Karakterisering af multidrug efflux systemer i Acinetobacter baumannii ved hjælp af en efflux-mangelfuld bakteriestamme og et enkelt-kopi genekspressionssystem

Summary

Vi beskriver en let procedure for enkeltkopikromosomal komplementaritet af et effluxpumpegen ved hjælp af et mini-Tn7-baseret ekspressionssystem til en konstrueret efflux-mangelfuld stamme af Acinetobacter baumannii. Dette præcise genetiske værktøj muliggør kontrolleret genekspression, hvilket er nøglen til karakterisering af effluxpumper i multiresistente patogener.

Abstract

Acinetobacter baumannii er anerkendt som et udfordrende gramnegativt patogen på grund af dets udbredte resistens over for antibiotika. Det er afgørende at forstå mekanismerne bag denne modstand mod at designe nye og effektive terapeutiske muligheder. Desværre hæmmes vores evne til at undersøge disse mekanismer i A. baumannii af manglen på egnede genetiske manipulationsværktøjer. Her beskriver vi metoder til at udnytte et kromosomalt mini-Tn7-baseret system til at opnå enkeltkopi-genekspression i en A. baumannii-stamme , der mangler funktionelle RND-type effluxmekanismer. Enkeltkopiindsættelse og inducerbar effluxpumpeekspression er ret fordelagtige, da tilstedeværelsen af RND-effluxoperoner på plasmider med højt kopinummer ofte tolereres dårligt af bakterieceller. Desuden hjælper inkorporering af rekombinante mini-Tn7-ekspressionsvektorer i kromosomet i en surrogat A. baumannii-vært med øget effluxfølsomhed med at omgå interferens fra andre effluxpumper. Dette system er værdifuldt, ikke kun til undersøgelse af ukarakteriserede bakterielle effluxpumper, men også til vurdering af effektiviteten af potentielle hæmmere rettet mod disse pumper.

Introduction

Acinetobacter baumannii er et WHO-topprioriteret patogen på grund af dets omfattende resistens over for alle klasser af antibiotika¹. Det er et opportunistisk patogen, der hovedsagelig påvirker indlagte, sårede eller immunkompromitterede mennesker. A. baumannii undgår i vid udstrækning antibiotika via effluxpumper, hvoraf den mest relevante er Resistance-Nodulation-Division (RND)-familien af eksportører². At forstå, hvordan disse effluxpumper fungerer mekanistisk, vil gøre det muligt for en at udvikle målrettede terapeutiske muligheder.

En almindelig måde, hvorpå cellulære processer kan skelnes specifikt, er gennem genetisk manipulation. Imidlertid er de værktøjer, der er til rådighed for A. baumannii genetiske undersøgelser, begrænsede, og for yderligere at forvirre eksperimentelt design er kliniske isolater ofte resistente over for de antibiotika, der rutinemæssigt anvendes til selektion i genetiske manipulationer³. En anden forhindring, man støder på, når man studerer effluxpumper specifikt, er, at de er strengt reguleret - ofte af ukendte faktorer - hvilket gør det vanskeligt nøjagtigt at isolere og tildele funktion til en enkelt pumpe⁴. Da vi så dette behov for at udvide forskningsværktøjskassen, udviklede vi et mini-Tn7-baseret, enkeltkopi-indsættelse, inducerbart udtrykssystem, der inkorporerer en Flp-rekombinasemålkassette (FRT), som gør det muligt at fjerne markeringsmarkøren ^5,6,7 (figur 1). Først oprettet til Pseudomonas ^8,9,10, blev dette elegante klonings- og ekspressionssystem brugt til at generere enkeltkopi-effluxpumpekomplementer til en RND-effluxpumpe-mangelfuld stamme af A. baumannii (ATCC 17978:: ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: i det følgende benævnt A. baumannii AB258), som vi genererede¹¹. At være i stand til at studere en effluxpumpe ad gangen og ikke overvælde bakteriecellerne med høj kopiekspression (som generelt set med plasmidbaserede ekspressionssystemer), kan man bedre lære om de kritiske, fysiologiske aspekter af hver effluxpumpe med minimal interferens og reducerede komplikationer.

