Summary
I detta protokoll utvecklade vi en katjonisk nanoemulsionsinkapslad retinsyra (RA) som ska användas som adjuvans för att främja antigenspecifika systemiska och slemhinnesvar. Genom att tillsätta den FDA-godkända RA till nanoemulsionen främjades antigenspecifikt sIgA i slidan och tunntarmen efter intramuskulär injektion av nanoemulsionen.
Abstract
Katjoniska nanostrukturer har dykt upp som ett adjuvans- och antigenleveranssystem som förbättrar dendritisk cellmognad, ROS-generering och antigenupptag och sedan främjar antigenspecifika immunsvar. Under de senaste åren har retinsyra (RA) fått ökad uppmärksamhet på grund av dess effekt på att aktivera slemhinnans immunsvar; Men för att kunna använda RA som ett slemhinneadjuvans är det nödvändigt att lösa problemet med dess upplösning, laddning och leverans. Här beskriver vi ett katjoniskt nanoemulsionsinkapslat retinsyra (CNE-RA) leveranssystem som består av den katjoniska lipiden 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOTAP), retinsyra, squalen som oljefas, polysorbat 80 som ytaktivt ämne och sorbitantrioleat 85 som co-ytaktivt ämne. Dess fysikaliska och kemiska egenskaper karakteriserades med hjälp av dynamisk ljusspridning och en spektrofotometer. Immunisering av möss med en blandning av antigen (ovalbumin, OVA) och CNE-RA höjde signifikant nivåerna av anti-OVA sekretorisk immunglobulin A (sIgA) i vaginal sköljvätska och tunntarmsvätska från möss jämfört med enbart OVA. Detta protokoll beskriver en detaljerad metod för beredning, karakterisering och utvärdering av den adjuvanta effekten av CNE-RA.
Introduction
Adjuvans används ofta för att öka effekten av ett vaccin genom att stimulera immunsystemet att reagera starkare på vaccinet och därigenom öka immuniteten mot en viss patogen1. Nanoemulsion (NE) adjuvans avser ett kolloidalt dispersionssystem med termodynamisk stabilitet genom att emulgera en viss andel av oljefasen och vattenfasen för att producera en emulsion i form av vatten-i-olja (W/O) eller olja-i-vatten (O/W)2. O/W nanoemulsionsadjuvans kan producera cytokiner och kemokiner vid injektionsstället, inducera snabb aggregering och proliferation av viktiga immunceller såsom monocyter, neutrofiler och eosinofiler, och förbättra immunsvaret och förbättra immunogeniciteten hos antigener3. För närvarande har tre nanoemulsionsadjuvans (MF59, AS03 och AF03) licensierats för användning i vacciner och har visat god säkerhet och effekt4.
Slemhinneimmunitet har dock hanterats dåligt av de för närvarande licensierade adjuvansformuleringarna i konventionell parenteral vaccination5. Retinsyra (RA) har rapporterats inducera tarmhoming av immunceller, men dess låga polaritet, dåliga löslighet i vatten och dålig ljus- och termisk stabilitet begränsar dess användning för robust enterisk vaccination. Nanoemulsioner erbjuder möjligheter att öka biotillgängligheten av mycket lipofila läkemedel, och oljekärnan i O/W-emulsionsadjuvans är lämplig för att lösa upp opolära ämnen som RA6. Därför kan nanoemulsioner användas som bärare av RA för att uppnå den dubbla responseffekten av systemisk immunitet och slemhinneimmunitet.
Jämfört med neutrala eller anjoniska leveranssystem har katjoniska leveranssystem relativt effektiva antigeninkapslings- och leveransförmåga, vilket kan förbättra immunogeniciteten hos antigener 7,8,9. Den katjoniska ytladdningen hos en mängd olika adjuvanssystem är viktig för deras adjuvanseffekter 10,11,12. Den katjoniska laddningen är en viktig faktor för att förlänga vaccinretentionen vid injektionsstället, öka antigenpresentationen och förlänga stimuleringen av cellulär immunitet i kroppen12.
Baserat på ovanstående överväganden utvecklade vi en katjonisk nanoemulsion för att effektivt samleverera RA och antigener. Partikelstorleken och zetapotentialen för nanoemulsionen bestämdes med hjälp av dynamisk ljusspridning (DLS), och de systemiska och slemhinneimmunsvaren för nanoemulsionen i kombination med OVA utvärderades genom intramuskulär injektion13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsöken utfördes i enlighet med Guide to the Use and Care of Laboratory Animals och godkändes av Laboratory Animal Welfare and Ethics Committee of the Third Military Medical University.
