Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/66471
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, University of Manitoba

Summary

Mini-Tn7 tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bir akış pompası geninin tek kopyalı kromozomal tamamlayıcısı için tasarlanmış bir akış eksikliği olan Acinetobacter baumannii suşuna kolay bir prosedür tarif ediyoruz. Bu hassas genetik araç, çoklu ilaca dirençli patojenlerde akış pompalarının karakterizasyonu için anahtar olan kontrollü gen ekspresyonuna izin verir.

Abstract

Acinetobacter baumannii , antibiyotiklere karşı yaygın direnci nedeniyle zorlu bir Gram-negatif patojen olarak kabul edilmektedir. Yeni ve etkili terapötik seçenekler tasarlamak için bu direncin arkasındaki mekanizmaları anlamak çok önemlidir. Ne yazık ki, A. baumannii'deki bu mekanizmaları araştırma yeteneğimiz, uygun genetik manipülasyon araçlarının yetersizliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, fonksiyonel RND tipi akış mekanizmalarından yoksun bir A. baumannii suşunda tek kopya gen ekspresyonu elde etmek için kromozomal mini-Tn7 tabanlı bir sistemi kullanma yöntemlerini açıklıyoruz. Yüksek kopya sayılı plazmitlerde RND akış operonlarının varlığı genellikle bakteri hücreleri tarafından zayıf bir şekilde tolere edildiğinden, tek kopya ekleme ve indüklenebilir akış pompası ekspresyonu oldukça avantajlıdır. Ayrıca, rekombinant mini-Tn7 ekspresyon vektörlerinin, artan akış duyarlılığına sahip bir vekil A. baumannii konağının kromozomuna dahil edilmesi, diğer akış pompalarından kaynaklanan parazitlerin önlenmesine yardımcı olur. Bu sistem sadece karakterize edilmemiş bakteriyel akış pompalarını araştırmak için değil, aynı zamanda bu pompaları hedef alan potansiyel inhibitörlerin etkinliğini değerlendirmek için de değerlidir.

Introduction

Acinetobacter baumannii, tüm antibiyotik sınıflarına karşı kapsamlı direnci nedeniyle Dünya Sağlık Örgütü'nün en öncelikli patojenidir1. Çoğunlukla hastanede yatan, yaralanan veya bağışıklığı baskılanmış kişileri etkileyen fırsatçı bir patojendir. A. baumannii, en alakalı olanı Direnç-Nodülasyon-Bölümü (RND) ihracatçı ailesidir2. Bu akış pompalarının mekanik olarak nasıl çalıştığını anlamak, kişinin hedeflenen terapötik seçeneklerin geliştirilmesine olanak sağlayacaktır.

Hücresel süreçlerin spesifik olarak ayırt edilebilmesinin yaygın bir yolu, genetik manipülasyondur. Bununla birlikte, A. baumannii genetik çalışmaları için mevcut araçlar sınırlıdır ve deneysel tasarımı daha da karmaşık hale getirmek için, klinik izolatlar genellikle genetik manipülasyonlarda seçim için rutin olarak kullanılan antibiyotiklere dirençlidir3. Özellikle akış pompalarını incelerken karşılaşılan ikinci bir engel, genellikle bilinmeyen faktörler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmeleridir ve bu da işlevi tek bir pompaya doğru bir şekilde izole etmeyi ve atfetmeyizorlaştırır 4. Araştırma araç kutusunu genişletme ihtiyacını görerek, seçim işaretçisi 5,6,7'nin kaldırılmasına izin veren bir Flp rekombinaz hedef (FRT) kaseti içeren mini-Tn7 tabanlı, tek kopya ekleme, indüklenebilir bir ifade sistemi geliştirdik (Şekil 1). İlk olarak Pseudomonas 8,9,10 için oluşturulan bu zarif klonlama ve ekspresyon sistemi, A. baumannii'nin (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: bundan böyle A. baumannii AB258 olarak anılacaktır) RND akış pompası eksikliği olan bir suşuna tek kopyalı akış pompası tamamlayıcıları oluşturmak için kullanıldı11. Bir seferde bir akış pompasını inceleyebilmek ve bakteri hücrelerini yüksek kopya ekspresyon ile boğmamak (genellikle plazmid bazlı ekspresyon sistemlerinde görüldüğü gibi), her bir akış pompasının kritik, fizyolojik yönleri hakkında minimum parazit ve azaltılmış komplikasyonlarla daha iyi öğrenilebilir.

Bu makale, mini-Tn7 sisteminin, 9 gün boyunca gerçekleştirilen bir dizi karmaşık olmayan adımla A. baumannii AB258'in kromozomuna silinmiş bir gen, RND akış pompası adeIJK'yi tamamlamak için nasıl kullanılacağını açıklamaktadır7. İlk adım seti, iyi korunmuş glmS geninin akış aşağısındaki tek attTn7 ekleme bölgesinde mini-Tn7 tabanlı ekleme plazmidine (Şekil 2A) klonlanan silinmiş akış pompası genlerini yeniden tanıtır (Şekil 3A). Bu işlem, Tn7 güdümlü yerleştirme için gerekli olan transpozaz genlerini kodlayan replikatif olmayan bir yardımcı plazmit (Şekil 2B) ile kolaylaştırılır. İkinci adım seti, işaretlenmemiş bir suş oluşturmak için FRT bölgeleri (Şekil 3B) ile çevrili gentamisin geninin Flp rekombinaz aracılı çıkarılması için bir eksizyon plazmidi (Şekil 2C) kullanır. Bu sistem, antibiyotik direnci ile ilgili olarak RND akış pompalarının temel rollerini ve olası inhibitörlerini aydınlatmak için kullanılsa da, ilgilenilen herhangi bir geni araştırmak için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Deneysel hazırlık

