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Immunology and Infection

Cationic Nanoemulsion-encapsulated रेटिनोइक एसिड OVA- विशिष्ट प्रणालीगत और mucosal प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए एक सहायक के रूप में

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/66270
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हमने एंटीजन-विशिष्ट प्रणालीगत और म्यूकोसल प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए एक सहायक के रूप में उपयोग करने के लिए एक cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid (RA) विकसित किया है। नैनोमल्शन में एफडीए-अनुमोदित आरए जोड़कर, नैनोमल्शन के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के बाद योनि और छोटी आंत में एंटीजन-विशिष्ट एसआईजीए को बढ़ावा दिया गया था।

Abstract

धनायनित नैनोस्ट्रक्चर एक सहायक और एंटीजन वितरण प्रणाली के रूप में उभरा है जो वृक्ष के समान सेल परिपक्वता, आरओएस पीढ़ी और एंटीजन तेज को बढ़ाता है और फिर एंटीजन-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देता है। हाल के वर्षों में, रेटिनोइक एसिड (आरए) ने म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय करने में इसके प्रभाव के कारण बढ़ते ध्यान को प्राप्त किया है; हालांकि, आरए को म्यूकोसल सहायक के रूप में उपयोग करने के लिए, इसके विघटन, लोडिंग और वितरण की समस्या को हल करना आवश्यक है। यहां, हम एक cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid (CNE-RA) वितरण प्रणाली का वर्णन करते हैं जो cationic lipid 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOTAP), रेटिनोइक एसिड, तेल चरण के रूप में स्क्वैलीन, पॉलीसॉर्बेट 80 सर्फैक्टेंट के रूप में, और सॉर्बिटन ट्रायोलेट 85 सह-सर्फेक्टेंट के रूप में। इसके भौतिक और रासायनिक गुणों को गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके चित्रित किया गया था। एंटीजन (ओवलब्यूमिन, ओवीए) और सीएनई-आरए के मिश्रण के साथ चूहों के टीकाकरण ने योनि लैवेज द्रव में एंटी-ओवीए स्रावी इम्युनोग्लोबुलिन ए (एसआईजीए) के स्तर को काफी बढ़ा दिया और अकेले ओवीए की तुलना में चूहों के छोटे आंतों के लैवेज तरल पदार्थ को बढ़ा दिया। यह प्रोटोकॉल सीएनई-आरए के सहायक प्रभाव की तैयारी, लक्षण वर्णन और मूल्यांकन के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है।

Introduction

सहायक दवाओं का उपयोग अक्सर टीके के प्रति अधिक दृढ़ता से प्रतिक्रिया करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली को उत्तेजित करके टीके की प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए किया जाता है, जिससे किसी विशेष रोगज़नक़के प्रति प्रतिरक्षा बढ़ जाती है। नैनोमल्शन (एनई) सहायक जल-में-तेल (डब्ल्यू/ओ) या तेल-इन-वॉटर (ओ/डब्ल्यू)2के रूप में एक पायस का उत्पादन करने के लिए तेल चरण और जलीय चरण के एक निश्चित अनुपात को पायसीकारी करके थर्मोडायनामिक स्थिरता के साथ एक कोलाइडल फैलाव प्रणाली को संदर्भित करता है। ओ / डब्ल्यू नैनोमल्शन सहायक इंजेक्शन स्थल पर साइटोकिन्स और केमोकाइन का उत्पादन कर सकता है, मोनोसाइट्स, न्यूट्रोफिल और ईोसिनोफिल जैसे महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा कोशिकाओं के तेजी से एकत्रीकरण और प्रसार को प्रेरित कर सकता है, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ा सकता है, और एंटीजन 3 की इम्युनोजेनेसिटी में सुधार कर सकताहै। वर्तमान में, तीन नैनोइमल्शन सहायक (एमएफ 59, एएस 03, और एएफ 03) को टीकों में उपयोग के लिए लाइसेंस दिया गया है और उन्होंने अच्छी सुरक्षा और प्रभावकारितादिखाई है।