Denne artikel beskriver, hvordan man bruger mini-Tn7-systemet til at supplere et slettet gen af interesse, RND effluxpumpe adeIJK, ind i kromosomet af A. baumannii AB258 gennem en række ukomplicerede trin udført i løbet af 9 dage⁷. Det første sæt trin genindfører de slettede effluxpumpegener, der er klonet, i det mini-Tn7-baserede insertionsplasmid (figur 2A) på det enkelte attTn7-indsættelsessted nedstrøms for det velbevarede glmS-gen (figur 3A). Denne proces lettes af et ikke-replikativt hjælperplasmid (figur 2B), der koder for de transposasegener, der er nødvendige for Tn7-drevet indsættelse. Det andet sæt trin bruger et excisionsplasmid (figur 2C) til Flp rekombinasemedieret fjernelse af gentamicingenet flankeret af FRT-steder (figur 3B) for at skabe en umærket stamme. Selvom dette system bruges til at belyse de væsentlige roller og mulige hæmmere af RND-effluxpumper med hensyn til antibiotikaresistens, kan det bruges til at undersøge ethvert gen af interesse.

Protocol

1. Eksperimentel forberedelse

1. Purify plasmidet pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (insertion plasmid, figur 2A) med genet af interesse.
   BEMÆRK: Her er genet af interesse adeIJK. Den endelige plasmidkoncentration bør være ≥100 ng/μL.
2. Hjælperplasmidet (pTNS2)⁹ og excisionsplasmidet (pFLP2^ab)⁶ (henholdsvis figur 2B,C) renses ideelt til en endelig plasmid-DNA-koncentration på ≥100 ng/μL.
3. Forbered 50 ml sterilt ultrarent vand og 25 ml steril LB (Lennox) bouillon (se materialetabel).
4. Der fremstilles mindst 10 LB agarplader, hver med følgende additiver: almindelig (ingen tilsætningsstoffer), gentamicin (Gm) ved 50 μg/ml, carbenicillin (Cb) ved 200 μg/ml (til udvælgelse via ampicillinresistensgenet) og 5% saccharose (se materialetabel).
5. Den stamme, der skal anvendes til indsættelse på LB-agar, stribes og inkuberes ved 37 °C i 16-18 timer. Her anvendes A. baumannii AB258.
   BEMÆRK: Denne protokol skal udføres i et sterilt miljø så meget som muligt ved hjælp af en bunsenbrænder på bænken eller et biologisk sikkerhedsskab. Alle forbrugsstoffer (pipettespidser, podningssløjfer, mikrofugerør osv.) skal være sterile.

2. Forberedelse af kultur

1. Pod en enkelt koloni af A. baumannii AB258 i 4 ml LB bouillon i et sterilt 13 ml kulturrør ved hjælp af en steril podningssløjfe eller steril træpodningspind.
   BEMÆRK: Der anvendes en enkelt 4 ml kultur til en prøve og en kontrol. Forøg antallet af kulturer afhængigt af antallet af nødvendige prøver.
2. Der inkuberes natten over ved 37 °C under omrystning (250 omdr./min.).
3. Anbring en flaske sterilt destilleret vand (25-50 ml) ved 4 °C natten over til brug i trin 3.

3. Forberedelse af elektrokompetente celler

1. Anbring alle sterile 1,5 ml mikrofugerør (to pr. kultur) og sterile elektroporationskuvetter (to pr. kultur) på is (se materialetabel). Opbevar prøverne på is så meget som muligt under hele proceduren.
2. Flasken med sterilt vand, der blev opbevaret ved 4 °C, anbringes på is.
3. Overfør 1,5 ml af bakteriekulturen natten over til et af de 1,5 ml mikrofugerør.
4. Der centrifugeres ved 13.000 x g i 2 minutter for at pelletere cellerne.
   BEMÆRK: Centrifugering ville ideelt set blive udført ved 4 °C, men centrifugering ved omgivelsestemperatur er acceptabel og ikke skadelig.
5. Brug en pipette på 1 ml til at fjerne hele supernatanten uden at forstyrre cellepelletsen.
6. Tilsæt yderligere 1,5 ml bakteriekultur i det samme mikrofugerør. Der centrifugeres ved 13.000 x g i 2 min., hvorefter supernatanten fjernes.
7. Gentag trin 3.6 en sidste gang med de resterende 1 ml kultur.
8. Tilsæt 1 ml iskoldt sterilt vand til cellepillen og resuspender med forsigtig pipettering, indtil pelleten ikke længere sidder i bunden af mikrofugerøret.
9. De resuspenderede celler centrifugeres ved 13.000 x g i 2 min.
10. Supernatanten fjernes forsigtigt med en pipette på 1 ml. Supernatanten må ikke hældes, især ikke i de efterfølgende vasketrin, hvor cellerne har tendens til at danne mindre kompakte pellets.
11. Gentag dette vasketrin med iskoldt sterilt vand, trin 3.8 til trin 3.10, to gange mere.
12. Den endelige cellepille resuspenderes forsigtigt i 200 μL iskoldt sterilt vand.
13. Overfør 100 μL af den endelige cellesuspension til det andet iskolde 1,5 ml mikrofugerør. Denne anden delprøve bliver den negative kontrol for elektroporation. Opbevar celleprøverne på is.

