchoalveolær skyllevæske, (C) nasal skylningsvæske og (D) tyndtarmsskylningsvæske. Data udtrykkes som gennemsnit ± SD (n = 5), ns: ingen signifikans, * p<0,05; s<0.001. Sammenligninger af forskellene mellem grupperne og PBS-gruppen vises direkte over kolonnerne i figuren og er angivet som følger: ns: ingen betydning, ###p<0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Prøve | Squalen | Sorbitan trioleat 85 | DOTAP | RA |
| NE-RA | 1,5 g | 0,15 g | 0 | 60mg |
| CNE-RA | 1,5 g | 0,15 g | 45mg | 60mg |
Tabel 1: Oliefaseformuleringen af NE'er.
| Prøve | Partikelmiddelstørrelse (nm) | Polydispersitetsindeks | Zeta potentiale (mV) | Indkapslingseffektivitet (%) | Lægemiddelbelastningshastighed (mg / ml) |
| NE-RA | 182.9±3.4 | 0.18±0.02 | -23.0±0.2 | 40 | 0.8 |
| CNE-RA | 162.7±4.2 | 0.16±0.01 | 42.2±0.5 | 40 | 0.8 |
Tabel 2: NØ'ers fysisk-kemiske egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol udviklede vi en kationisk nanoemulsionsindkapslet retinsyre, der skal bruges som adjuvans til at fremme antigenspecifikke systemiske og slimhinderesponser. Sammenlignet med traditionelle NØ-adjuvanser har den følgende to fordele. For det første har overfladen af O / W NE'er generelt en høj negativ ladning, hvilket gør det vanskeligt at indlæse antigener direkte. Kationiske NE'er kan effektivt adsorbere peptid- eller proteinantigener og forbedre den specifikke immunogenicitet. For det andet har erfaringerne med traditionel vaccineforskning vist, at det er vanskeligt at stimulere slimhinderesponsen ved subkutan eller intramuskulær injektion5. Ved at tilføje FDA-godkendt RA til nanoemulsionen 14,15,16 blev OVA-specifik sIgA fremmet i vagina og tyndtarm ved intramuskulær injektion. Denne protokol er ikke valideret i andre antigener undtagen OVA. I fremtidige undersøgelser kan dyremodeller af tarmrelaterede sygdomme bruges til yderligere at evaluere effekten og mekanismen af CNE-RA til forbedring af vaccinebeskyttelsen.
Højtrykshomogenisering, forskydningsblanding og ultralydbehandling er de mest almindelige højenergiemulgeringsmetoder, der anvendes til fremstilling af NE'er, med højtrykshomogenisering, der giver den bedste homogenitet17. Imidlertid kræver højtrykshomogeniseringsmetoder ofte dyrt specialudstyr med høje forberedelsesomkostninger og ikke ubetydelige køleproblemer18. I vores tidligere eksperimenter blev det konstateret, at homogeniseringstrykket og antallet af cyklusser havde en effekt på partikelstørrelsen af NE'er, og inden for et bestemt interval, jo højere homogeniseringstrykket og jo højere antallet af cyklusser, jo mindre havde partikelstørrelsen tendens til at være. Fremstillingen af olie-i-vand-emulsionskolostrum omdanner effektivt olie- og vandfaserne til store dråber og reducerer antallet af homogeniseringscyklusser. Hvis dette trin udelades, kan forøgelse af antallet af homogeniseringscyklusser i sidste ende resultere i nanoemulsioner med samme partikelstørrelse og dispersion. Udskiftning af PBS i den vandige fase med 0,9% saltvand eller natriumcitratbuffer havde ingen effekt på partikelstørrelsen og dispersionen af NE'erne.
Flere kationiske lipider anvendes bredt i vaccinedesign19, DOTAP blev valgt for, at det er godkendt til klinisk brug, viser god sikkerhed og tolereres godt. Overdreven positiv ladning på NØ-overfladen kan føre til cytotoksicitet. Af sikkerhedsmæssige årsager skal typen og mængden af kationiske lipider tages i betragtning ved fremstilling af kationiske NE'er. Andre kationiske lipider, der almindeligvis anvendes i vaccineundersøgelser, er DLin-MC3-DMA ((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraen-19-yl4-(dimethylamino)butanoat)20, DMG-PEG2000 (1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylenglycol-2000), DOTMA (N,N,N-trimethyl-2,3-bis(octadec-9-en-1-yloxy)propan-1-aminiumchlorid)21, DC-chol (3β- [N-(N′,N′-dimethylaminoethan)-carbamoyl]kolesterolhydrochlorid)22, og om de kan anvendes til at forberede kationiske NE'er, skal undersøges nærmere.
I de senere år har RA tiltrukket sig opmærksomhed på grund af dets evne til at inducere immuncelle homing til tarmslimhinden gennem forskellige veje, men RA er ikke kun dårligt vandopløseligt, men også ustabilt for lys og ilt. Under forberedelse og opbevaring af NE'er skal der konstant lægges vægt på beskyttelsen af RA mod lys og ilt. RA vil hurtigt blive oxideret og nedbrudt, når den udsættes for lys og ilt, og til sidst miste sin adjuvansvirkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter i dette arbejde.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af Key Program of Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) og Chinese National Natural Science Foundation Project (nr. 32270988).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
References
- Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O'Hagan, D. T. Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).
- Chen, W. L., et al. Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide. Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).
- Iwasaki, A., Omer, S. B. Why and how vaccines work. Cell. 183 (2), 290-295 (2020).
- Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers. Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. J Cont Release. 252, 28-49 (2017).
- Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines. Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).
- Korsholm, K. S., et al. The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes. Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).
- Agger, E. M., et al. Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements. Plos One. 3 (9), e3116 (2008).
- Slutter, B., et al. Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen. Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).
- Nochi, T., et al. Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines. Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).
- Henriksen-Lacey, M., et al. Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response. J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).
- Zhong, X. F., et al. Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections. Small. 18 (1), e2105530 (2022).
- Mora, J. R., et al. Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells. Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).
- Burger, C., Shahzad, Y., Brümmer, A., Gerber, M., du Plessis, J.
- Lodaya, R. N., et al. Formulation design, optimization and evaluations of an α-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine. J Cont Release. 316, 12-21 (2019).
- Carmona-Ribeiro, A. M., Pérez-Betancourt, Y. Cationic nanostructures for vaccines design. Biomimetics. 5 (3), 32 (2020).
- Lam, K., et al. trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), e2209624 (2023).
- Nie, T. Q., et al. Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1. Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).
- Lou, G., et al. Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection. J Cont Release. 325, 370-379 (2020).