  1. Plazmid pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9'u (ekleme plazmidi, Şekil 2A) ilgilenilen gen ile saflaştırın.
    NOT: Burada ilgilenilen gen adeIJK'dir. Nihai plazmit konsantrasyonu ≥100 ng/μL olmalıdır.
  2. Yardımcı plazmidi (pTNS2)9 ve eksizyon plazmidini (pFLP2ab)6 (Şekil 2B,C, sırasıyla), ideal olarak ≥100 ng/μL'lik bir nihai plazmit DNA konsantrasyonuna kadar saflaştırın.
  3. 50 mL steril ultra saf su ve 25 mL steril LB (Lennox) suyu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. Her biri aşağıdaki katkı maddelerini içeren en az 10 LB agar plakası hazırlayın: sade (katkı maddesi yok), 50 μg/mL'de gentamisin (Gm), 200 μg/mL'de karbenisilin (Cb) (ampisilin direnç geni yoluyla seçim için) ve %5 sükroz (bkz.
  5. LB agar üzerine yerleştirmek için kullanılacak suşu çizgiden çıkarın ve 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin. Burada A. baumannii AB258 kullanılır.
    NOT: Bu protokol, mümkün olduğunca steril bir ortamda, tezgahta bir Bunsen brülörü veya biyolojik güvenlik kabini kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Tüm sarf malzemelerinin (pipet uçları, aşılama halkaları, mikrofüj tüpleri vb.) steril olması gerekir.

2. Kültür hazırlığı

  1. Tek bir A. baumannii AB258 kolonisini, steril bir aşılama döngüsü veya steril ahşap aşılama çubuğu kullanarak steril bir 13 mL kültür tüpünde 4 mL LB suyuna aşılayın.
    NOT: Bir numune ve bir kontrol için tek bir 4 mL kültür kullanılır. İhtiyaç duyulan numune sayısına bağlı olarak kültür sayısını artırın.
  2. Gece boyunca 37 °C'de çalkalayarak (250 rpm) inkübe edin.
  3. 3. adımda kullanmak için gece boyunca 4 °C'de bir şişe steril damıtılmış su (25-50 mL) yerleştirin.

3. Elektroyetkin hücrelerin hazırlanması

  1. Tüm steril 1.5 mL mikrofüj tüplerini (kültür başına iki adet) ve steril elektroporasyon küvetlerini (kültür başına iki adet) buz üzerine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Numuneleri prosedür boyunca mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.
  2. 4 °C'de saklanan steril su şişesini buzun üzerine koyun.
  3. Gece boyunca bakteri kültürünün 1.5 mL'sini 1.5 mL'lik mikrofüj tüplerinden birine aktarın.
  4. Hücreleri peletlemek için 13.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Santrifüjleme ideal olarak 4 °C'de gerçekleştirilir, ancak ortam sıcaklığında santrifüjleme kabul edilebilir ve zararlı değildir.
  5. 1 mL'lik bir pipet kullanarak, hücre peletini bozmadan tüm süpernatanı çıkarın.
  6. Aynı mikrofüj tüpüne 1.5 mL daha bakteri kültürü ekleyin. 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin, ardından tüm süpernatanı çıkarın.
  7. Kalan 1 mL kültürle 3.6 adımını son bir kez tekrarlayın.
  8. Hücre peletine 1 mL buz gibi steril su ekleyin ve pelet artık mikrofüj tüpünün dibinde kalmayana kadar hafif pipetleme ile yeniden süspanse edin.
  9. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin.
  10. 1 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın. Süpernatanı, özellikle hücrelerin daha az kompakt topaklar oluşturma eğiliminde olduğu sonraki yıkama adımlarında dökmeyin.
  11. Bu yıkama adımını buz gibi steril suyla, 3.8'den 3.10'a kadar olan adımları iki kez daha tekrarlayın.
  12. Son hücre peletini 200 μL buz gibi steril suda nazikçe yeniden süspanse edin.
  13. Son hücre süspansiyonunun 100 μL'sini ikinci buz gibi soğuk 1.5 mL mikrofüj tüpüne aktarın. Bu ikinci alikot, elektroporasyon için negatif kontrol olacaktır. Hücre örneklerini buz üzerinde tutun.