4. Elektroporation

1. Der forvarmes 1 ml LB bouillon og en LB + Gm⁵⁰ agarplade (fremstillet i trin 1.4) til hver prøve og kontrol i en statisk inkubator indstillet til 37 °C.
2. I et kombineret volumen på 5 μL eller mindre tilsættes 100-200 ng hvert af pTNS2-hjælperplasmidet og pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK-indsættelsesplasmidet til en alikvot af elektrokompetente celler.
3. Bland med let fingerspidstryk for at sikre fuldstændig blanding af plasmiderne med de elektrokompetente celler uden at indføre bobler.
4. Der tilsættes en tilsvarende mængde sterilt destilleret vand i den negative kontrolcelle, der er en delprøve, og blandes forsigtigt som ovenfor.
5. Inkuber prøverne på is i 20 min.
6. Overfør hele celleprøven til en iskold elektroporationskuvette, og læg derefter kuvetten tilbage på is. Gentag for den negative kontrolcelleprøve.
7. Elektroporat celleprøven.
   1. Tænd for elektroporatoren, og indstil den til 2,0 kV (25 μF, 200 Ω) (se materialetabel).
   2. Tør kuvettens overflade af med et blødt væv for at fjerne klæbende is eller fugt.
   3. Sæt kuvetten i elektroporatoren, og giv det elektriske stød.
   4. Tilsæt straks 0,9 ml forvarmet LB-bouillon til cellerne i kuvetten og pipette forsigtigt op og ned for at blande cellerne med mediet.
   5. Overfør hele cellesuspensionen til et nyt 1,5 ml mikrofugerør (stuetemperatur).
   6. Kontroller tidskonstantværdien på elektroporatoren; For de bedste resultater skal denne værdi være mellem 4 og 6.
8. Elektroporationsproceduren (trin 4.7.1 til trin 4.7.6) gentages for den negative kontrolcelleprøve.
9. De elektroporerede prøver inkuberes ved 37 °C i 1 time ved 250 o/min for at muliggøre cellegenvinding.
10. Ved hjælp af en podningsspreder spredes 100 μL af hver elektroporeret celleprøve på en forvarmet LB + Gm⁵⁰ agarplade.
    1. De resterende prøver centrifugeres ved 13.000 x g i 2 minutter for at pelletere cellerne.
    2. Efter fjernelse af al supernatanten med pipette resuspenderes cellerne i 100 μl LB bouillon.
    3. Hver hel prøve fordeles på individuelle forvarmede LB + Gm⁵⁰ agarplader.
       BEMÆRK: Elektroporationseffektivitet kan være belastningsafhængig. Når man elektroporerer en stamme for første gang, kan det være informativt at udlægge forskellige volumener eller endda fortyndinger af elektroporationsprøven for at sikre, at de resulterende plader har isolerede kolonier.
11. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 16-18 timer.

5. Udvælgelse af transformerede kolonier til PCR-baseret screening

1. Kontroller elektroporationspladerne. Den negative kontrol bør ikke have kolonier; Prøven skal have forskellige kolonier.
   BEMÆRK: Plader med kolonier kan på dette trin og i alle efterfølgende trin, hvor agarplader med kolonier eller pletter fremstilles, opbevares ved 4 °C i op til 3 dage, før de fortsættes.
2. Brug sterile tandstikkere til at hente op til 10 enkeltkolonier fra LB + Gm⁵⁰ agarpladerne og lappe dem på en frisk LB + Gm⁵⁰ agarplade.
3. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 16-18 timer.