1. Beredning av nanoemulsioner (NE)
- För beredning av vattenfas, lös 0,15 g polysorbat 80 i 28,2 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) under omrörning vid 40 °C.
- För beredning av oljefas, använd oljefasformuleringen av nanoemulsionen som visas i tabell 1. Lös upp sornitantrileat 85, DOTAP och RA i squalene under omrörning vid 40 °C.
- För primär förberedelse av O/W-emulsion, rör om oljefasen magnetiskt vid 1400 rpm samtidigt som du tillsätter vattnet långsamt och droppvis med en hastighet av 1 ml/min. Föremulgera blandningen med ett emulgeringsmedel med hög skjuvning vid 30 000 varv per minut i 6 minuter.
- För högtryckshomogenisering (HPH), behandla den primära O/W-emulsionen som beretts ovan med en högtryckshomogenisator i 12 cykler vid 900 bar för att erhålla en homogen nanoemulsion i intervallet 160–190 nm.
- I slutet av processen, samla upp emulsionen i en 50 ml kolv och filtersterilisera emulsionen genom ett 0,2 μm PES-filtermembran.
- Anslut kolven till Schlenk-linjen genom katetern, rotera trevägskranen för att ansluta systemet till vakuumröret och slå på vakuumpumpen för att skapa vakuum i kolven. Rotera sedan trevägskranen, anslut systemet till argonröret och fyll det med argon. Upprepa detta steg 3 gånger för att säkerställa att kolven är fylld med argon.
- Byt ut korken och försegla den mot en parafinfilm, slå in kolven i aluminiumfolie och förvara den vid 4 °C.
2. Karakterisering av nanoemulsionerna
- Detektion av partikelstorlek och zetapotential
- Slå PÅ instrumentet och vänta 30 minuter tills laserljuskällan stabiliseras.
- Späd NE 50 gånger med ultrarent vatten och tillsätt 1 ml sample till motsvarande sample cell.
- För att mäta partikelstorleken, ställ in temperaturen på 25 °C, välj vatten som dispergeringsmedium och välj engångsplastskålar som mätcell. Ladda proverna och mät automatiskt. Rapportera medelvärdet av tre upprepade mätningar för varje prov som slutresultat.
- För mätning av zetapotential, ställ in temperaturen på 25 °C. På grund av valet av den vattenhaltiga fasen som dispersionsmedium, välj Smoluchowsi-modellen och den veckade kapillärcellen som mätcell. Ladda proverna och mät automatiskt. Rapportera medelvärdet av tre replikatmätningar för varje prov som slutresultat.
- Bestämning av inkapslingshastighet och läkemedelsladdningshastighet
- För att bestämma mängden RA som laddas i NE, använd absolut etanol för att demulgera och extrahera RA från NE. Tillsätt 995 μl etanol till 5 μl prov och bestäm RA-halten i lösningen med hjälp av en spektrofotometer vid 355 nm. Jämför absorbansen med en standardkurva. Använd följande ekvation:
Inkapsling = faktisk RA-belastning/vikt av tillsatt läkemedel
Läkemedelsladdningshastighet =faktisk RA-laddning/provets kvalitet
- För att bestämma mängden RA som laddas i NE, använd absolut etanol för att demulgera och extrahera RA från NE. Tillsätt 995 μl etanol till 5 μl prov och bestäm RA-halten i lösningen med hjälp av en spektrofotometer vid 355 nm. Jämför absorbansen med en standardkurva. Använd följande ekvation:
3. Immuniseringsprocedurer och provtagning
- Immuniseringsförfarande och gruppering
- Grupp Balb/C-möss av honkön i åldern 6-8 veckor och som väger cirka 18-21 g i set om 5 för immunisering på dag 0, dag 14, dag 28 enligt följande experimentella grupper: (1) PBS-gruppen, (2) ovalbumingruppen (OVA), (3) OVA+ NE-RA (OVA/NE-RA)-gruppen, (4) OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA)-gruppen.