4. Elektroporasyon

  1. Her numune için 1 mL LB et suyu ve bir LB + Gm50 agar plakası (adım 1.4'te hazırlanmıştır) önceden ısıtın ve 37 °C'ye ayarlanmış statik bir inkübatörde kontrol edin.
  2. 5 μL veya daha az birleşik bir hacimde, pTNS2 yardımcı plazmidinin her birine 100-200 ng ekleyin ve pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK ekleme plazmiti, elektroyetkin hücrelerin bir alikotuna ekleyin.
  3. Plazmitlerin elektroyetkin hücrelerle kabarcıklar oluşturmadan tam olarak karışmasını sağlamak için parmak ucuyla hafifçe vurarak karıştırın.
  4. Negatif kontrol hücresi alikotuna eşdeğer hacimde steril damıtılmış su ekleyin ve yukarıdaki gibi hafifçe karıştırın.
  5. Numuneleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
  6. Tüm hücre örneğini buz gibi bir elektroporasyon küvetine aktarın, ardından küveti tekrar buzun üzerine yerleştirin. Negatif kontrol hücresi örneği için tekrarlayın.
  7. Hücre örneğini elektroporate edin.
    1. Elektroporatörü açın ve 2.0 kV'a (25 μF, 200 Ω) ayarlayın (bkz.
    2. Yapışan buz veya nemi gidermek için küvetin yüzeyini yumuşak bir bezle silin.
    3. Küveti elektroporatöre yerleştirin ve elektrik çarpmasını sağlayın.
    4. Küvetteki hücrelere hemen 0,9 mL önceden ısıtılmış LB suyu ekleyin ve hücreleri ortamla karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
    5. Tüm hücre süspansiyonunu yeni bir 1.5 mL mikrofüj tüpüne (oda sıcaklığı) aktarın.
    6. Elektroporatör üzerindeki zaman sabiti değerini kontrol edin; En iyi sonuçlar için bu değer 4 ile 6 arasında olmalıdır.
  8. Negatif kontrol hücresi numunesi için elektroporasyon prosedürünü tekrarlayın (adım 4.7.1 ila adım 4.7.6).
  9. Hücre geri kazanımına izin vermek için elektroporasyonlu numuneleri 37 °C'de 250 rpm'de 1 saat inkübe edin.
  10. Bir aşılama yayıcı kullanarak, her bir elektroporasyonlu hücre örneğinin 100 μL'sini önceden ısıtılmış bir LB + Gm50 agar plakasına yayın.
    1. Hücreleri peletlemek için kalan numuneleri 13.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
    2. Bir pipet kullanarak tüm süpernatantı çıkardıktan sonra, hücreleri 100 μL LB et suyunda yeniden süspanse edin.
    3. Her bir numunenin tamamını önceden ısıtılmış ayrı ayrı LB + Gm50 agar plakalarına yayın.
      NOT: Elektroporasyon verimliliği gerilime bağlı olabilir. Bir suşun ilk kez elektropolasyonu yapılırken, elde edilen plakaların izole kolonilere sahip olduğundan emin olmak için elektroporasyon numunesinin farklı hacimlerini ve hatta seyreltmelerini plakalamak bilgilendirici olabilir.
  11. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.

5. PCR tabanlı tarama için dönüştürülmüş kolonilerin seçilmesi

  1. Elektroporasyon plakalarını kontrol edin. Negatif kontrolün kolonisi olmamalıdır; Numunenin farklı kolonileri olmalıdır.
    NOT: Kolonili plakalar, bu adımda ve kolonili veya yamalı agar plakalarının üretildiği sonraki tüm adımlarda, devam etmeden önce 4 °C'de 3 güne kadar saklanabilir.
  2. Steril kürdan kullanarak, LB + Gm50 agar plakalarından 10 adede kadar tek koloni alın ve bunları taze bir LB + Gm50 agar plakasına yamalayın.
  3. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.

6. Koloni PCR ile kromozomal insersiyonun doğrulanması

  1. Yamalı kolonileri içeren LB + Gm50 agar plakalarını inkübatörden çıkarın.
  2. Steril bir kürdan veya steril pipet ucu kullanarak, bir yamadan küçük bir kısmı (yaklaşık büyük bir koloni büyüklüğünde) 20 mL'lik bir PCR tüpünde 0.2 μL steril damıtılmış suya çıkarın; İyice karıştırın. Hücreler kürdandan salınırken su numunesi gözle görülür şekilde bulanıklaşmalıdır. Taranması gereken herhangi bir sayıda numune hazırlayın, ancak 6 yeterli olmalıdır.
  3. Bakteriyel süspansiyonu içeren PCR tüpünü 100 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.
  4. Bir mini santrifüj kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), hücresel kalıntıları peletlemek için numuneyi 2 dakika boyunca sabit maksimum hızda döndürün.
  5. Süpernatanı yeni bir 0.2 mL PCR tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Bu numune, PCR reaksiyonu için şablon DNA'yı içerir.
    NOT: Bu şablon DNA, PCR'ye devam etmeden önce -20 °C'de saklanabilir.
  6. 1x polimeraz tamponu, 200 μM dNTP'ler, 0.18 μM ABglmS2_F_New ileri primer, 0.18 μM Tn7R ters primer (Tablo 1), 1 U Taq DNA polimeraz ve 1 μL içeren bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın hazırlanan şablon DNA toplam 25 μL hacimde. Şablon DNA hariç tümü dahil olmak üzere şablonsuz bir kontrol (NTC) hazırlayın (bkz.
  7. Reaksiyon koşullarını bir termal döngüleyiciye girin: 2 dakika boyunca 95 °C; 30 sn için 95 °C, 30 sn için 49 °C ve 30 sn için 72 °C olmak üzere toplam 35 döngü; 10 dakika boyunca 72 °C; 12 °C tutun. Örnekleri çalıştırın.
  8. DNA yükleme boyasının 1x'lik bir nihai konsantrasyona eklenmesini takiben,% 2'lik bir agaroz jel üzerine her bir PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve 40 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırın. Bu primer çifti için beklenen amplikon boyutu 382 bp'dir. NTC'nin bantları olmamalıdır.
  9. Beklenen PCR ürününü üreten numuneleri tanımlayın. PCR pozitif yamaların herhangi birinden LB + Gm50 agar plakaları üzerinde bir çizgi plakası hazırlayın; 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin. Amaç, bu işaretli suşu korumak için bir gliserol stoğunun hazırlanması için ve işaretsiz bir suş oluşturmak için bir başlangıç noktası olarak tek kolonili bir plaka oluşturmaktır (aşağıda açıklanmıştır).