6. Verifikation af kromosomindsættelse ved koloni PCR

1. Fjern LB + Gm⁵⁰ agarpladerne indeholdende de lappede kolonier fra inkubatoren.
2. Brug en steril tandstikker eller steril pipettespids til at fjerne en lille portion (på størrelse med en stor koloni) fra et plaster i 20 μL sterilt destilleret vand i et 0,2 ml PCR-rør; Bland godt. Vandprøven skal blive synligt uklar, når cellerne frigives fra tandstikkeren. Forbered et vilkårligt antal prøver, der skal screenes, men 6 bør være tilstrækkeligt.
3. PCR-røret indeholdende bakteriesuspensionen inkuberes ved 100 °C i 5-10 min.
4. Brug en minicentrifuge (se materialetabellen) til at dreje prøven med den fastsatte maksimale hastighed i 2 minutter for at pelletere celleaffald.
5. Supernatanten overføres til et nyt 0,2 ml PCR-rør og lægges på is. Denne prøve indeholder skabelon-DNA til PCR-reaktionen.
   BEMÆRK: Denne skabelon-DNA kan opbevares ved -20 °C, før der fortsættes med PCR.
6. Forbered en PCR-reaktionsblanding indeholdende 1x polymerasebuffer, 200 μM dNTP'er, 0,18 μM ABglmS2_F_New fremadgående primer, 0,18 μM Tn7R omvendt primer (tabel 1), 1 U Taq DNA-polymerase og 1 μL af det fremstillede skabelon-DNA i et samlet volumen på 25 μL. Forbered en no-template control (NTC), herunder alt undtagen skabelon-DNA'et (se materialetabel).
7. Indtast reaktionsbetingelserne i en termisk cyklist: 95 °C i 2 min; 95 °C i 30 s, 49 °C i 30 s og 72 °C i 30 s i i alt 35 cyklusser 72 °C i 10 min; Hold 12 °C. Kør prøverne.
8. Efter tilsætning af DNA-påfyldningsfarvestof til en slutkoncentration på 1x, fyldes 10 μL af hver PCR-reaktion på en 2% agarosegel og køres ved 80 V i 40 minutter. Den forventede amplicon størrelse for dette primerpar er 382 bp. NTC bør ikke have nogen bånd.
9. Identificer de prøver, der producerede det forventede PCR-produkt. Forbered en stribeplade på LB + Gm⁵⁰ agarplader fra et hvilket som helst af de PCR-positive plastre; Der inkuberes ved 37 °C i 16-18 timer. Målet er at generere en plade med enkelte kolonier til fremstilling af en glycerolbestand for at bevare denne markerede stamme og som udgangspunkt for at skabe en umærket stamme (beskrevet nedenfor).

7. Fjernelse af Gm^R-markøren ved hjælp af pFLP2^ab

1. Følg proceduren nævnt i trin 2: Forberedelse af kultur. Prøven, der anvendes til fremstilling af overnatningskulturen, er en enkelt koloni fra LB + Gm⁵⁰ agarpladerne, der er forberedt til at generere diskrete kolonier i trin 6.9.
2. Følg proceduren nævnt i trin 3: Forberedelse af elektrokompetente celler. Forbered cellerne fra natten over kulturen til elektroporation.
3. Følg proceduren nævnt i trin 4: Elektroporation. Her er plasmidet, der skal introduceres til cellerne, pFLP2^ab (100-200 ng), som fjerner gentamicinresistensgenet og flankerer det kromosomalt indsatte gen af interesse.
4. Efter at cellerne er genoprettet i 1 time (trin 4.9), spredes 100 μL af den elektroporerede celleprøve på en forvarmet LB + Cb²⁰⁰ agarplade (fremstillet i trin 1.4). Dette selektive tryk sikrer, at kun celler, der huser pFLP2^ab excision plasmid, vil vokse.
5. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 16-18 timer.
6. Kontroller pladen for kolonier. Den negative kontrolplade bør ikke have kolonier; LB + Cb²⁰⁰ agarprøvepladen skal have forskellige kolonier.
7. Brug sterile tandstikkere til at krydsplastre op til 20 isolerede kolonier på en LB + Cb²⁰⁰ agarplade og en LB + Gm⁵⁰ agarplade.
8. Pladerne inkuberes i 16-18 timer ved 37 °C.
9. Kontroller pladerne for patches. Kloner, der vokser på LB + Cb²⁰⁰ agarpladen, men ikke LB + Gm⁵⁰ agarpladen, har fået gentamicinresistensgenet fjernet fra den originale indsats.
10. Vælg de plastre, der er carbenicillinresistente og gentamicin, der er modtagelige for striber på individuelle LB-agarplader suppleret med 5% (w / v) saccharose, hvilket tvinger udvisningen af pFLP2^ab-plasmidet fra bakterierne. Vælg op til 10 kolonier.
11. Pladerne inkuberes i 16-18 timer ved 37 °C.
12. Kontroller pladerne for kolonier.
13. Som en endelig bekræftelse af pFLP2^ab plasmidtab, krydsplaster 4-6 isolerede kolonier fra 5% saccharosepladerne på en LB + Cb²⁰⁰ agarplade og en LB agarplade.
14. Pladerne inkuberes i 16-18 timer ved 37 °C.
15. Vælg en klon, der vokser på LB-agarpladen, og som er carbenicillinfølsom til fremstilling af en glycerolbestand for at bevare denne umærkede stamme.
    1. Genetisk verifikation af den umærkede stamme kan udføres med koloni PCR (trin 6: Verifikation af kromosomindsættelse ved koloni PCR) ved hjælp af primere, der er målrettet mod gentamicinresistensgenet.
    2. Der fremstilles en PCR-reaktionsblanding indeholdende 1x polymerasebuffer, 200 μM dNTP'er, 0,18 μM Gm_F fremadgående primer, 0,18 μM Gm_R omvendt primer (tabel 1), 1 U Taq DNA-polymerase og 1 μL af det fremstillede skabelon-DNA i et samlet volumen på 25 μL. Forbered en no-template kontrol (NTC), der omfatter alle undtagen skabelon-DNA'et, og en positiv kontrol ved hjælp af DNA fra den markerede stamme.
    3. Indtast reaktionsbetingelserne i en termisk cyklist: 95 °C i 2 min; 95 °C i 30 s, 50 °C i 30 s og 72 °C i 40 s i i alt 35 cyklusser 72 °C i 10 min; Hold 12 °C. Kør prøverne.
    4. Efter tilsætning af DNA-påfyldningsfarvestof til en slutkoncentration på 1x, fyldes 10 μL af hver PCR-reaktion på en 1% agarosegel og køres ved 80 V i 40 minutter. Den forventede amplicon størrelse for dette primerpar er 525 bp. Den positive kontrol skal have et enkelt bånd; prøverne og NTC bør ikke have bånd.

