Электрофизиологические методы регистрации синаптические потенциалы от NMJ личинок дрозофилы
Summary
Здесь мы опишем электрофизиологические методы измерения синаптической передачи в нервно-мышечном соединении личинки дрозофилы. Вызванные релиз инициируется искусственно стимулируя двигательных нейронов аксоны, и передачу по NMJ можно измерить с помощью постсинаптического ответа вызвало в мышцах.
Abstract
В этом видео мы описываем электрофизиологические методы регистрации синаптической передачи в нервно-мышечном соединении (NMJ) личинки дрозофилы. Личиночная система нервно-мышечной является модель синапсов для изучения физиологии и синаптической нейротрансмиссии, и является ценным инструментом исследований, которые определил генетики и доступна для экспериментальных манипуляций. Личинки можно разрезать, чтобы разоблачить стенки тела мускулатуре, центральной нервной системы, и периферических нервов. Мышцах дрозофилы и их иннервации картина хорошо охарактеризованы и мышцы легко доступны для внутриклеточной регистрации. Индивидуальные мышц можно определить по их расположения и ориентации в 8 брюшных сегментов, каждый из 30 мышц, расположенных в шаблон, который повторяется в сегментах A2 – A7. Расчлененный дрозофилы личинки тонкие и отдельных мышц и связок двигателя аксонов нейронов могут быть визуализированы на просвечивание<sup> 1</sup>. Трансгенные конструкции могут использоваться для маркировки клеток-мишеней для визуальной идентификации или в целях манипулирования генных продуктов в определенных тканях. У личинок, возбуждающих потенциалов перехода (EJPs) генерируются в ответ на везикулярного выброс глутамата из мотонейронов в синапсах. В расчлененный личинки, EJP могут быть записаны в мышцы с внутриклеточным электродом. Потенциалы действия может быть искусственно вызывали у моторных нейронов, которые были сокращены задней до брюшного ганглия, втягивается в стеклянной пипетки, осторожно всасывания и стимулировали электрода. Эти моторные нейроны имеют разные пороги стрельбы при стимуляции, и, когда они стреляют одновременно, они генерируют ответ в мышцах. Сигналы передаются по NMJ синапса может быть записано в мышцах, что моторные нейроны иннервирующие. EJPs и миниатюрные возбуждающих потенциалов перехода (mEJPs) рассматриваются как изменения мембранного потенциала. Электрофизиологические ответы записываются при комнатной температуре в модифицированной минимально гемолимфы подобные решения<sup> 2</sup> (HL3), который содержит 5 мМ Mg<sup> 2 +</sup> И 1,5 мМ Ca<sup> 2 +</sup>. Изменения в амплитуду вызванных EJPs может указывать на различия в синаптической функции и структура. Оцифрованные записи анализируются на EJP амплитуды, mEJP частоты и амплитуды, и квантовой содержания.
Protocol
Discussion
Методы, описанные здесь, обеспечивают относительно быстрый и широкий путь для обнаружения изменений в синаптической функции в NMJ. Способность выполнять электрофизиологические записи на основе интактных животных в естественных условиях, а также выполнять генетические или фармаколог?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | Becton Dickinson | 1008 | ||
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 3097366-1004 | ||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | 475002-9902 | ||
| Light for microscope | Schott | KLI500 | ||
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| pClamp 9 software | Axon CNS, Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | ||
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | ||
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | ||
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | ||
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | ||
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | ||
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | ||
| Pipette polisher | Narishiga | MF-83 | ||
| Axon HS-2A head stage | Axon CNS, Molecular Devices | Model HS-2A | ||
| Micromanipulators | Sutter Instruments | MP-85 | ||
| Axoclamp 2B amplifier | Axon CNS, Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | ||
| Clampex Software | Axon CNS, Molecular Devices | v 8.2.0.235 | ||
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | |||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | ||
| NaCl | Baker | 4058-01 | ||
| KCl | Sigma | p-9333 | ||
| NaHCO3 | Sigma | s6297-1kg | ||
| Trelahose | Sigma | TO167 | ||
| Sucrose | Fisher | bp220-212 | ||
| HEPES | Sigma | h-3375 | ||
| MgCl-6H2O | Sigma | m2670-1kg | ||
| CaCl2 | Fisher | c79-500 | ||
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | |||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical manufacturing corporation | |||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