7.pFLP2 ab kullanılarak GmR işaretleyicisinin çıkarılması

  1. Adım 2'de belirtilen prosedürü izleyin: Kültür hazırlama. Gece kültürünü hazırlamak için kullanılan numune, adım 6.9'da ayrı koloniler oluşturmak için hazırlanan LB + Gm50 agar plakalarından tek bir kolonidir.
  2. Adım 3'te belirtilen prosedürü izleyin: Elektrokompetan hücrelerin hazırlanması. Elektroporasyon için gece kültüründen hücreleri hazırlayın.
  3. Adım 4'te belirtilen prosedürü izleyin: Elektroporasyon. Burada, hücrelere sokulacak plazmit, ilgilenilen kromozomal olarak yerleştirilmiş geni çevreleyen gentamisin direnç genini ortadan kaldıracak olan pFLP2ab'dir (100-200 ng).
  4. Hücreler 1 saat boyunca iyileştikten sonra (adım 4.9), elektroporasyonlu hücre numunesinin 100 μL'sini önceden ısıtılmış bir LB + Cb200 agar plakasına (adım 1.4'te hazırlanır) yayın. Bu seçici basınç, yalnızca pFLP2ab eksizyon plazmidini barındıran hücrelerin büyümesini sağlar.
  5. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
  6. Plakada koloni olup olmadığını kontrol edin. Negatif kontrol plakasında koloni olmamalıdır; LB + Cb200 agar numune plakası farklı kolonilere sahip olmalıdır.
  7. Steril kürdan kullanarak, 20'ye kadar izole koloniyi bir LB + Cb200 agar plakasına ve bir LB + Gm50 agar plakasına çapraz yamalayın.
  8. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
  9. Plakalarda yama olup olmadığını kontrol edin. LB + Cb200 agar plakasında büyüyen, ancak LB + Gm50 agar plakasında büyümeyen klonlar, gentamisin direnç genini orijinal ek parçadan çıkarmıştır.
  10. pFLP2ab plazmidinin bakterilerden atılmasını zorlayan% 5 (a / h) sükroz ile desteklenmiş ayrı LB agar plakalarına çizilmeye duyarlı karbenisiline dirençli ve gentamisine duyarlı yamaları seçin. En fazla 10 koloni seçin.
  11. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
  12. Koloniler için plakaları kontrol edin.
  13. pFLP2ab plazmit kaybının son bir teyidi olarak,% 5 sükroz plakalarından izole edilmiş 4-6 koloniyi bir LB + Cb200 agar plakasına ve bir LB agar plakasına çapraz yamalayın.
  14. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
  15. LB agar plakasında büyüyen ve bu işaretsiz suşu korumak için bir gliserol stoğunun hazırlanması için karbenisiline duyarlı bir klon seçin.
    1. İşaretlenmemiş suşun genetik doğrulaması, gentamisin direnç genini hedef alan primerler kullanılarak koloni PCR (adım 6: Koloni PCR ile kromozomal insersiyonun doğrulanması) ile gerçekleştirilebilir.
    2. 1x polimeraz tamponu, 200 μM dNTP, 0.18 μM Gm_F ileri primer, 0.18 μM Gm_R ters primer (Tablo 1), 1 U Taq DNA polimeraz ve 1 μL toplam 25 μL hacimde hazırlanan şablon DNA içeren bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. Şablon DNA hariç tümünü içeren şablonsuz bir kontrol (NTC) hazırlayın, ve işaretli suştan DNA kullanılarak pozitif bir kontrol.
    3. Reaksiyon koşullarını bir termal döngüleyiciye girin: 2 dakika boyunca 95 °C; 30 sn için 95 °C, 30 sn için 50 °C ve 40 sn için 72 °C olmak üzere toplam 35 döngü; 10 dakika boyunca 72 °C; 12 °C tutun. Örnekleri çalıştırın.
    4. DNA yükleme boyasının 1x'lik bir nihai konsantrasyona eklenmesini takiben,% 1'lik bir agaroz jel üzerine her bir PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve 40 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırın. Bu primer çifti için beklenen amplikon boyutu 525 bp'dir. Pozitif kontrol tek bir banda sahip olmalıdır; numuneler ve NTC'de bant olmamalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kromozomal yerleştirme prosedürü, seçici bir agar plakasında büyüyen bir sonuç kolonisi görmek için 3 gün boyunca toplam sadece 2 saat sürer (Şekil 1A-C). Dönüşüm plakasında beklenen koloni sayısı suşa bağlıdır: Tn7'nin attTn7 bölgelerine yerleştirilmesi spesifik ve verimli olduğu için 20-30 hatta yüzlerce koloni görülebilir9. Dönüşüm plakası kolonilerinin seçici ortama yamalanması (Şekil 4A), dönüştürülmüş suşu korur ve koloni PCR taraması için başlangıç materyali sağlar (Şekil 1E ve Şekil 4B). Kolonilerin PCR ile taranması minimumda tutulabilir - 10'dan fazla koloninin işlenmesi gerekmemelidir ve çoğu yerleştirme için pozitif sonuç vermelidir. Tarama primerleri, ABglmS2_F_New ve Tn7R (Tablo 1) için PCR ürünü 382 bp'dir (Şekil 4B şeridi 4); reaksiyon için negatif kontroller arasında vahşi tip A. baumannii ATCC 17978 (Şekil 4B şeridi 2), AB258 (Şekil 4B şeridi 3) ve şablon yok (Şekil 4B şeridi 5) bulunur. PCR pozitif olan koloniler, tamamlanmış, işaretli suşları temsil eder.