Representative Results

Den kromosomale indsættelsesprocedure tager kun 2 timer i alt over 3 dage for at se en resultatkoloni vokse på en selektiv agarplade (figur 1A-C). Det forventede antal kolonier på transformationspladen er belastningsafhængigt: man kan se 20-30 eller endda hundredvis af kolonier, da indsættelse af Tn7 på attTn7-steder er specifik og effektiv⁹. Patching transformation pladekolonier på selektive medier (figur 4A) bevarer den transformerede stamme og giver udgangsmateriale til koloni PCR-screening (figur 1E og figur 4B). Screening af kolonier med PCR kan holdes på et minimum - højst 10 kolonier skal behandles, og de fleste skal give et positivt resultat til indsættelse. PCR-produktet til screeningsprimerne, ABglmS2_F_New og Tn7R (tabel 1), er 382 bp (figur 4B bane 4); negative kontroller for reaktionen omfatter vildtype A. baumannii ATCC 17978 (figur 4B bane 2), AB258 (figur 4B bane 3) og ingen skabelon (figur 4B bane 5). Kolonier, der er PCR-positive, repræsenterer supplerede, markerede stammer.

Fjernelse af gentamicinresistensgenet (umærkning) tager mindre end 3 timer, der spænder over 6 dage, da celler, der transformeres med excisionsplasmidet, skal vælges gennem selektiv plettering, og derefter skal excisionsplasmidet helbredes fra bakterierne (figur 1F). Flp-FRT rekombinationsbaseret excision er præcis og effektiv og bør resultere i ≥20 kolonier på transformationspladen. Kolonier, der er krydslappet på carbenicillin (selektering for β-lactamresistens tildelt af excisionsplasmidet) og gentamicin (på udkig efter tab af gentamicinresistens) bør alle være henholdsvis carbenicillinresistente og gentamicinfølsomme. Udskæringsplasmidet tvinges ud af bakterierne ved vækst på 5% saccharoseagarplader. Vækst på saccharose tvinger cellerne til at eliminere pFLP2^ab, da sacB-genet på plasmidet fremmer omdannelsen af saccharose til levaner, et polysaccharid, der er giftigt for bakterierne^12,13. Alle kolonier, der vokser på 5% saccharosemedier, bør derefter kun vokse på almindelige LB-agarplader; Der bør ikke være vækst på carbenicillin agarplader. Kolonier, der vokser på de almindelige LB-agarplader, repræsenterer umærkede stammer. Bekræftelse af tab af gentamicinmarkøren kan opnås ved koloni-PCR ved anvendelse af Gm_F og Gm_R primere (tabel 1 og figur 5). Dette primerpar giver kun en amplicon på 525 bp i den positive kontrol (den oprindeligt oprettede markerede stamme, figur 5 bane 4); vildtype ATCC 17978 (figur 5 bane 2), AB258 (figur 5 bane 3), enhver testet koloni (figur 5 bane 5) og kontrollen uden skabelon (figur 5 bane 6) bør ikke vise forstærkning.

Når den umærkede stamme er bekræftet, kan funktionstest begynde med fænotypiske assays. Her er det indlysende førstevalg at bestemme den mindste hæmmende koncentration (MIC) af en række antibiotika: ciprofloxacin er et kendt substrat for AdeIJK, tetracyklin kan fjernes af AdeIJK (den største effluxpumpe er AdeAB), og kanamycin har en relativt lille effekt på A. baumannii ATCC 17978 ^2,14. Ved hjælp af bouillonmikrofortyndingsmetoden i henhold til CLSI-retningslinjerne¹⁵ blev den supplerede umærkede stamme AB258::adeIJK udfordret med hvert antibiotikum i fravær og tilstedeværelse af 50 μM IPTG; vildtypestamme ATCC 17978 og RND efflux-mangelfuld stamme AB258 blev medtaget som kontroller (tabel 2). Samlet set fortæller tendensen set i MIC-værdierne den forventede historie-nedsatte modtagelighed af AB258::adeIJK for ciprofloxacin og tetracyklin med induceret ekspression af effluxpumpen, hvilket bekræfter, at indsættelsen af adeIJK var vellykket.

Figur 1: Oversigt over proceduren. (A) Der udarbejdes en overnatningskultur af A. baumannii-stammen, der skal suppleres. (B) Cellerne fra natkulturen vaskes med vand 3 gange via centrifugering og holdes på is. (C) Leverings- og hjælperplasmiderne tilsættes cellerne og inkuberes på is i 20 minutter. Prøven elektroporeres, LB-medier tilsættes, og cellerne får lov til at komme sig i 1 time ved 37 °C. En 100 μL alikvote celler spredes på LB + Gm⁵⁰ agarplader og inkuberes ved 37 °C natten over. D) Kolonier fra transformationspladen lappes på en LB + Gm⁵⁰ agarplade og dyrkes natten over ved 37 °C. E) Patchede kolonier forberedes til PCR for at screene for tilstedeværelsen af et amplifikationsprodukt, der spænder over det kromosomale indsættelsessted. PCR-amplifikation visualiseres ved agarosegelelektroforese. PCR-positive prøver repræsenterer vellykket indsættelse af genet af interesse i kromosomet og skabelsen af en markant stamme. (F) En koloni, der er positiv for gentamicin, fremstilles som i trin (A-C) med elektroporation af pLFP2^ab-plasmidet for at fjerne gentamicinkassetten fra kromosomindsættelsen. Selektiv plettering på LB + Cb²⁰⁰ agar bekræfter optagelsen af plasmidet. Duplikat patching på LB + Cb²⁰⁰ og LB + Gm⁵⁰ agarplader afslører kolonier, der er Cb^R og Gm^S, hvilket bekræfter tab af gentamicinkassetten fra indsættelsen. ^Vækst af udvalgte Cb R-kolonier på 5% saccharose hærder pLFP2^ab-plasmidet fra cellerne. Kolonier fra 5% saccharosepladen lappes på LB + Cb²⁰⁰ agar og LB agar for at afsløre ønskede Cb^S og Gm^S kolonier og bekræfte dannelsen af den umærkede stamme. GM⁵⁰, gentamicin ved 50 μg/ml Cb²⁰⁰, carbenicillin ved 200 μg/ml; ^R, resistent; ^S, følsom. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Plasmider anvendt i denne protokol. Generelle plasmidkort over (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (indsættelsesplasmid), (B) pTNS2 (hjælperplasmid) og (C) pFLP2^ab (excisionsplasmid). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Skematisk oversigt over indsættelse og afmærkning. a) Indsættelse. Det enkelte Tn7-indsættelsessted i A. baumannii-kromosomet er placeret 24 bp fra slutningen af glmS2-genet. Co-elektroporation af insertionsplasmidet og hjælperplasmidet muliggør komplementaritet af interesse (indsat gen, lilla) sammen med resten af insertionkassetten (FRT-steder til markørudskæring, gul; accC1 gen for gentamicin resistens, grøn; lacIq gen for inducerbar ekspression, blå) i kromosomet. (B) Afmærkning. Elektroporation af den komplementære, markerede indsættelsesstamme med pFLP2^ab excisionsplasmidet letter fjernelsen af gentamicinresistensgenet (accC1, grøn) via Flp-FRT-rekombination (FRT-steder, gul), hvilket skaber en umærket stamme. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Bekræftelse af transformation, patching og indsættelse ved koloni-PCR. Repræsentativt resultat af (A) væksten af transformationskolonier efter patching og (B) koloni PCR-amplifikation med ABglmS_F_New (grå) og Tn7R (orange) primere for at bekræfte kromosomindsættelse. Bane 1: DNA-stige med lav molekylvægt; Bane 2: ATCC 179798; Bane 3: AB258; Bane 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Bane 5: kontrol uden skabelon. Det forventede bånd på 382 bp er mærket. Bemærk, at de gentamicinspecifikke primere (Gm_F og Gm_R, grøn) også kan bruges til at bekræfte kromosomindsættelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Bekræftelse af tab af markør ved koloni-PCR. Repræsentativt resultat af koloni PCR-amplifikation med gentamicinspecifikke primere (Gm_F og Gm_R) for at bekræfte tabet af antibiotikamarkøren via pFLP^ab-baseret excision. Bane 1: DNA-stige med lav molekylvægt; Bane 2: ATCC 179798; Bane 3: AB258; Bane 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Bane 5: AB258::adeIJK; Bane 6: kontrol uden skabelon. Det forventede bånd på 525 bp er mærket. Klik her for at se en større version af denne figur.

