Méthodes électrophysiologiques pour l'enregistrement du potentiel synaptique de la JNM des larves de drosophile
Summary
Nous décrivons ici les méthodes électrophysiologiques pour mesurer la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire de larve de drosophile. Libération évoquée est initiée artificiellement par la stimulation des axones des neurones moteurs et la transmission à travers la JNM peut être mesurée par la réponse postsynaptique évoquée dans le muscle.
Abstract
Dans cette vidéo, nous décrivons les méthodes électrophysiologiques pour l'enregistrement de la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire (JNM) de la larve de drosophile. Le système des larves neuromusculaire est une synapse modèle pour l'étude de la physiologie synaptique et la neurotransmission, et est un précieux outil de recherche qui a défini la génétique et est accessible aux manipulations expérimentales. Les larves peuvent être disséqués pour exposer le corps mur de la musculature, système nerveux central, et les nerfs périphériques. Les muscles de la drosophile et de leur modèle d'innervation sont bien caractérisés et les muscles sont faciles d'accès pour l'enregistrement intracellulaire. Muscles individuels peuvent être identifiés par leur localisation et l'orientation dans les 8 segments abdominaux, avec chacun 30 muscles agencés selon un motif qui se répète dans des segments A2 – A7. Disséqué larves de drosophile sont des muscles minces et individuels et des faisceaux d'axones des neurones moteurs peuvent être visualisés par transillumination<sup> 1</sup>. Les constructions transgéniques peuvent être utilisés pour marquer les cellules cibles pour l'identification visuelle ou pour la manipulation des produits de gènes dans des tissus spécifiques. Dans les larves, les potentiels de jonction excitateurs (EJPs) sont générés en réponse à la libération vésiculaire de glutamate par les motoneurones dans la synapse. Dans les larves disséqué, l'EJP peuvent être enregistrées dans le muscle avec une électrode intracellulaire. Les potentiels d'action peuvent être artificiellement évoqué dans les neurones moteurs qui ont été coupés postérieure au ganglion ventral, aspiré dans une pipette en verre par aspiration douce et stimulée par une électrode. Ces neurones moteurs ont distinctes seuils tirs lorsqu'ils sont stimulés, et quand ils le feu simultanément, ils génèrent une réponse dans le muscle. Les signaux transmis à travers la synapse JNM peuvent être enregistrées dans les muscles que les neurones moteurs innervant. Le EJPs et miniature potentiels de jonction excitateurs (mEJPs) sont considérés comme des changements dans le potentiel de membrane. Réponses électrophysiologiques sont enregistrés à température ambiante dans l'hémolymphe-minimal modifié comme solution de<sup> 2</sup> (HL3) qui contient 5 mg mM<sup> 2 +</sup> Et 1,5 mM de Ca<sup> 2 +</sup>. Les changements dans l'amplitude de EJPs évoqués peuvent indiquer des différences dans la fonction synaptique et la structure. Enregistrements numérisés sont analysés pour EJP amplitude, la fréquence et l'amplitude mEJP, et le contenu quantique.
Protocol
Discussion
Les méthodes décrites ici fournissent un moyen rapide et relativement large pour détecter des changements dans la fonction synaptique à la JNM. La possibilité d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sur des animaux intacts in vivo, et effectuer des manipulations génétiques ou pharmacologiques, font la drosophile un modèle animal idéal pour étudier les aspects physiologiques et génétiques de la neurotransmission.
Comme les cellules musculaires sont très grandes…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | Becton Dickinson | 1008 | ||
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 3097366-1004 | ||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | 475002-9902 | ||
| Light for microscope | Schott | KLI500 | ||
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| pClamp 9 software | Axon CNS, Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | ||
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | ||
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | ||
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | ||
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | ||
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | ||
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | ||
| Pipette polisher | Narishiga | MF-83 | ||
| Axon HS-2A head stage | Axon CNS, Molecular Devices | Model HS-2A | ||
| Micromanipulators | Sutter Instruments | MP-85 | ||
| Axoclamp 2B amplifier | Axon CNS, Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | ||
| Clampex Software | Axon CNS, Molecular Devices | v 8.2.0.235 | ||
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | |||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | ||
| NaCl | Baker | 4058-01 | ||
| KCl | Sigma | p-9333 | ||
| NaHCO3 | Sigma | s6297-1kg | ||
| Trelahose | Sigma | TO167 | ||
| Sucrose | Fisher | bp220-212 | ||
| HEPES | Sigma | h-3375 | ||
| MgCl-6H2O | Sigma | m2670-1kg | ||
| CaCl2 | Fisher | c79-500 | ||
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | |||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical manufacturing corporation | |||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