Gentamisin direnç geninin çıkarılması (işaretsiz) 3 saatten az sürer, eksizyon plazmidi ile dönüştürülen hücrelerin seçici kaplama yoluyla seçilmesi gerektiğinden 6 gün sürer ve daha sonra eksizyon plazmitinin bakterilerden iyileştirilmesi gerekir (Şekil 1F). Flp-FRT rekombinasyon bazlı eksizyon kesin ve etkilidir ve transformasyon plakasında ≥20 koloni ile sonuçlanmalıdır. Karbenisilin (eksizyon plazmidi tarafından verilen β-laktam direnci seçilerek) ve gentamisin (gentamisin direncinin kaybını arayan) üzerine çapraz yamalı kolonilerin tümü sırasıyla karbenisiline dirençli ve gentamisine duyarlı olmalıdır. Eksizyon plazmidi, %5 sükroz agar plakalarında büyüyerek bakterilerden dışarı atılır. Sükroz üzerindeki büyüme, hücreleri pFLP2ab'yi ortadan kaldırmaya zorlar, çünkü plazmit üzerindeki sakB geni, sükrozun bakteriler için toksik bir polisakkarit olan levanlara dönüşümünü teşvik eder12,13. % 5 sükroz ortamında büyüyen tüm koloniler daha sonra sadece düz LB agar plakalarında büyümelidir; Karbenisilin agar plakalarında büyüme olmamalıdır. Düz LB agar plakalarında büyüyen koloniler, işaretlenmemiş suşları temsil eder. Gentamisin belirtecinin kaybının doğrulanması, Gm_F ve Gm_R primerleri kullanılarak koloni PCR ile sağlanabilir (Tablo 1 ve Şekil 5). Bu primer çifti, yalnızca pozitif kontrolde 525 bp'lik bir amplikon verir (başlangıçta oluşturulan işaretli gerinim, Şekil 5 şerit 4); vahşi tip ATCC 17978 (Şekil 5 şerit 2), AB258 (Şekil 5 şerit 3), test edilen herhangi bir koloni (Şekil 5 şerit 5) ve şablonsuz kontrol (Şekil 5 şerit 6) amplifikasyon göstermemelidir.

İşaretlenmemiş suş onaylandıktan sonra, fonksiyonel testler fenotipik tahlillerle başlayabilir. Burada, bariz ilk seçenek, bir dizi antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) belirlemektir: siprofloksasin, AdeIJK'nin bilinen bir substratıdır, tetrasiklin AdeIJK tarafından uzaklaştırılabilir (ana akış pompası AdeAB'dir) ve kanamisin A. baumannii ATCC 17978 2,14 üzerinde nispeten küçük bir etkiye sahiptir. CLSI yönergelerine15 göre et suyu mikro seyreltme yöntemi kullanılarak, 50 μM IPTG'nin yokluğunda ve varlığında her bir antibiyotikle tamamlanmış işaretlenmemiş AB258::adeIJK suşuna meydan okundu; vahşi tip suşu ATCC 17978 ve RND akış eksikliği olan suşu AB258 kontrol olarak dahil edildi (Tablo 2). Genel olarak, MIC değerlerinde görülen eğilim, AB258::adeIJK'nin siprofloksasin ve tetrasikline duyarlılığının azalması ve akış pompasının indüklenmesi ile adeIJK'nin yerleştirilmesinin başarılı olduğunu doğrular.

Figure 1
Şekil 1: Prosedüre genel bakış. (A) Tamamlanacak A. baumannii suşunun bir gece kültürü hazırlanır. (B) Gece kültüründen elde edilen hücreler santrifüj yoluyla 3 kez su ile yıkanır ve buz üzerinde tutulur. (C) Dağıtım ve yardımcı plazmitler hücrelere eklenir ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Numune elektroporasyona tabi tutulur, LB ortamı eklenir ve hücrelerin 37 °C'de 1 saat iyileşmesine izin verilir. 100 μL'lik bir hücre alikotu LB + Gm50 agar plakalarına yayılır ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edilir. (D) Dönüşüm plakasından koloniler bir LB + Gm50 agar plakasına yamalanır ve gece boyunca 37 °C'de büyütülür. (E) Yamalı koloniler, kromozomal yerleştirme bölgesini kapsayan bir amplifikasyon ürününün varlığını taramak için PCR için hazırlanır. PCR amplifikasyonu, agaroz jel elektroforezi ile görselleştirilir. PCR pozitif numuneler, ilgilenilen genin kromozoma başarılı bir şekilde yerleştirilmesini ve belirgin bir suşun oluşturulmasını temsil eder. (F) Gentamisin için pozitif bir koloni, gentamisin kasetini kromozomal yerleştirmeden çıkarmak için pLFP2ab plazmidinin elektroporasyonu ile adımlarda (AC) olduğu gibi hazırlanır. LB + Cb200 agar üzerindeki seçici kaplama, plazmidin alımını doğrular. LB + Cb200 ve LB + Gm50 agar plakaları üzerindeki yinelenen yama, CbR ve GmS olan kolonileri ortaya çıkarır ve bu da yerleştirmeden gentamisin kasetinin kaybını doğrular. Seçilen CbR kolonilerinin %5 sükroz üzerinde büyümesi, hücrelerden pLFP2ab plazmitini iyileştirir. % 5 sükroz plakasından koloniler, istenen CbS ve GMS kolonilerini ortaya çıkarmak ve işaretsiz suşun oluşumunu doğrulamak için LB + Cb200 agar ve LB agar üzerine yamalanır. Gm50, 50 μg/mL'de gentamisin; Cb200, 200 μg/mL'de karbenisilin; R, dayanıklı; S, hassas. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Bu protokolde kullanılan plazmitler. (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (insersiyon plazmidi), (B) pTNS2 (yardımcı plazmit) ve (C) pFLP2ab (eksizyon plazmidi) genel plazmit haritaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Ekleme ve işaretleme şeması. (A) Yerleştirme. A. baumannii kromozomundaki tek Tn7 yerleştirme bölgesi, glmS2 geninin sonundan 24 bp uzakta bulunur. İnsersiyon plazmidi ve yardımcı plazmidin birlikte elektroporasyonu, ilgilenilen genin (sokulan gen, mor) insersiyon kasetinin geri kalanıyla birlikte tamamlanmasına izin verir (marker eksizyonu için FRT bölgeleri, sarı; gentamisin direnci için accC1 geni, yeşil; indüklenebilir ekspresyon için lacIq geni, mavi) kromozoma. (B) İşaretin kaldırılması. Tamamlayıcı, işaretli insersiyon suşunun pFLP2ab eksizyon plazmidi ile elektroporasyonu, gentamisin direnç geninin (accC1, yeşil) Flp-FRT rekombinasyonu (FRT bölgeleri, sarı) yoluyla çıkarılmasını kolaylaştırır ve işaretsiz bir suş oluşturur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Koloni PCR ile dönüşüm, yama ve yerleştirme onayı. (A) yamalamadan sonra transformasyon kolonilerinin büyümesinin ve (B) kromozomal insersiyonu doğrulamak için ABglmS_F_New (gri) ve Tn7R (turuncu) primerleri ile koloni PCR amplifikasyonunun temsili sonucu. Şerit 1: Düşük moleküler ağırlıklı DNA merdiveni; Şerit 2: ATCC 179798; Şerit 3: AB258; Şerit 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Şerit 5: şablonsuz kontrol. Beklenen 382 bp bandı etiketlendi. Gentamisin spesifik primerlerin (Gm_F ve Gm_R, yeşil) kromozomal insersiyonu doğrulamak için de kullanılabileceğini unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Koloni PCR ile belirteç kaybının doğrulanması. pFLPab bazlı eksizyon yoluyla antibiyotik belirtecinin kaybını doğrulamak için gentamisine özgü primerler (Gm_F ve Gm_R) ile koloni PCR amplifikasyonunun temsili sonucu. Şerit 1: düşük moleküler ağırlıklı DNA merdiveni; Şerit 2: ATCC 179798; Şerit 3: AB258; Şerit 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Şerit 5: AB258::adeIJK; Şerit 6: şablonsuz kontrol. Beklenen 525 bp bandı etiketlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Suşlar, plazmitler ve primerler İlgili özellikler Referans
Leke
A. baumannii ATCC 17978 Serisi Tip gerinim ATCC (ATCC)
A. baumannii ATCC 17978 AB258 ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK 11
Plazmid
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC GmR, AmpR 9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK GmR, AmpR, adeIJK Bu çalışma
pTNS2 AmperR 9
pFLP2ab pWH1266 orijini veya replikasyonu, sacB, AmpR 7
Astar Sıra (5′–3′)
ABglmS_F_New CACAGCATAACTGGACTGATTTC 7
Tn7R TATGGAAGAAGTTCAGGCTC 7
Gm_F TGGAGCAGCAACGATGTTAC Bu çalışma
Gm_R TGTTAGGTGGCGGTACTTGG Bu çalışma

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan bakteri suşları, plazmitler ve primerler. Gm, gentamisin; Amp, ampisilin; R, dayanıklı.