Stammer, plasmider og primere	Relevante egenskaber	Henvisning
Plet
A. baumannii ATCC 17978	Type stamme	ATCC
A. baumannii ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
Plasmider
pUC18T-miniTn7T-GM-LAC	GMR, AmpR	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GMR, AmpR, adeIJK	Denne undersøgelse
pTNS2	ForstærkerR	9
pFLP2ab	pWH1266 oprindelse eller replikation, sacB, AmpR	7
Primere	Sekvens (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
Tn7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	Denne undersøgelse
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	Denne undersøgelse

Tabel 1: Bakteriestammer, plasmider og primere, der anvendes i denne protokol. GM, gentamicin; Amp, ampicillin; ^R, resistent.

	Ciprofloxacin		Tetracyklin		Kanamycin
IPTG	−	+	−	+	−	+
ATCC 17978	0.250	Nd	0.500	Nd	1.5	Nd
AB258	0.031	Nd	0.063	Nd	4	Nd
AB258::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
Fold ændring		4.01		4.03		0.25

Tabel 2: Test af funktionaliteten af de indsatte gener via antibiotikafølsomhed. Sammenligning af mindste hæmmende koncentration (MIC) værdier for A. baumannii ATCC 17978, AB258, uinduceret AB258::adeIJK, og IPTG-induceret AB258::adeIJK mod ciprofloxacin, tetracyklin og kanamycin. Foldændring = induceret (+ IPTG)/ikke-induceret (− IPTG); nd = ikke bestemt.

Discussion

Selvom denne procedure til kromosomindsættelse af et inducerbart enkeltkopi-genekspressionssystem i A. baumannii er teknisk ligetil og ikke arbejdskrævende, er der et par vigtige trin, der skal understreges. For det første skal forberedelsen af de kompetente celler udføres på is så meget som muligt, da cellerne bliver skrøbelige under udskiftning af medierne med iskoldt vand. Ideelt set udføres centrifugeringstrinnene ved 4 °C, men centrifugering ved stuetemperatur er acceptabel. I betragtning af cellernes stigende skrøbelighed under vandvasken er skånsom pipettering også kritisk. For det andet er elektroporation følsom over for tilstedeværelsen af ioner. Vask af cellerne med flere runder pelletering og resuspendering i vand sikrer, at mediet fjernes helt. Plasmider bør også nyrenses og kan elueres i standard kitelueringsbuffere (normalt TE-buffer), så længe plasmid-DNA-koncentrationen er høj nok. Vi sigter mod at tilføje <5 μL plasmid til 100 μL cellesuspension for at holde prøvens ionstyrke meget lav, selvom op til 10 μL skal tolereres. For det tredje bør selektive agarplader fremstilles efter behov for at sikre effektiviteten af det tilsatte antibiotikum. Bemærk, at carbenicillin blev anvendt i stedet for det sædvanlige ampicillin til udvælgelse under transformationen af excisionsplasmidet, pFLP2^ab. A. baumannii er iboende resistent over for aminopenicilliner (ampicillin)¹⁶; Erstatning af et carboxypenicillin (carbenicillin) muliggør fortsat selektion med plasmidkodet β-lactamase.

Optimering af forsøgsprotokollen er mere nuanceret og vil variere mellem forskellige arter af Acinetobacter (eller endda genetisk manipulerede stammer inden for samme art) og muligvis de særlige reagenser, der anvendes i laboratoriet. For eksempel kan spændingen, der anvendes til elektroporation, variere mellem 1,8 og 2,5 kV, og termocykliske forhold skal muligvis ændres lidt afhængigt af DNA-polymerase, der anvendes til PCR. Nyttige tip til at overveje, om celler vokser dårligt efter elektroporation, omfatter reduktion af koncentrationen af gentamicin i agarpladerne fra 50 μg / ml til 30 μg / ml og / eller forlængelse af inkubationstiden for agarpladerne til ≥24 timer. Med hensyn til trinene til fjernelse af gentamicinkassetten kan der opnås bedre succes ved at bruge LB-agarplader med 10% saccharose og / eller inkubere dem ved 30 ° C i ≥24 timer, hvis carbenicillinresistens vedvarer.

Talrige A. baumannii-celleforberedelsesmetoder til brug med elektroporation findes i litteraturen, men de inkluderer ofte et subkultureringstrin efter den indledende natkultur og derefter en lang vækstfase til en foreskrevet optisk densitet. Vi har fundet ud af, at en simpel overnatningskultur kan bruges lige så effektivt. Elektroporation af A. baumannii er velbeskrevet, og læsere kan få yderligere indsigt i dette specifikke aspekt af protokollen her^17,18. De vigtigste fordele ved dette mini-Tn7 kromosomale genkomplementionssystem sammenlignet med et plasmidbaseret komplementationssystem er evnen til at regulere ekspressionsniveauet for det komplementerede gen gennem det IPTG-kontrollerbare lacI q-repressorsystem og valget om at fjerne gentamicinmarkøren (aacC1-genet) via de ledsagende FRT-lokaliteter. Det blev observeret, at cellernes tolerance over for ekspression af effluxpumper kan variere afhængigt af den indsatte pumpe. For eksempel er celler mere følsomme over for ekspressionen af AdeIJK sammenlignet med AdeABC eller AdeFGH; Dette kan løses ved at ændre koncentrationen af IPTG under dyrkningsbetingelser. Fjernelse af antibiotikamarkøren reducerer mutationsrisikoen for stammen på grund af konstant selektionstryk og giver også mulighed for ubegrænsede antibiotikafølsomhedsundersøgelser³.

Dette mini-Tn7-system er blevet brugt med succes med Pseudomonas ^9,10, Yersinia⁹, Burkholderia¹⁹, Xanthomonas²⁰ og Acinetobacter ^5,6,21,22 arter, men der findes nogle begrænsninger. For eksempel er der i A. baumannii kun et funktionelt attTn7-indsættelsessted i genomet⁵, så en stamme kan skabes med flere deletioner, men kun et gen ad gangen kan suppleres. Dette system har heller ikke endnu vist sig effektivt for grampositive bakterier¹⁰.

RND effluxpumper er vigtige facilitatorer af antibiotikaresistens i A. baumannii. Det, der gør dem så kraftfulde, er deres tredelte struktur, der spænder over de indre og ydre membraner, hvilket gør det muligt at fjerne antibiotika fra periplasmaet til uden for cellen. De mest undersøgte og allestedsnærværende RND-pumper - udpeget AdeABC, AdeFGH og AdeIJK - har vist sig at eliminere antibiotika, der omfatter alle klasser. Detaljeret belysning af effluxpumpens funktion vil give et godt udgangspunkt for at designe nye terapeutiske muligheder mod multiresistente stammer. Brug af AB258 tredobbelt RND-pumpedeletionsstamme og komplementaritet af en pumpe ad gangen giver mulighed for undersøgelse af hver pumpe uafhængigt af de andre, idet de for hver især skelner deres unikke substratprofiler og mest effektive hæmmere. Selvfølgelig har effluxpumper også en "dag-til-dag" rolle i bakteriens normale funktion. Forståelse af disse roller kan føre til indirekte lammelse af pumperne, hvilket igen vil afbryde antibiotikaudstrømningen, hvilket muligvis gør multiresistente bakterier modtagelige for almindeligt anvendte antibiotika igen. Generelt kan mini-Tn7-systemet bruges til at introducere ethvert gen af interesse for detaljeret undersøgelse eller nyttige markører, for eksempel fluorescerende proteiner til mikroskopisk billeddannelse⁶.

Den stigende forekomst af multiresistente bakterier bekymrer os alle. Forståelse af de beskyttende mekanismer, der leveres af effluxpumper i patogener som A. baumannii, er afgørende for at bekæmpe alvorlige infektioner. Dette kromosomale enkeltkopi-genekspressionssystem er et kraftfuldt værktøj til mekanistiske undersøgelser såvel som til at identificere hæmmere for at modvirke effluxpumpefunktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates