电生理方法记录从果蝇幼虫NMJ突触潜力
Summary
在这里，我们描述了测量在果蝇幼虫神经肌肉接头处突触传递的电生理方法。发起人为诱发释放刺激运动神经元轴突，并通过NMJ传输，可在肌肉引起突触后反应测量。
Abstract
在这个视频中，我们描述记录果蝇幼虫神经肌肉接头处（NMJ）突触传递的电生理方法。幼虫神经肌肉系统是一个模型突触，突触生理学和神经递质的研究，是一个有价值的研究工具，已定义遗传学和实验操作。幼虫可解剖体壁肌肉，中枢神经系统，以及末梢神经暴露。果蝇的肌肉和他们的神经支配模式是很好的特点，很容易和肌肉细胞内记录访问。单独的肌肉可以识别8腹节安排在A2段重复的模式，每30肌肉内的位置和方向 – A7。解剖果蝇幼虫薄和个人肌肉的运动神经元轴突束可以透可视化<sup> 1</sup>。视觉识别或操纵基因在特定的组织产品标签的靶细胞，可用于转基因构造。幼虫，兴奋交界电位（EJPs）产生响应的运动神经元突触释放的谷氨酸水泡。在解剖幼虫，可以记录EJP，在肌肉与细胞内的电极。电机被切断后的腹侧神经节，绘制成玻璃吸管轻轻吸电极刺激神经元动作电位可以人为诱发。这些运动神经元有明显的发射时的刺激阈值，而当他们同时火，它们产生在肌肉的反应。整个NMJ突触传输的信号可以被记录在肌肉的运动神经元支配。 EJPs和微型兴奋交界电位（mEJPs）被视为膜电位的变化。在室温下的电生理反应记录修改最小的血淋巴样的解决方案<sup> 2</sup>（HL3），包含5毫米的镁<sup> 2 +</sup>和1.5 mm钙<sup> 2 +</sup>。诱发EJPs幅度的变化可以表明突触功能和结构的差异。数字化录音分析mEJP EJP幅度，频率和振幅，和量子内容。
Protocol
Discussion
这里所描述的方法提供了一个相对快速和广泛的方式来检测在NMJ突触功能的改变。执行，使用完整的动物体内电生理记录，并执行遗传或药理操作的能力，使果蝇神经递质的生理和遗传方面的调查的一个理想的动物模型。
由于肌肉细胞是非常大的的，有些人可能希望添加一个额外的步骤，为两个电极电压钳（TEVC）记录本议定书。这可以执行相同的幼虫准备在细胞内的电极，?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | Becton Dickinson | 1008 | ||
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 3097366-1004 | ||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | 475002-9902 | ||
| Light for microscope | Schott | KLI500 | ||
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| pClamp 9 software | Axon CNS, Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | ||
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | ||
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | ||
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | ||
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | ||
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | ||
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | ||
| Pipette polisher | Narishiga | MF-83 | ||
| Axon HS-2A head stage | Axon CNS, Molecular Devices | Model HS-2A | ||
| Micromanipulators | Sutter Instruments | MP-85 | ||
| Axoclamp 2B amplifier | Axon CNS, Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | ||
| Clampex Software | Axon CNS, Molecular Devices | v 8.2.0.235 | ||
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | |||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | ||
| NaCl | Baker | 4058-01 | ||
| KCl | Sigma | p-9333 | ||
| NaHCO3 | Sigma | s6297-1kg | ||
| Trelahose | Sigma | TO167 | ||
| Sucrose | Fisher | bp220-212 | ||
| HEPES | Sigma | h-3375 | ||
| MgCl-6H2O | Sigma | m2670-1kg | ||
| CaCl2 | Fisher | c79-500 | ||
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | |||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical manufacturing corporation | |||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
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- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