Siprofloksasin Tetrasiklin Kanamisin
IPTG (IPTG) − + − + − +
ATCC 17978 Serisi 0.250 Nd 0.500 Nd 1.5 Nd
AB258 Serisi 0.031 Nd 0.063 Nd 4 Nd
AB258::adeIJK 0.016 0.063 0.031 0.125 8 2
Katlama değişikliği 4.01 4.03 0.25

Tablo 2: Eklenen genlerin işlevselliğinin antibiyotik duyarlılığı yoluyla test edilmesi. A. baumannii ATCC 17978, AB258, indüklenmemiş AB258::adeIJK ve IPTG ile indüklenen AB258::adeIJK için minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) değerlerinin siprofloksasin, tetrasiklin ve kanamisin ile karşılaştırılması. Katlama değişimi = indüklenmiş (+ IPTG)/indüklenmemiş (− IPTG); nd = belirlenmedi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A. baumannii'de indüklenebilir tek kopyalı bir gen ekspresyon sisteminin kromozomal eklenmesi için bu prosedür teknik olarak basit ve emek yoğun olmasa da, vurgulanması gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, ortamın buz gibi soğuk su ile değiştirilmesi sırasında hücreler kırılgan hale geldiğinden, yetkin hücrelerin hazırlanması mümkün olduğunca buz üzerinde yapılmalıdır. İdeal olarak, santrifüj adımları 4 °C'de gerçekleştirilir, ancak oda sıcaklığında santrifüjleme kabul edilebilir. Suyla yıkama sırasında hücrelerin artan kırılganlığı göz önüne alındığında, nazik pipetleme de kritik öneme sahiptir. İkincisi, elektroporasyon iyonların varlığına duyarlıdır. Hücrelerin birden fazla peletleme turu ile yıkanması ve suda yeniden süspanse edilmesi, ortamın tamamen çıkarılmasını sağlar. Ayrıca, plazmitler taze olarak saflaştırılmalıdır ve plazmit DNA konsantrasyonu yeterince yüksek olduğu sürece standart kit elüsyon tamponlarında (normalde TE tamponu) ayrıştırılabilir. Numunenin iyonik kuvvetini çok düşük tutmak için 100 μL hücre süspansiyonuna <5 μL plazmit eklemeyi hedefliyoruz, ancak 10 μL'ye kadar tolere edilmelidir. Üçüncüsü, eklenen antibiyotiğin etkinliğini sağlamak için gerektiğinde seçici agar plakaları hazırlanmalıdır. Eksizyon plazmidinin dönüşümü sırasında seçim için normal ampisilin yerine karbenisilin, pFLP2ab kullanıldığına dikkat edin. A. baumannii, aminopenisilinlere (ampisilin) karşı doğal olarak dirençlidir16; Bir karboksipenisilin (karbenisilin) ikame edilmesi, plazmid kodlu β-laktamaz ile sürekli seçime izin verir.

Deneysel protokolün optimizasyonu daha inceliklidir ve farklı Acinetobacter türleri (hatta aynı tür içindeki genetik olarak manipüle edilmiş suşlar) ve muhtemelen laboratuvarda kullanılan belirli reaktifler arasında değişecektir. Örneğin, elektroporasyon için kullanılan voltaj 1,8 ile 2,5 kV arasında değişebilir ve PCR için kullanılan DNA polimeraza bağlı olarak termodöngü koşullarının biraz değiştirilmesi gerekebilir. Elektroporasyondan sonra hücrelerin zayıf bir şekilde büyüyüp büyümediğini göz önünde bulundurmak için yararlı ipuçları, agar plakalarındaki gentamisin konsantrasyonunun 50 μg/mL'den 30 μg/mL'ye düşürülmesini ve/veya agar plakalarının inkübasyon süresinin ≥24 saate uzatılmasını içerir. Gentamisin kasetini çıkarma adımlarıyla ilgili olarak, karbenisilin direnci devam ederse,% 10 sükroz içeren LB agar plakaları kullanılarak ve / veya ≥24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edilerek daha iyi başarı elde edilebilir.

Literatürde elektroporasyon ile kullanım için çok sayıda A. baumannii hücre hazırlama yöntemi bulunabilir, ancak bunlar genellikle ilk gece kültüründen sonra bir alt kültürleme aşaması ve daha sonra öngörülen bir optik yoğunluğa kadar uzun bir büyüme aşaması içerir. Basit bir gece kültürünün de aynı derecede etkili bir şekilde kullanılabileceğini gördük. A. baumannii'nin elektroporasyonu iyi tanımlanmıştır ve okuyucular buradaprotokolün bu özel yönü hakkında daha fazla bilgi edinebilirler 17,18. Bu mini-Tn7 kromozomal gen tamamlama sisteminin, plazmid bazlı bir tamamlama sistemi ile karşılaştırıldığında en önemli avantajları, IPTG ile kontrol edilebilen lacIq baskılayıcı sistemi aracılığıyla tamamlanan genin ekspresyon seviyesini düzenleme yeteneği ve gentamisin belirtecini (aacC1 geni) yan FRT siteleri. Hücrelerin akış pompalarının ekspresyonuna toleransının, takılan pompaya bağlı olarak değişebildiği gözlemlenmiştir. Örneğin, hücreler AdeABC veya AdeFGH ile karşılaştırıldığında AdeIJK ekspresyonuna daha duyarlıdır; bu, kültür koşullarında IPTG konsantrasyonunun değiştirilmesiyle ele alınabilir. Antibiyotik belirtecinin çıkarılması, sabit seçim baskısı nedeniyle suş için mutasyon riskini azaltır ve ayrıca sınırsız antibiyotik duyarlılık araştırmalarına izin verir3.