हालांकि, पारंपरिक पैरेंटेरलटीकाकरण में वर्तमान में लाइसेंस प्राप्त सहायक योगों द्वारा म्यूकोसल प्रतिरक्षा को खराब तरीके से संबोधित किया गया है। रेटिनोइक एसिड (आरए) को प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आंतों की होमिंग को प्रेरित करने के लिए सूचित किया गया है, लेकिन इसकी कम ध्रुवीयता, पानी में खराब घुलनशीलता, और खराब रोशनी और थर्मल स्थिरता मजबूत आंत्र टीकाकरण के लिए इसके उपयोग को सीमित करती है। नैनोमल्शन अत्यधिक लिपोफिलिक दवाओं की जैव उपलब्धता को बढ़ाने के अवसर प्रदान करते हैं, और ओ / डब्ल्यू पायस सहायक का तेल कोर आरए6 जैसे गैर-ध्रुवीय पदार्थों को भंग करने के लिए उपयुक्त है। इसलिए, प्रणालीगत प्रतिरक्षा और म्यूकोसल प्रतिरक्षा के दोहरे प्रतिक्रिया प्रभाव को प्राप्त करने के लिए आरए के लिए वाहक के रूप में नैनोमल्शन का उपयोग किया जा सकता है।

तटस्थ या आयनिक वितरण प्रणालियों की तुलना में, धनायनित वितरण प्रणालियों में अपेक्षाकृत कुशल एंटीजन एनकैप्सुलेशन और वितरण क्षमताएं होती हैं, जो एंटीजन 7,8,9की इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ा सकती हैं। सहायक प्रणालियों की एक किस्म के cationic सतह चार्ज उनके सहायकप्रभाव 10,11,12के लिए महत्वपूर्ण है. cationic चार्ज इंजेक्शन साइट पर टीका प्रतिधारण को लम्बा खींचने, प्रतिजन प्रस्तुति में वृद्धि और शरीर12 में सेलुलर प्रतिरक्षा की उत्तेजना को लम्बा खींचने में एक महत्वपूर्ण कारक है.

उपरोक्त विचारों के आधार पर, हमने आरए और एंटीजन को प्रभावी ढंग से सह-वितरित करने के लिए एक धनायनित नैनोमल्शन विकसित किया। नैनोमल्शन के कण आकार और जीटा क्षमता को गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, और ओवीए के साथ संयुक्त नैनोमल्शन की प्रणालीगत और म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन13 द्वारा किया गया था।

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Protocol

पशु प्रयोगों को प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग और देखभाल के लिए गाइड के अनुसार किया गया था और तीसरे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय की प्रयोगशाला पशु कल्याण और आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. नैनोमल्शन (एनई) की तैयारी

  1. जलीय चरण की तैयारी के लिए, 40 डिग्री सेल्सियस पर सरगर्मी करते हुए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 28.2 एमएल में पॉलीसॉर्बेट 80 के 0.15 ग्राम को भंग करें।
  2. तेल चरण की तैयारी के लिए, तालिका 1में दिखाए गए नैनोमल्शन के तेल चरण निर्माण का उपयोग करें। 40 डिग्री सेल्सियस पर सरगर्मी करते हुए स्क्वेलिन में सोर्निटन ट्राइलेट 85, डोटाप और आरए को भंग करें।
  3. प्राथमिक ओ/डब्ल्यू पायस की तैयारी के लिए, तेल चरण को चुंबकीय रूप से 1400 आरपीएम पर हिलाएं, जबकि जलीय धीरे-धीरे और ड्रॉपवाइज को 1 एमएल/मिनट की दर से जोड़ें। 6 मिन के लिए 30,000 आरपीएम पर एक उच्च कतरनी पायसीकारी का उपयोग करके मिश्रण को पूर्व-पायसीकारी करें।
  4. उच्च दबाव homogenization (एचपीएच) के लिए, 160-190 एनएम रेंज में एक सजातीय नैनो पायस प्राप्त करने के लिए 900 बार पर 12 चक्र के लिए एक उच्च दबाव homogenizer के साथ ऊपर तैयार प्राथमिक ओ / डब्ल्यू पायस का इलाज.
  5. प्रक्रिया के अंत में, 50 एमएल फ्लास्क में पायस इकट्ठा करें और 0.2 माइक्रोन पीईएस फिल्टर झिल्ली के माध्यम से पायस को फिल्टर-स्टरलाइज़ करें।
  6. कैथेटर के माध्यम से श्लेंक लाइन के लिए फ्लास्क कनेक्ट करें, वैक्यूम ट्यूब के लिए सिस्टम को जोड़ने के लिए तीन तरह से स्टॉपकॉक घूर्णन और फ्लास्क में वैक्यूम बनाने के लिए वैक्यूम पंप चालू करें। फिर, तीन-तरफा स्टॉपकॉक को घुमाते हुए, सिस्टम को आर्गन ट्यूब से कनेक्ट करें और इसे आर्गन से भरें। फ्लास्क आर्गन के साथ भरा है सुनिश्चित करने के लिए इस कदम 3x दोहराएँ.
  7. कॉर्क को बदलें और पैराफिन फिल्म के साथ सील करें, फ्लास्क को टिन की पन्नी में लपेटें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. नैनोमल्शन की विशेषता

  1. कण आकार और जीटा संभावित पहचान
    1. उपकरण पर स्विच करें और लेजर प्रकाश स्रोत को स्थिर करने के लिए 30 मिनट प्रतीक्षा करें।
    2. अल्ट्राप्योर पानी के साथ एनई 50 गुना पतला करें और इसी नमूना सेल में नमूना के 1 एमएल जोड़ें।
    3. कण आकार को मापने के लिए, तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, फैलाने वाले माध्यम के रूप में पानी का चयन करें, और मापने वाले सेल के रूप में डिस्पोजेबल प्लास्टिक व्यंजन का चयन करें। नमूने लोड करें और स्वचालित रूप से मापें। अंतिम परिणाम के रूप में प्रत्येक नमूने के लिए तीन दोहराया माप के औसत मूल्य की रिपोर्ट करें।
    4. जीटा क्षमता की माप के लिए, तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। फैलाव माध्यम के रूप में जलीय चरण की पसंद के कारण, स्मोलुचोसी मॉडल और मापने वाले सेल के रूप में मुड़ा हुआ केशिका सेल का चयन करें। नमूने लोड करें और स्वचालित रूप से मापें। अंतिम परिणाम के रूप में प्रत्येक नमूने के लिए तीन प्रतिकृति मापों के माध्य की रिपोर्ट करें।
  2. एनकैप्सुलेशन दर और दवा लोडिंग दर का निर्धारण
    1. एनई में लोड आरए की मात्रा निर्धारित करने के लिए, एनई से आरए को डीमल्सीफाई करने और निकालने के लिए पूर्ण इथेनॉल का उपयोग करें। नमूना के 5 माइक्रोन के लिए, इथेनॉल के 995 माइक्रोन जोड़ें और 355 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके समाधान की आरए सामग्री निर्धारित करें। अवशोषण की तुलना एक मानक वक्र से करें। निम्न समीकरण का उपयोग करें:
      एनकैप्सुलेशन = वास्तविक आरए लोड/जोड़ा गया दवा का वजन
      दवा लोडिंग दर = वास्तविक आरए लोडिंग/नमूना की गुणवत्ता

3. टीकाकरण प्रक्रिया और नमूना संग्रह

  1. टीकाकरण प्रक्रिया और समूहीकरण
    1. समूह मादा बाल्ब/सी चूहों की आयु 6-8 सप्ताह और निम्नलिखित प्रयोगात्मक समूहों के अनुसार दिन 0, दिन 14, दिन 28 पर टीकाकरण के लिए 5 के सेट में लगभग 18-21 ग्राम वजन: (1) पीबीएस समूह, (2) ओवलब्यूमिन (ओवीए) समूह, (3) ओवीए + एनई-आरए (ओवीए / एनई-आरए) समूह, (4) ओवीए + सीएनई-आरए (ओवीए / सीएनई-आरए) समूह।
    2. विभिन्न टीका योगों के 200 माइक्रोन के साथ ऊपरी क्वाड्रिसेप्स मांसपेशियों में इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा सभी चूहों का टीकाकरण करें: पायस के 100 माइक्रोन और पीबीएस के 100 माइक्रोन में अवशोषित 15 माइक्रोग्राम ओवीए, प्रशासन से पहले मिश्रित। 100 माइक्रोन/हिंद पैर इंजेक्ट करें। नियंत्रण समूह में चूहों के लिए अकेले पीबीएस प्रशासन.
    3. इच्छामृत्यु: तीन टीकाकरण के पूरा होने के 2 सप्ताह बाद 1% सोडियम पेंटोबार्बिटल के 100 मिलीग्राम/किग्रा के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा सभी चूहों को इच्छामृत्यु दें।
    4. नमूना संग्रह और प्रसंस्करण: इच्छामृत्यु के बाद, चूहों की छाती को खोलने के लिए कैंची का उपयोग करें और पूरे रक्त के लगभग 0.5 एमएल महाप्राण करने के लिए सीधे दिल में एक सिरिंज डालें। रक्त को कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए खड़े होने दें और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 1800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। आगे के विश्लेषण के लिए सीरम, विभाज्य और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर लीजिए।
    5. पूरे रक्त, प्लीहा, योनि लैवेज द्रव (वीएलएफ), ब्रोन्कोएलेवोलर लैवेज द्रव (बीएएलएफ), नाक से पानी से धोना द्रव (एनएलएफ), और छोटी आंतों के लैवेज द्रव (एसआईएलएफ) को इकट्ठा करें।
  2. प्लीहा लिम्फोसाइटों का अलगाव
    1. एक संक्षिप्त नसबंदी के लिए इथेनॉल 75% (वी / वी) में चूहों को भिगोएँ, चूहों को एक साफ बेंच पर स्थानांतरित करें। कैंची के साथ बाएं पेट पर त्वचा को काटें, प्लीहा को उजागर करें और हटा दें।
    2. प्लीहा को पीबीएस के 3 एमएल युक्त पेट्री डिश में रखें, एक छलनी (200 जाल, 70 माइक्रोन) और पीसने वाली छड़ का उपयोग करके 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में पीसें और फ़िल्टर करें।
    3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 650 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और लाल रक्त कोशिका lysis समाधान के 3 एमएल के साथ अवक्षेप निलंबित, 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    4. ट्यूब में पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें और प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए अच्छी तरह से हिलाएं, फिर इसे कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 650 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
    5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, सेल गिनती के लिए स्वचालित सेल काउंटर में सेल कमजोर पड़ने के 20 माइक्रोन जोड़ें।
    6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 650 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और कोशिकाओं को 1640 पूर्ण माध्यम (1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम) के साथ 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल तक पतला करें।
  3. वीएलएफ संग्रह: 1% बीएसए/पीबीएसटी के 75 माइक्रोन के साथ योनि 4x कुल्ला, लैवेज समाधान को मिलाएं और 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में इकट्ठा करें, 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और -80 डिग्री सेल्सियस पर एक विंदुक और स्टोर के साथ सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें।
  4. BALF और NLF संग्रह
    1. 75% (वी / वी) इथेनॉल के साथ बलिदान के बाद चूहों कीटाणुरहित. माउस पेट को पकड़ो और गर्दन को सीधा करें। माउस गर्दन की त्वचा में एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाने के लिए कैंची का प्रयोग करें और मांसपेशियों को अलग करने और श्वासनली को पर्याप्त रूप से बेनकाब करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
    2. एक छोटे से अनुप्रस्थ उद्घाटन के माध्यम से श्वासनली काटें और फेफड़ों की ओर नली डालें, नली को सिरिंज संलग्न करें और फेफड़ों में पीबीएस के 0.5 एमएल इंजेक्ट करें और वापस ले लें, 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 650 x x और अपकेंद्रित्र पर 3x और अपकेंद्रित्र दोहराएं, -80 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला (बीएएलएफ) स्टोर करें।
    3. नाक गुहा के लिए नली रिवर्स, नली के लिए सिरिंज संलग्न और पीबीएस के 0.5 एमएल इंजेक्षन, तरल 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में नाक गुहा के माध्यम से प्रवाह होगा. अपकेंद्रित्र ट्यूब से धोने को महाप्राण करें और कुल्ला 2x दोहराएं, फिर 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 650 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, -80 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला (एनएलएफ) स्टोर करें।
  5. सिल्फ संग्रह
    1. छोटी आंत लैवेज समाधान के रूप में 0.1 मिलीग्राम / एमएल ट्रिप्सिन अवरोधक, 50 एमएम / एल ईडीटीए -2 एनए, 1 एमएम / एल फेनिलमिथाइलसल्फोनील फ्लोराइड (पीएमएसएफ) युक्त पीबीएस समाधान तैयार करें। भंग करने के लिए कमरे के तापमान पर हिलाओ और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. आंत्र ट्यूब के साथ खुली छोटी आंत में कटौती और छोटे आंतों lavage तरल पदार्थ के 3 एमएल में विसर्जित. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15 आरपीएम पर ऊर्ध्वाधर मिलाते हुए मिलाएं। 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1440 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा, तो 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला (एसआईएलएफ) -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. इंट्रामस्क्युलर प्रशासन के बाद ओवीए-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन

  1. आईजीजी के सीरम स्तर, आईजीजी 1, आईजीजी 2 ए के उपवर्ग और एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) द्वारा वीएलएफ, बीएएलएफ, एनएलएफ और एसआईएलएफ में विशिष्ट एसआईजीए के स्तर का निर्धारण करें।
  2. एंटीजन कोटिंग के लिए, कोटिंग बफर के साथ ओवीए को 5 माइक्रोग्राम/एमएल तक पतला करें, और प्रति अच्छी तरह से ओवीए समाधान के 100 माइक्रोन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 96-अच्छी तरह से एलिसा प्लेटों को कोट करें।
  3. पीबीएसटी के साथ एलिसा प्लेटों को 5x धोएं और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1% बीएसए/पीबीएसटी के 250 माइक्रोन के साथ इनक्यूबेशन द्वारा ब्लॉक करें।
  4. पीबीएसटी के साथ एलिसा प्लेटों को 5x धोएं, फिर परीक्षण किए जाने के लिए नीचे वर्णित नमूने के 100 माइक्रोन को पतला करें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 0.5% बीएसए/पीबीएसटी के साथ सीरम, वीएलएफ, बीएएलएफ, एनएलएफ को पतला करें, 20% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस)/पीबीएसटी के साथ पतला करें।
    1. दो-चरण कमजोर पड़ने की प्रक्रिया का उपयोग करके सीरम 1000x को पतला करके शुरू करें: सीरम के 20 माइक्रोन को 1 एमएल तक पतला करें, फिर इस पतला सीरम के 25 माइक्रोन को 500 माइक्रोन तक पतला करें। आईजीजी 1, आईजीजी 2 ए का पता लगाने के लिए सीरम के इस कमजोर पड़ने का उपयोग करें।
  5. लेपित प्लेट की पहली पंक्ति में 1000x पर पतला सीरम के 200 माइक्रोन जोड़ें और पहली पंक्ति को छोड़कर सभी कुओं में 0.5% बीएसए/पीबीएसटी के 100 माइक्रोन जोड़ें। पहली पंक्ति से दूसरी पंक्ति में 100 माइक्रोन स्थानांतरित करें और विंदुक के साथ 10x मिलाएं। इस चरण को पंक्ति 8 तक दोहराएं और तरल के 100 माइक्रोन को त्यागें, आईजीजी का पता लगाने के लिए विभिन्न सांद्रता का सीरम प्राप्त किया गया है।
  6. IgA का पता लगाने के लिए BALF, NLF और SILF का 1:1 कमजोर पड़ना करें। वीएलएफ के लिए सीरम के समान कमजोर पड़ने की प्रक्रिया का उपयोग करें।
  7. एलिसा प्लेटों को पीबीएसटी के साथ 5x धोएं। एचआरपी-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस IgG/IgG1/IgG2a/IgA (PBST के साथ पतला 1:10000) के 100 माइक्रोन को उपयुक्त कुओं में जोड़ें और 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. पीबीएसटी के साथ एलिसा प्लेटें 5x धोएं, टीएमबी एलिसा सब्सट्रेट (अत्यधिक संवेदनशील) के 100 माइक्रोन जोड़ें, और प्लेट को 5 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित जगह पर स्थानांतरित करें। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए टीएमबी सब्सट्रेट के लिए तुरंत 450 एनएम स्टॉप समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए 450 एनएम पर अवशोषण (आयुध डिपो) को मापें और सकारात्मक प्रतिक्रिया मूल्य के रूप में रिक्त समूह माउस के सीरम मूल्य के 2.1 गुना लेकर एंटीबॉडी टिटर की गणना करें।

5. एलिसपॉट परख

  1. एलिस्पॉट प्लस के लिए दिशानिर्देशों का पालन करें, परख करने के लिए किट से माउस IFN-γ (ALP) का उपयोग करें।
  2. सीलबंद पैकेज से प्लेट निकालें और बाँझ पीबीएस (200 माइक्रोन/अच्छी तरह से) के साथ 4x धो लें। 1640 पूर्ण मध्यम (200 माइक्रोन/अच्छी तरह से) के साथ प्लेट हालत और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. माध्यम निकालें और प्लेट में चरण 3.2.2 (100 माइक्रोन/अच्छी तरह से) में तैयार लिम्फोसाइट निलंबन की समायोजित एकाग्रता जोड़ें, फिर उत्तेजना के 100 माइक्रोन यानी 1640 पूर्ण माध्यम जिसमें 20 माइक्रोग्राम/एमएल ओवीए257 ~ 264 या ओवीए 323 ~ 339 या 1640 पूर्ण माध्यम जोड़ें। प्लेट को 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में रखें। वाष्पीकरण से बचने के लिए प्लेट को एल्युमिनियम फॉयल से लपेटें।
  4. सेल निलंबन त्यागें और पीबीएस (200 माइक्रोन/अच्छी तरह से) के साथ प्लेट 5x धो लें। पीबीएस में 0.5% भ्रूण बछड़ा सीरम (पीबीएस-0.5% एफसीएस) युक्त 1 माइक्रोग्राम/एमएल का पता लगाने एंटीबॉडी (आर 4-6 ए 2-बायोटिन) को पतला करें। 100 माइक्रोन/अच्छी तरह से जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. चरण 5.2 के रूप में प्लेट धो लें। पीबीएस-0.5% एफसीएस में स्ट्रेप्टाविडिन-एएलपी (1:1000) पतला करें और 100 माइक्रोन/अच्छी तरह से जोड़ें, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. चरण 5.2 के रूप में प्लेट धो लें। 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से उपयोग के लिए तैयार सब्सट्रेट समाधान (बीसीआईपी / एनबीटी-प्लस) को फ़िल्टर करें और 100 माइक्रोन / अच्छी तरह से जोड़ें। अलग-अलग धब्बे उभरने तक विकसित करें।
  7. नल के पानी में बड़े पैमाने पर धोकर रंग विकास को रोकें, नरम प्लास्टिक को हटा दें और प्लेट को सूखने के लिए छोड़ दें।
  8. एलिसपॉट रीडर में स्पॉट का निरीक्षण और गणना करें।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. एक तरह से एनोवा द्वारा 4 समूहों के डेटा के बीच अंतर का विश्लेषण टुकी एकाधिक तुलना के बाद परीक्षण के बाद. सभी परिणामों को एसडी ± माध्य के रूप में व्यक्त करें। 0.05 से कम पी मान को महत्वपूर्ण माना जाता था।

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Representative Results

कुल मिलाकर, चार नैनोमल्शन फॉर्मूलेशन तैयार किए गए थे और उनके कण आकार(चित्रा 1), उनकी जीटा क्षमता और तालिका 2में प्रस्तुत उनकी एनकैप्सुलेशन दक्षता की विशेषता थी। कण आकार 160-190nm के आसपास केंद्रित किया गया था और DOTAP के अलावा nanoemulsion के जीटा क्षमता उलट गया. ओवीए-विशिष्ट सीरम आईजीजी और सीरम में इसके उपसमूह एंटीबॉडी स्तर का पता तीसरे टीकाकरण के 2 सप्ताह बाद लगाया गया था। नैनोमल्शन एडजुवेंट वैक्सीन ने सीरम (चित्रा 2) में ओवीए-विशिष्ट आईजीजी, आईजीजी 1 और आईजीजी 2 ए एंटीबॉडी टाइटर्स में काफी वृद्धि की। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि योनि लैवेज तरल पदार्थ और छोटी आंत के लैवेज तरल पदार्थ में विशिष्ट एसआईजीए के स्तर को काफी बढ़ाया गया था जब ओवीए को सीएनई-आरए(चित्रा 3)के साथ जोड़ा गया था। एलिस्पॉट परख में, कोई महत्वपूर्ण धब्बे नहीं पाए गए।

Figure 1
चित्रा 1: आकार व्यास और वितरण। (ए) आकार व्यास और एनई-आरए का वितरण। (बी) आकार व्यास और सीएनई-आरए का वितरण। D.NM nm में कणों का औसत व्यास है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ओवीए-विशिष्ट सीरम आईजीजी और सीरम में इसके उपसमूह एंटीबॉडी स्तर। ओवीए-विशिष्ट सीरम आईजीजी और सीरम में इसके उपसमूह एंटीबॉडी स्तर 2 सप्ताह बाद तीन टीकाकरण पूरा हो गए थे। (ए) आईजीजी टाइटर्स का लॉग 2 मान। (बी) 450 एनएम पर आईजीजी 1 ऑप्टिकल घनत्व। (सी) आईजीजी2ए ऑप्टिकल घनत्व 450 एनएम पर। डेटा एसडी (एन = 5), ***: पी<0.001 ± माध्य के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। समूहों और पीबीएस समूह के बीच मतभेदों की तुलना सीधे आंकड़े में कॉलम के ऊपर दिखाई जाती है और निम्नानुसार इंगित की जाती है: ns: कोई महत्व नहीं, #p<0.05, ###p<0.001। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ओवीए-विशिष्ट एसआईजीए। योनि लैवेज तरल पदार्थ, ब्रोन्कोएलेवोलर लैवेज द्रव, नाक से लवाज द्रव, छोटी आंतों के लैवेज तरल पदार्थ में ओवीए-विशिष्ट एसआईजीए। (ए) योनि लैवेज तरल पदार्थ, (बी) ब्रोन्कोएलेवोलर लैवेज तरल पदार्थ, (सी) नाक से लैवेज तरल पदार्थ, और (डी) छोटी आंतों की लैवेज तरल पदार्थ। डेटा एसडी (एन = 5) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है, एनएस: कोई महत्व नहीं, * पी < 0.05; पी<0.001. समूहों और पीबीएस समूह के बीच मतभेदों की तुलना सीधे आंकड़े में कॉलम के ऊपर दिखाई जाती है और निम्नानुसार इंगित की जाती है: ns: कोई महत्व नहीं, ###p<0.001। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूना स्क्वैलीन सॉर्बिटन ट्रायोलेट 85 डोटाप रा
एनई-आरए 1.5 ग्राम 0.15 ग्राम 0 60 मिलीग्राम
सीएनई-आरए 1.5 ग्राम 0.15 ग्राम 45 मिलीग्राम 60 मिलीग्राम

तालिका 1: एनई का तेल चरण निर्माण।

नमूना कण मतलब आकार (एनएम) पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स जीटा क्षमता (एमवी) एनकैप्सुलेशन दक्षता (%) दवा लोड हो रहा है दर (मिलीग्राम /
एनई-आरए 182.9±3.4 0.18±0.02 -23.0±0.2 40 0.8
सीएनई-आरए 162.7±4.2 0.16±0.01 42.2±0.5 40 0.8

तालिका 2: एनई की भौतिक रासायनिक विशेषताएं।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हमने एंटीजन-विशिष्ट प्रणालीगत और म्यूकोसल प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए एक सहायक के रूप में उपयोग किए जाने वाले एक cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid विकसित किया। पारंपरिक एनई सहायक की तुलना में, इसके निम्नलिखित दो फायदे हैं। सबसे पहले, सामान्य तौर पर, O/W NEs की सतह पर एक उच्च नकारात्मक चार्ज होता है, जिससे एंटीजन को सीधे लोड करना मुश्किल हो जाता है। धनायनित एनई पेप्टाइड या प्रोटीन एंटीजन को प्रभावी ढंग से सोख सकते हैं और विशिष्ट इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ा सकते हैं। दूसरे, पारंपरिक टीका अनुसंधान में अनुभव से पता चला है कि चमड़े के नीचे या इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन5 द्वारा म्यूकोसल प्रतिक्रिया को उत्तेजित करना मुश्किल है। नैनोमल्शन 14,15,16 में एफडीए द्वारा अनुमोदित आरए को जोड़कर, ओवीए-विशिष्ट एसआईजीए को इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा योनि और छोटी आंत में बढ़ावा दिया गया था। इस प्रोटोकॉल को ओवीए को छोड़कर अन्य एंटीजन में मान्य नहीं किया गया है। भविष्य के अध्ययनों में, आंत्र संबंधी बीमारियों के पशु मॉडल का उपयोग वैक्सीन सुरक्षा बढ़ाने में सीएनई-आरए के प्रभाव और तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

उच्च दबाव homogenization, कतरनी मिश्रण और ultrasonication एनई तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया सबसे आम उच्च ऊर्जा पायसीकरण तरीकों रहे हैं, उच्च दबाव homogenization सबसे अच्छा समरूपता17 प्रदान करने के साथ. हालांकि, उच्च दबाव homogenization तरीकों अक्सर उच्च तैयारी लागत और गैर नगण्य शीतलन समस्याओं18 के साथ, महंगे विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है. हमारे पिछले प्रयोगों में, यह पाया गया कि समरूपता दबाव और चक्रों की संख्या का एनई के कण आकार पर प्रभाव पड़ा, और एक निश्चित सीमा के भीतर, समरूपता दबाव जितना अधिक होगा और चक्रों की संख्या जितनी अधिक होगी, कण आकार उतना ही छोटा होगा। तेल-इन-वाटर इमल्शन कोलोस्ट्रम की तैयारी प्रभावी रूप से तेल और पानी के चरणों को बड़ी बूंदों में परिवर्तित करती है और समरूपीकरण चक्रों की संख्या को कम करती है। यदि इस चरण को छोड़ दिया जाता है, तो समरूपता चक्रों की संख्या में वृद्धि के परिणामस्वरूप अंततः एक ही कण आकार और फैलाव के साथ नैनो-पायस हो सकते हैं। 0.9% खारा या सोडियम साइट्रेट बफर के साथ जलीय चरण में पीबीएस की जगह एनई के कण आकार और फैलाव पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

वैक्सीन डिजाइन19 में कई धनायनित लिपिड मोटे तौर पर लागू होते हैं, डीओटीएपी को इसके लिए चुना गया था कि इसे नैदानिक उपयोग के लिए अनुमोदित किया गया है, अच्छी सुरक्षा दिखाता है, और अच्छी तरह से सहन किया जाता है। एनई सतह पर अत्यधिक सकारात्मक चार्ज साइटोटॉक्सिसिटी का कारण बन सकता है। सुरक्षा कारणों से, धनायनित एनई तैयार करते समय धनायनित लिपिड के प्रकार और मात्रा को ध्यान में रखा जाना चाहिए। आमतौर पर वैक्सीन अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले अन्य धनायनित लिपिड DLin-MC3-DMA ((6Z,9Z,28Z,31Z)-हेप्टाट्रियाकॉन्ट-6,9,28,31-टेट्राईन-19-YL4- (डाइमिथाइलैमिनो) ब्यूटानेट)20, डीएमजी-PEG2000 (1,2-डिमिरिस्टॉयल-आरएसी-ग्लिसरो-3-मेथॉक्सीपॉलीथीन ग्लाइकोल-2000), डीओटीएमए (एन, एन, एन-ट्राइमिथाइल-2,3-बीआईएस (ऑक्टाडेक-9-एन-1-यलॉक्सी) प्रोपेन-1-एमिनियम क्लोराइड)21, डीसी-चोल (3β- [एन- (एन', एन'-डाइमिथाइलैमिनोइथेन)-कार्बामॉयल] कोलेस्ट्रॉल हाइड्रोक्लोराइड)22, और क्या उनका उपयोग धनायनित एनई तैयार करने के लिए किया जा सकता है, इसकी और जांच करने की आवश्यकता है।

हाल के वर्षों में, आरए ने विभिन्न मार्गों के माध्यम से आंतों के श्लेष्म को प्रतिरक्षा सेल होमिंग को प्रेरित करने की अपनी क्षमता के कारण ध्यान आकर्षित किया है, हालांकि, आरए न केवल खराब पानी में घुलनशील है, बल्कि प्रकाश और ऑक्सीजन के लिए अस्थिर भी है। एनईएस की तैयारी और भंडारण के दौरान, प्रकाश और ऑक्सीजन से आरए की सुरक्षा पर निरंतर ध्यान दिया जाना चाहिए। प्रकाश और ऑक्सीजन के संपर्क में आने पर आरए तेजी से ऑक्सीकरण और विघटित हो जाएगा, अंततः इसका सहायक प्रभाव खो देगा।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास इस काम में हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चोंगकिंग नेचुरल साइंस फाउंडेशन (नंबर सीएसटीसी2020जेसीवाईजे-जेडडीएक्सएमएक्स0027) और चीनी राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन प्रोजेक्ट (नंबर 32270988) के प्रमुख कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1640 medium GIBCO, USA C11875500BT
450 nm Stop Solution for TMB Substrate Abcam ab171529-1000 mL
Automated Cell Counter Countstar, China IC1000
BSA Sigma-Aldrich, USA B2064-100G
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany 5811000398
Danamic Light Scattering Malvern Zetasizer Nano S90
DOTAP CordenPharma, Switzerland O02002
ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) mabtech ab205719
Fetal Bovine Serum GIBCO, USA 10099141C
Full-function Microplate Reader Thermo Fisher Scientific, USA VL0000D2
Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) Abcam ab97240-1mg
Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) Abcam ab97235-1mg
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) Abcam Ab205720-500ug
Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) Abcam ab97245-1mg
High pressure homogenizer ATS
MONTANE 85 PPI SEPPIC, France L12910
MONTANOX 80 PPI SEPPIC, France 36372K
OVA257–264 Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. NA
OVA323-339 Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. NA
Phosphate buffer saline ZSGB-bio ZLI-9061
Red Blood Cell Lysis Buffer Solarbio, China R1010
retinoic acid TCI, Japan TCI-R0064-5G
Squalene Sigma, USA S3626
T10 basic Ultra-Turrax IKA, Germany
TMB ELISA Substrate Abcam ab171523-1000ml
trypsin inhibitor Diamond A003570-0100
Tween-20 Macklin, China 9005-64-5
Ultraviolet spectrophotometer Hitachi U-3900

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References

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इस महीने JoVE अंक 204 वैक्सीन एडजुवेंट cationic नैनोमल्शन DOTAP रेटिनोइक एसिड OVA में
Cationic Nanoemulsion-encapsulated रेटिनोइक एसिड OVA- विशिष्ट प्रणालीगत और mucosal प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए एक सहायक के रूप में
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Li, G. C., Li, H. F., Jin, Z., Feng, R., Deng, Y., Cheng, H., Li, H. B. Cationic Nanoemulsion-Encapsulated Retinoic Acid as an Adjuvant to Promote OVA-Specific Systemic and Mucosal Responses. J. Vis. Exp. (204), e66270, doi:10.3791/66270 (2024).

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