- Immunisera alla möss genom intramuskulär injektion i de övre quadricepsmusklerna med 200 μl av olika vaccinformuleringar: 100 μl emulsion och 15 μg OVA absorberas i 100 μl PBS, blandat före administrering. Injicera 100 μL/bakben. För möss i kontrollgruppen administreras PBS ensamt.
- Eutanasi: Avliva alla möss genom en intraperitoneal injektion av 100 mg/kg 1 % natriumpentobarbital 2 veckor efter att de tre immuniseringarna har slutförts.
- Provtagning och bearbetning: Efter avlivning skär du upp bröstet på möss med en sax och för in en spruta direkt i hjärtat för att aspirera cirka 0,5 ml helblod. Låt blodet stå i 2 timmar i rumstemperatur och centrifugera sedan vid 1800 x g i 5 minuter vid 4 °C. Samla in serum, alikvot och förvara vid -80 °C för vidare analys.
- Samla in helblod, mjälte, vaginal sköljvätska (VLF), bronkoalveolär sköljvätska (BALF), nässköljvätska (NLF) och tunntarmsvätska (SILF).
- Isolering av mjältlymfocyter
- Blötlägg möss i etanol 75 % (v/v) för en kort sterilisering, överför mössen till en ren bänk. Klipp huden på vänster buk med en sax, exponera och ta bort mjälten.
- Placera mjälten i en petriskål som innehåller 3 ml PBS, mal och filtrera i ett 15 ml centrifugrör med hjälp av en sil (200 mesh, 70 μm) och malstång.
- Centrifugera cellerna vid 650 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och suspendera fällningen med 3 ml lyslösning av röda blodkroppar, inkubera i rumstemperatur i 5 minuter.
- Tillsätt 10 ml PBS i röret och skaka väl för att avsluta reaktionen, centrifugera det sedan vid 650 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och suspendera cellerna på nytt i 10 ml PBS, tillsätt 20 μl cellspädning till den automatiska cellräknaren för cellräkning.
- Centrifugera cellerna vid 650 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och späd cellerna till 1 x 106 celler/ml med 1640 komplett medium (1 % penicillin-streptomycin, 10 % fetalt bovint serum).
- VLF-uppsamling: Skölj slidan 4 gånger med 75 μL 1 % BSA/PBST, kombinera sköljlösningen och samla upp i 1,5 ml centrifugrör, centrifugera vid 5000 x g vid 4 °C i 20 minuter och samla upp supernatanten med en pipett och förvara vid -80 °C.
- BALF- och NLF-kollektion
- Desinficera mössen efter avlivning med 75 % (v/v) etanol. Håll musen i magen och räta ut nacken. Använd en sax för att göra ett längsgående snitt i huden på mushalsen och använd en pincett för att separera musklerna och exponera luftstrupen på ett adekvat sätt.
- Skär luftstrupen genom en liten tvärgående öppning och för in slangen mot lungorna, fäst sprutan på slangen och injicera 0,5 ml PBS i lungorna och dra ut den, upprepa sköljningen 3 gånger och centrifugera vid 650 x g vid 4 °C i 5 minuter, förvara supernatanten (BALF) vid -80 °C.
- Vänd slangen till näshålan, fäst sprutan på slangen och injicera 0,5 ml PBS, vätskan kommer att strömma genom näshålan in i 1,5 ml centrifugröret. Sug upp tvätten från centrifugröret och upprepa sköljningen 2 gånger, centrifugera sedan vid 650 x g vid 4 °C i 5 minuter, förvara supernatanten (NLF) vid -80 °C.
- SILF-kollektionen
- Bered PBS-lösning innehållande 0,1 mg/ml trypsinhämmare, 50 mM/L EDTA-2Na, 1 mM/L fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) som tunntarmssköljningslösning. Rör om i rumstemperatur för att lösas upp och förvaras vid 4 °C.
- Skär upp tunntarmen längs tarmröret och sänk ner i 3 ml tunntarmsvätska. Blanda genom vertikal skakning vid 15 varv per minut i 30 minuter vid 4 °C. Centrifugera vid 1440 x g vid 4 °C i 20 minuter och samla upp supernatanten med en pipett, centrifugera sedan vid 5000 x g vid 4 °C i 20 minuter. Förvara supernatanten (SILF) vid -80 °C.
4. Utvärdering av OVA-specifikt antikroppssvar efter intramuskulär administrering
- Bestäm serumnivåer av IgG, underklasser av IgG1, IgG2a och nivåerna av specifikt sIgA i VLF, BALF, NLF och SILF genom enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA).
- För antigenbeläggning, späd OVA till 5 μg/ml med beläggningsbuffert och belägg ELISA-plattorna med 96 brunnar över natten vid 4 °C med 100 μl OVA-lösning per brunn.
- Tvätta ELISA-plattorna 5 gånger med PBST och blockera genom inkubation med 250 μL 1 % BSA/PBST vid 37 °C i 2 timmar.
- Tvätta ELISA-plattorna 5 gånger med PBST, tillsätt sedan 100 μl av provet utspätt enligt beskrivningen nedan för provning och inkubera vid 37 °C i 1 timme. Späd serum, VLF, BALF, NLF med 0,5 % BSA/PBST, späd SILF med 20 % fetalt kalvserum (FCS)/PBST.
- Börja med att späda serumet 1000x med hjälp av en tvåstegsspädningsprocedur: späd 20 μL serum till 1 ml, späd sedan 25 μL av detta utspädda serum till 500 μL. Använd denna spädning av serum för detektion av IgG1, IgG2a.
- Tillsätt 200 μl serum utspätt 1000x till den första raden av den belagda plattan och tillsätt 100 μl 0,5 % BSA/PBST till alla brunnar utom den första raden. Överför 100 μL från den första raden till den andra raden och blanda 10 gånger med pipetten. Upprepa detta steg upp till rad 8 och kassera 100 μL vätska, serum med olika koncentrationer har erhållits för detektion av IgG.
- Utför en 1:1 utspädning av BALF, NLF och SILF för att detektera IgA. Använd samma spädningsförfarande för VLF som för serum.
- Tvätta ELISA-plattor 5 gånger med PBST. Tillsätt 100 μl HRP-konjugerad get anti-mouse IgG/IgG1/IgG2a/IgA (utspädd 1:10000 med PBST) till lämpliga brunnar och inkubera vid 37 °C i 40 minuter.
- Tvätta ELISA-plattorna 5 gånger med PBST, tillsätt 100 μL TMB ELISA-substrat (mycket känsligt) och överför plattan till en plats skyddad från ljus i 5 minuter. Tillsätt omedelbart 100 μL 450 nm stopplösning för TMB-substrat för att stoppa reaktionen.
- Mät absorbansen (OD) vid 450 nm för varje brunn och beräkna antikroppstitern genom att ta 2,1 gånger serumvärdet för den blinda musgruppen som positivt responsvärde.
5. ELISpot-analys
- Följ riktlinjerna för ELISpot Plus, använd Mouse IFN-γ (ALP) från satsen för att utföra analyserna.
- Ta ut plattan ur den förseglade förpackningen och tvätta 4 gånger med steril PBS (200 μL/brunn). Konditionera plattan med 1640 helmedium (200 μL/brunn) och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort mediet och tillsätt den justerade koncentrationen av lymfocytsuspension som beretts i steg 3.2.2 (100 μL/brunn) till plattan, tillsätt sedan 100 μL av stimulus, dvs. 1640 komplett medium innehållande 20 μg/ml OVA257~264 eller OVA323~339 eller 1640 komplett medium. Placera plattan i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5 % CO2 i 48 timmar. Linda in plattan med aluminiumfolie för att undvika avdunstning.
- Kassera cellsuspensionen och tvätta plattan 5 gånger med PBS (200 μL/brunn). Späd detektionsantantikroppen (R4-6A2-biotin) till 1 μg/ml i PBS innehållande 0,5 % fetalkalvserum (PBS-0,5 % FCS). Tillsätt 100 μL/brunn och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta plattan som i steg 5.2. Späd streptavidin-ALP (1:1000) i PBS-0,5%FCS och tillsätt 100 μL/brunn, inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta plattan som i steg 5.2. Filtrera den bruksfärdiga substratlösningen (BCIP/NBT-plus) genom ett 0,45 μm filter och tillsätt 100 μL/brunn. Utveckla tills distinkta fläckar framträder.
- Stoppa färgutvecklingen genom att tvätta mycket i kranvatten, ta bort den mjuka plasten och låt plattan torka.
- Inspektera och räkna fläckar i en ELISpot-läsare.
6. Statistisk analys
- Analysera skillnaderna mellan data från 4 grupper med envägs ANOVA följt av Tukey multipel jämförelse efter test. Uttryck alla resultat som medelvärde ± SD. P-värde mindre än 0,05 ansågs vara signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt framställdes fyra nanoemulsionsformuleringar och karakteriserades av deras partikelstorlek (Figur 1), deras zetapotential och deras inkapslingseffektivitet som presenteras i Tabell 2. Partikelstorleken var koncentrerad runt 160-190 nm och tillsatsen av DOTAP vände Zeta-potentialen för nanoemulsion. OVA-specifikt serum-IgG och dess subgruppsantikroppsnivå i serum detekterades 2 veckor efter tredje immuniseringen. Vaccinet mot nanoemulsionsadjuvans ökade signifikant de OVA-specifika IgG-, IgG1- och IgG2a-antikroppstitrar i serum (Figur 2). Ännu viktigare är att nivåerna av specifikt sIgA i vaginal sköljvätska och tunntarmsvätska ökade signifikant när OVA adjuvanserades med CNE-RA (Figur 3). I ELISpot-analysen hittades inga signifikanta fläckar.
Figur 1: Storlek diameter och fördelning. (A) Storlek, diameter och fördelning av NE-RA. B) Storlek, diameter och fördelning av CNE-RA. d.nm är den genomsnittliga diametern för partiklarna i nm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: OVA-specifikt serum-IgG och dess subgruppsantikroppsnivåer i serum. OVA-specifikt serum-IgG och dess subgruppsantikroppsnivåer i serum 2 veckor efter att de tre vaccinationerna genomförts. (A) Log2-värdet för IgG-titrarna. (B) IgG1 optisk densitet vid 450 nm. (C) IgG2a optisk densitet vid 450 nm. Data uttrycks som medelvärde ± SD (n=5), ***: P<0,001. Jämförelser av skillnaderna mellan grupperna och PBS-gruppen visas direkt ovanför kolumnerna i figuren och anges enligt följande: ns: ingen betydelse, #p<0,05, ###p<0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: OVA-specifik sIgA. OVA-specifik sIgA i vaginal sköljvätska, bronkoalveolär sköljvätska, nässköljvätska, tunntarmsvätska. A) Vaginalt sköljvatten, B) bronkoalveolär sköljvätska, C) sköljvätska i näsan och D) sköljvätska i tunntarmen. Data uttrycks som medelvärde ± SD (n=5), ns: ingen signifikans, *p<0,05; s<0.001. Jämförelser av skillnaderna mellan grupperna och PBS-gruppen visas direkt ovanför kolumnerna i figuren och anges enligt följande: ns: ingen betydelse, ###p<0.001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Prov | Skvalen | Sorbitantrioleat 85 | DOTAP | RA |
| NE-RA | Cirka 1,5 g | 0,15 g | 0 | 60mg filmdragerade tabletter |
| CNE-RA | Cirka 1,5 g | 0,15 g | 45mg | 60mg filmdragerade tabletter |
Tabell 1: Oljefasformulering av NE.
| Prov | Partiklarnas medelstorlek (nm) | Index för polydispersitet | Zeta-potential (mV) | Inkapslingseffektivitet (%) | Läkemedelsladdningshastighet (mg/ml) |
| NE-RA | 182.9±3.4 | 0,18±0,02 | -23.0±0.2 | 40 | 0.8 |
| CNE-RA | 162.7±4.2 | 0.16±0.01 | 42.2±0.5 | 40 | 0.8 |
Tabell 2: Fysikalisk-kemiska egenskaper hos NE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll utvecklade vi en katjonisk nanoemulsionsinkapslad retinsyra som ska användas som adjuvans för att främja antigenspecifika systemiska och slemhinnesvar. Jämfört med traditionella NE-adjuvanser har den följande två fördelar. För det första har ytan på O/W NE i allmänhet en hög negativ laddning, vilket gör det svårt att direkt ladda antigener. Katjoniska NE kan effektivt adsorbera peptid- eller proteinantigener och förbättra den specifika immunogeniciteten. För det andra har erfarenheter från traditionell vaccinforskning visat att det är svårt att stimulera slemhinneresponsen genom subkutan eller intramuskulär injektion5. Genom att tillsätta den FDA-godkända RA till nanoemulsionen 14,15,16 främjades OVA-specifik sIgA i slidan och tunntarmen genom intramuskulär injektion. Detta protokoll har inte validerats för andra antigener förutom OVA. I framtida studier kan djurmodeller av tarmrelaterade sjukdomar användas för att ytterligare utvärdera effekten och mekanismen av CNE-RA för att förbättra vaccinskyddet.
Högtryckshomogenisering, skjuvblandning och ultraljud är de vanligaste högenergiemulgeringsmetoderna som används för att framställa NEs, med högtryckshomogenisering som ger den bästa homogeniteten17. Metoder för högtryckshomogenisering kräver dock ofta dyr specialutrustning, med höga förberedelsekostnader och icke försumbara kylningsproblem18. I våra tidigare experiment fann man att homogeniseringstrycket och antalet cykler hade en effekt på partikelstorleken hos NE, och inom ett visst intervall, ju högre homogeniseringstrycket var och ju högre antalet cykler var, desto mindre tenderade partikelstorleken att vara. Beredningen av olja-i-vatten-emulsionsråmjölk omvandlar effektivt olje- och vattenfaserna till stora droppar och minskar antalet homogeniseringscykler. Om detta steg utelämnas kan en ökning av antalet homogeniseringscykler så småningom resultera i nanoemulsioner med samma partikelstorlek och dispersion. Att ersätta PBS i vattenfasen med 0,9 % saltlösning eller natriumcitratbuffert hade ingen effekt på partikelstorleken och dispersionen av NE.
Multipla katjoniska lipider används i stor utsträckning i vaccindesign19, DOTAP valdes för att det har godkänts för klinisk användning, visar god säkerhet och tolereras väl. Överdriven positiv laddning på NE-ytan kan leda till cytotoxicitet. Av säkerhetsskäl måste man ta hänsyn till typen och mängden av katjoniska lipider vid beredning av katjoniska NE. Andra katjoniska lipider som ofta används i vaccinstudier är DLin-MC3-DMA ((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraen-19-yl4-(dimetylamino)butanoat)20, DMG-PEG2000 (1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-metoxipolyetylenglykol-2000), DOTMA (N,N,N-trimetyl-2,3-bis(oktadec-9-en-1-yloxi)propan-1-aminiumklorid)21, DC-Chol (3β- [N-(N′,N′-dimetylaminoetan)-karbamoyl]kolesterolhydroklorid)22, och om de kan användas för att framställa katjoniska NE måste undersökas ytterligare.
Under de senaste åren har RA uppmärksammats på grund av dess förmåga att inducera immuncellshoming till tarmslemhinnan genom olika vägar, men RA är inte bara dåligt vattenlösligt utan också instabilt för ljus och syre. Under beredning och lagring av NE bör ständig uppmärksamhet ägnas åt att skydda RA från ljus och syre. RA kommer snabbt att oxideras och sönderdelas när den utsätts för ljus och syre, och förlorar så småningom sin adjuvanseffekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter i detta arbete.
Acknowledgments
Denna studie finansierades av Key Program of Chongqing Natural Science Foundation (nr cstc2020jcyj-zdxmX0027) och Chinese National Natural Science Foundation Project (nr 32270988).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
References
- Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O'Hagan, D. T. Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).
- Chen, W. L., et al. Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide. Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).
- Iwasaki, A., Omer, S. B. Why and how vaccines work. Cell. 183 (2), 290-295 (2020).
- Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers. Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. J Cont Release. 252, 28-49 (2017).
- Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines. Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).
- Korsholm, K. S., et al. The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes. Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).
- Agger, E. M., et al. Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements. Plos One. 3 (9), e3116 (2008).
- Slutter, B., et al. Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen. Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).
- Nochi, T., et al. Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines. Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).
- Henriksen-Lacey, M., et al. Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response. J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).
- Zhong, X. F., et al. Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections. Small. 18 (1), e2105530 (2022).
- Mora, J. R., et al. Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells. Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).
- Burger, C., Shahzad, Y., Brümmer, A., Gerber, M., du Plessis, J.
- Lodaya, R. N., et al. Formulation design, optimization and evaluations of an α-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine. J Cont Release. 316, 12-21 (2019).
- Carmona-Ribeiro, A. M., Pérez-Betancourt, Y. Cationic nanostructures for vaccines design. Biomimetics. 5 (3), 32 (2020).
- Lam, K., et al. trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), e2209624 (2023).
- Nie, T. Q., et al. Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1. Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).
- Lou, G., et al. Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection. J Cont Release. 325, 370-379 (2020).