Bu mini-Tn7 sistemi Pseudomonas 9,10, Yersinia9, Burkholderia19, Xanthomonas20 ve Acinetobacter 5,6,21,22 türlerinde başarıyla kullanılmıştır, ancak bazı sınırlamalar mevcuttur. Örneğin, A. baumannii'de genom5'te yalnızca bir fonksiyonel attTn7 ekleme bölgesi vardır, bu nedenle birden fazla delesyon ile bir suş oluşturulabilir, ancak bir seferde yalnızca bir gen tamamlanabilir. Ayrıca, bu sistemin Gram-pozitif bakteriler için etkili olduğu henüz kanıtlanmamıştır10.

RND akış pompaları, A. baumannii'de antibiyotik direncinin önemli kolaylaştırıcılarıdır. Onları bu kadar güçlü yapan şey, iç ve dış zarlar boyunca uzanan ve antibiyotiklerin periplazmadan hücre dışına çıkarılmasına izin veren üç parçalı yapılarıdır. En çok çalışılan ve her yerde bulunan RND pompalarının - AdeABC, AdeFGH ve AdeIJK olarak adlandırıldığı - tüm sınıfları kapsayan antibiyotikleri ortadan kaldırdığı gösterilmiştir. Akış pompası işlevinin ayrıntılı olarak aydınlatılması, çoklu ilaca dirençli suşlara karşı yeni terapötik seçenekler tasarlamak için iyi bir başlangıç noktası sağlayacaktır. AB258 üçlü RND pompa silme geriliminin kullanılması ve her seferinde bir pompanın tamamlanması, her pompanın diğerlerinden bağımsız olarak incelenmesine olanak tanır ve her biri için benzersiz alt tabaka profillerini ve en etkili inhibitörleri ayırt eder. Tabii ki, akış pompalarının bakterinin normal işlevinde "günlük" bir rolü de vardır. Bu rollerin anlaşılması, pompaların dolaylı olarak sakatlanmasına yol açabilir ve bu da antibiyotik akışını kesebilir ve muhtemelen çok ilaca dirençli bakterileri bir kez daha yaygın olarak kullanılan antibiyotiklere duyarlı hale getirebilir. Genel olarak, mini-Tn7 sistemi, ayrıntılı çalışma veya yardımcı belirteçler için ilgilenilen herhangi bir geni, örneğin mikroskobik görüntüleme için floresan proteinleri tanıtmak için kullanılabilir6.

Çoklu ilaca dirençli bakterilerin artan prevalansı hepimiz için bir endişe kaynağıdır. A. baumannii gibi patojenlerde akış pompaları tarafından sağlanan koruyucu mekanizmaları anlamak, ciddi enfeksiyonlarla mücadele için kritik öneme sahiptir. Bu kromozomal tek kopya gen ekspresyon sistemi, mekanik çalışmalar için olduğu kadar akış pompası fonksiyonunu engellemek için inhibitörleri tanımlamak için de güçlü bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi'nden AK'ye bir Keşif Hibesi ile desteklenmiştir. Şekillerde kullanılan şemalar BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tube VWR 20170-012 For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes Sarstedt 72-690-301 General use
13-mL culture tubes, Pyrex Fisher 14-957K Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer Froggabio LD010 Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial Fisher 351271-212 Agarose gel running buffer component
Agar Bioshop AGR003 Solid growth media
Agarose BioBasic D0012 Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit Fisher 29-237-54 Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin Fisher 50841231 Selective media
Culture tube closures Fisher 13-684-138 Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set Biobasic DD0058 PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater Fisher 88860023 Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes VWR 89047-208 2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator Cole Parmer 940000009 110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide Fisher BP102-1 Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR CA-EM4050 Agarose gel running buffer component
Gentamicin Biobasic GB0217 For the preparation of selective media
Glycerol Fisher G33 Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking) New Brunswick Scientific M1352-0000 Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static) Fisher 11-690-550D Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop Sarstedt 86.1562.050 Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader Sarstedt 86.1569.005 Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox Fisher BP1427 Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge Fisher 75002431 Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge Fisher S67601B Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes SPL Life Sciences 10090 For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes  Mandel Various Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply Biorad 1645050 PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers IDT NA PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose BioBasic SB0498 For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase FroggaBio T-500 PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler Biorad 1861096 Model T100 for PCR
Toothpicks Fisher S24559 For patching colonies onto agar plates
Trizma base Sigma T1503 Agarose gel running buffer component
Ultrapure water Millipore Sigma ZLXLSD51040 MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker Biobasic M103R-2 Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks Fisher 29-801-02 Inoculating cultures with colonies from agar plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization. , Geneva, Switzerland . Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017).
  2. Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
  3. Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380 (2020).
  4. Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
  5. Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
  6. Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
  7. Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
  8. Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
  9. Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
  10. Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
  11. Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288 (2021).
  12. Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
  13. Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
  14. Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373 (2021).
  15. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , Clinical and Laboratory Standards Institute. (2021).
  16. Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
  17. Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110 (2016).
  18. Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
  19. Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
  20. Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
  21. Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).
  22. Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16 (2020).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 203
<i>Acinetobacter baumannii'de</i> Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

White, D., Kumar, A. Characterizing… More

White, D., Kumar, A. Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux-Deficient Bacterial Strain and a Single-Copy Gene Expression System. J. Vis. Exp. (203), e66471, doi:10.3791/66471 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter